Évaluation des fonctions mitochondriales et la viabilité cellulaire dans les cellules rénales surexprimant la protéine kinase C Isozymes

Cette expérience utilise une modulation sélective de l'isoforme de la protéine kinase C afin de déterminer leurs fonctions mitochondriales et cellulaires dans les cellules tubulaires proximales rénales sous diverses conditions physiologiques et pathologiques. Tout d'abord, isoler les cellules tubulaires proximales rénales primaires à partir du cortex rénal ou des RPC possédant un métabolisme oxydatif, similaire à celui des tubules proximaux rénaux.

Infecter in vivo les cellules progénitrices rétiniennes (RPC) à l’aide de vecteurs adénoviraux exprimant des formes actives et inactives de la protéine kinase C. Ensuite, analyser différentes fonctions mitochondriales et la viabilité cellulaire afin de déterminer l’effet de l’isoforme sur la capacité mitochondriale à synthétiser l’ATP et à prévenir la mort cellulaire. Réaliser également une analyse par immunoblot des formes phosphorylées et de la protéine kinase C epsilon dans des lysats cellulaires prélevés conjointement.

Les résultats montrent que l'activation de la protéine kinase epsilon régule négativement la capacité mitochondriale à produire de l'ATP, diminue les niveaux cellulaires d'ATP et réduit la viabilité des cellules tubulaires proximales rénales. Le principal avantage de cette technique par rapport à nos techniques existantes, telles que les lignées cellulaires, est que les cultures primaires de cellules tubulaires proximales rénales conservent les fonctions différenciées et le métabolisme oxydatif des tubules proximaux rénaux. Étant donné que les protéines kinases peuvent être utilisées comme cibles et agents thérapeutiques potentiels, les implications de cette technique s'étendent à la thérapie, permettant de prévenir les lésions rénales ou d'accélérer la récupération rénale après une lésion.

Cette méthode peut éclairer les mécanismes de lésion et de récupération. Elle peut également être appliquée, par exemple, à la perfusion rénale de lapin fraîchement isolée successivement avec 50 millilitres chacun de milieu D-M-E-M-F 12 stérile, de solution saline tamponnée au phosphate stérile, pH 7,4, et de solution de PBS contenant de l'oxyde de fer, afin de recueillir le cortex de chaque rein.

Homogénéisez d'abord le tissu à l'aide d'un homogénéisateur de 15 millilitres. Puis faites passer l'homogénat à travers deux tamis stériles dans un bécher stérile d'un litre. Rincez les cellules restant sur les tamis avec un tampon contenant de la déféroxamine.

Transférez tout tissu restant au fond du tamis de 85 microns dans 40 millilitres de tampon contenant de la déféroxamine placés dans un tube conique de centrifugeuse. Mélangez doucement la suspension cellulaire avec l'aimant puissant.

Capturer les glomérules chargés de fer et aspirer le fer fixé sur l'aimant. Ajuster le volume de la suspension cellulaire à 40 millilitres et ajouter un millilitre de milieu de digestion contenant de la collagénase. Incuber à température ambiante pendant 17 minutes.

Mélanger doucement la suspension. Récolter les cellules par centrifugation à 50 ×g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius après plusieurs lavages. Resuspendre le culot cellulaire dans 46 millilitres de milieu ne contenant pas de glucose.

Ensemencez les CP primaires à une densité d'un milligramme de protéine par plat dans deux millilitres de milieu D-M-E-M-F 12 sans glucose sur un agitateur orbital à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après avoir renouvelé le milieu, procédez à l'infection des cellules PRT confluentes avec un adénovirus porteur d'ADNc codant soit pour la protéine kinase C epsilon constitutivement active, soit pour la protéine kinase C epsilon dominante négative, puis incubez pendant 24 heures. Renouvelez le milieu et cultivez les CP primaires transfectées pendant encore 24 heures. Pour visualiser la morphologie mitochondriale de la monocouche de cellules primaires, renouvelez le milieu, ajoutez le colorant MIT tracker red 580, puis remettez les plats à l'incubateur pendant 30 minutes.

Ensuite, examiner les monocouches vivantes au microscope fluorescent en utilisant un objectif à immersion dans l'eau. Objectif deux. Pour évaluer la fonction mitochondriale, analyser la respiration à l'état trois de la suspension de cellules épithéliales tubulaires rénales proximales dans une chambre de consommation d'oxygène équipée d'une électrode de type Clark.

Mesurez d'abord la respiration à l'état deux en l'absence de DP. Ajoutez ensuite un DP à une concentration finale de 0,4 millimolaire. Pour initier la respiration à l'état trois, puis la respiration à l'état quatre, ajoutez de l'oligomycine à une concentration finale de 0,5 microgramme par millilitre.

Inclure également une mesure de la respiration découplée en ajoutant 0,5 micromolaire de FCCP à des cellules respirant à l'état trois. Ajouter lentement 20 microlitres d'une solution de JC1 à 0,5 millimolaire dans chaque boîte de culture de cellules RPTC et agiter doucement pour bien mélanger le colorant. Remettre les boîtes dans l'incubateur pendant 30 minutes.

Ensuite, placez les cultures sur de la glace et effectuez deux lavages avec du PBS glacé. Puis récoltez les cellules. Transférez les cellules TPR dans un tube Eppendorf et dissociez les monocouches en une suspension de cellules individuelles à l’aide d’une pipette.

Analysez la fluorescence par cytométrie en flux en utilisant une excitation par un laser à ion argon de 488 nanomètres. Calculez ensuite le potentiel de membrane mitochondrial des mitochondries isolées. Facilitez l'évaluation de l'intégrité de la chaîne respiratoire.

Après deux lavages des monocouches de RPTC avec un tampon PBS glacé, récolter les cellules et les mettre en pellet par centrifugation. Laver le culot une fois dans un millilitre de tampon A, puis homogénéiser les cellules dans un homogénéisateur de Down jusqu'à ce que la majorité des cellules soient rompues dans l'homogénat, comme observé au microscope. Ensuite, éliminer les débris cellulaires par une centrifugation à faible vitesse.

Centrifuger les mitochondries brutes du surnageant à 15 000 × g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et effectuer trois lavages des mitochondries en pellet dans le tampon c. Resuspendre le culot mitochondrial dans 50 à 100 microlitres de tampon d'essai et congeler dans l'azote liquide pour doser l'activité de la NADH ubiquinone oxydoréductase. Ajouter 500 microlitres de tampon d'essai contenant les ajouts et les mitochondries ; inclure également un témoin sans mitochondries contenant tous les ajouts. Équilibrer la plaque à 30 degrés Celsius avec agitation pendant cinq minutes.

Ensuite, placez la plaque dans le spectrophotomètre et ajoutez 10 microlitres de 3,25 millimolaire d'ubiquinone pour démarrer la réaction dans chaque puits. Enregistrez l'absorbance à 340 nanomètres pendant trois minutes à des intervalles de 22 secondes. Dans un dosage similaire, mesurez l'activité de la cytochrome c oxydase en utilisant le cytochrome c réduit comme substrat pour la réaction de synthèse de l'ATP.

Préparer les mélanges pour doser l'activité totale des APA et l'activité des APA insensibles à l'oligomycine pour chaque groupe de traitement. Incuber les échantillons dans le mélange réactionnel à 31 degrés Celsius pendant 10 minutes. Démarrer la réaction en ajoutant un substrat TP et incuber à 31 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Transférez 200 microlitres du mélange d'incubation dans un tube contenant 50 microlitres d'acide trichloroacétique à trois molaire, précipitez les protéines sur de la glace pendant 10 minutes. Ensuite, centrifugez pour former un culot. Puis chargez une plaque de 96 puits avec 50 microlitres de chaque étalon de phosphate et 50 microlitres de chaque surnageant d'échantillon en double.

Ensuite, ajouter 250 microlitres de réactif de Sumner dans chaque puits et incuber à 30 degrés Celsius pendant 15 minutes. Puis enregistrer l'absorbance à 595 nanomètres. Laver les monocouches de RPTC deux fois avec du tampon PBS glacé.

Récupérez les cellules dans un millilitre de PBS et transférez la suspension cellulaire dans un tube einor. Faites précipiter les échantillons de RPTC par centrifugation et déterminez une teneur en TP à l’aide de la méthode de luciférase d’un kit d’essai bioluminescent de l’ATP. Pour l’analyse de la viabilité cellulaire dans des boîtes de 35 millimètres, utilisez cinq monocouches de RPTC pour trois groupes de traitement contrôle : cellules positives pour l’onose, cellules positives pour l’apoptose, et un contrôle sans coloration, répartis sur deux boîtes.

Ajoutez deux microlitres de cisplatine 50 millimolaire au deuxième ensemble. Ajoutez deux microlitres de peroxyde de tert-butyle 500 millimolaire. Après coloration des cellules à l'iodure de propidium comme indiqué dans le texte accompagnant, lavez les monocouches avec le tampon de liaison.

Ensuite, colorer les cellules en utilisant l'ANNEXINE cinq conjuguée au ZI, comme indiqué dans le protocole écrit. Puis récolter délicatement les cellules et les suspendre dans 500 microlitres de tampon de liaison. À l’aide d’un racloir en caoutchouc.

Utilisez une pipette pour disperser les cellules en une suspension monocellulaire et transférez la suspension cellulaire dans des tubes de cytométrie en flux. Dispersez les cellules en une suspension monocellulaire. Passez immédiatement à la quantification de la fluorescence pour le PI et le FE par cytométrie en flux. L'administration adénovirale de CD NA recouvrant les mutants constitutivement actifs et inactifs de la protéine kinase C epsilon entraîne une augmentation significative des niveaux protéiques de la protéine kinase C epsilon dans les cellules RPTC et dans les mitochondries.

Comme prévu, la forme constitutivement active de l'enzyme est phosphorylée dans les RP tcs, tandis que l'enzyme dominant négatif n'est pas phosphorylée. La présence de la protéine kinase C epsilon active diminue la respiration mitochondriale dans les RPTC, quel que soit le substrat utilisé pour alimenter les mitochondries. En revanche, la protéine kinase C epsilon inactive n'a aucun effet sur la respiration mitochondriale.

Curieusement, l'activation de la protéine kinase C epsilon dans les cellules tubulaires rénales proximales (RP TCS) réduit l'activité des complexes un et quatre. Cette diminution de la respiration des RP TCS est associée à une augmentation du potentiel membranaire mitochondrial. Le mutant dominant négatif n'a pas cet effet.

Ces modifications s'accompagnent également d'une diminution de l'activité d'une synthase TP dans les mitochondries isolées à partir de cellules tubulaires rénales proximales (RPTC) surexprimant la protéine kinase C epsilon active. En conséquence, la teneur en ATP des RPTC surexprimant la protéine kinase C epsilon active est réduite. L'activation soutenue de la protéine kinase C epsilon exerce des effets profonds sur la morphologie mitochondriale, comme en témoigne la fragmentation mitochondriale.

L'activation de la protéine kinase C, mais pas son inhibition, entraîne également des modifications de la morphologie des cellules tubulaires proximales rénales, provoquant un rétrécissement cellulaire et une elongation des cellules survivantes. Ces effets mitochondriaux liés à la surexpression de la protéine kinase C epsilon active dans les cellules tubulaires proximales rénales étaient également corrélés à la mort cellulaire par nécrose et par apoptose.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment surexprimer des protéines dans des cultures primaires à l'aide d'une technique utilisant un adénovirus et comment évaluer la capacité mitochondriale de synthèse de TP. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est effectuée correctement. Enfin, n'oubliez pas que le travail avec l'adénovirus présente des risques, prenez donc des précautions appropriées.