Évaluation des fonctions mitochondriales et la viabilité cellulaire dans les cellules rénales surexprimant la protéine kinase C Isozymes

Les effets de l'activation de la protéine kinase C (PKC) isozymes de la fonction mitochondriale associés à la respiration et la phosphorylation oxydative et sur la viabilité cellulaire sont décrites. L'approche technique s'adapte adénoviral de façon sélective surexprimer isoenzymes de PKC dans une culture cellulaire primaire et une variété de tests pour déterminer les fonctions mitochondriales et l'état énergétique de la cellule.

Cette expérience utilise la modulation sélective de la protéine kinase C ISO xms pour déterminer leurs fonctions mitochondriales et cellulaires dans les cellules tubulaires rénales proximales dans diverses conditions physiologiques et pathologiques. Tout d’abord, isolez les cellules tubulaires proximales rénales primaires du cortex rénal ou des RPC qui ont un métabolisme oxydatif. Ressemblant à celui des tubules proximaux rénaux.

Vivo infecte les RPC avec des vecteurs adénoviraux qui expriment des formes actives et inactives de l’ensemble des protéines. La kinase C analyse ensuite les différentes fonctions mitochondriales et la viabilité cellulaire pour déterminer l’effet de la zyme sur la capacité mitochondriale à synthétiser A TP et à prévenir la mort cellulaire. Effectuez également une analyse immuno-blot de l’epsilon phosphorylé et de la protéine kinase C epsilon dans les lysats cellulaires pris ensemble.

Les résultats montrent que l’activation de la protéine kinase epsilon régule négativement la capacité mitochondriale à générer un TP, diminue les niveaux cellulaires d’un TP et la viabilité des cellules tubulaires rénales proximales. Le principal avantage de cette technique par rapport à nos techniques existantes, telles que les lignées cellulaires, est que les cultures primaires de cellules tubulaires proximales rénales maintiennent les fonctions différenciées et oxydées de la protéine proximale rénale. Étant donné que les protéines kinases peuvent être utilisées comme cibles et agents thérapeutiques potentiels, les implications de cette technique s’étendent à la thérapie, à la prévention des lésions rénales ou à l’accélération de la récupération rénale après une blessure.

Cette méthode peut comprendre le mécanisme de blessure et de récupération. Il peut également être appliqué à des tels que le et Per rein de lapin fraîchement isolé séquentiellement avec 50 millilitres. Chacun des solutions salines tamponnées au phosphate d-M-E-M-F 12 moyennes stériles tamponnées au phosphate, pH 7,4 et PBS pour récolter le cortex de chaque rein.

Homogénéisez d’abord le tissu à l’aide d’un homogénéisateur de duvet de 15 millilitres. Passez ensuite l’homogénat à travers deux tamis à mailles stériles dans un bécher stérile d’un litre. Rincez les cellules restantes sur les tamis avec un tampon contenant de la déféroxamine.

Transférez tout tissu laissé sur le fond. Tamis de 85 microns dans 40 millilitres de tampon contenant de la déféroxamine placé dans un tube de centrifugation conique. Mélangez doucement la suspension cellulaire avec l’aimant puissant.

Capturez les glomérules remplis de fer et aspirez le fer attaché à l’aimant. Ajustez le volume de la suspension cellulaire à 40 millilitres et ajoutez un millilitre de milieu de digestion contenant de la collagénase. Incuber à température ambiante pendant 17 minutes.

Mélanger doucement la suspension. Récoltez les cellules par centrifugation à 50 fois G pendant deux minutes à quatre degrés Celsius après plusieurs lavages. Resus suspend la pastille cellulaire dans 46 millilitres de milieu ne contenant pas de graine de glucose.

Les PC RT primaires à une densité d’un milligramme de protéines par plat cultivent dans deux millilitres de milieu D-M-E-M-F 12 sans glucose sur un agitateur orbital à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après avoir réapprovisionné le milieu, procéder à l’infection des cellules RPT confluentes avec un adénovirus porteur de CD NA pour la protéine kinase constitutivement active, le C epsilon ou la protéine kinase négative dominante C epsilon incuber pendant 24 heures, reconstituer le milieu et cultiver les RPC primaires transfectés pendant 24 heures supplémentaires. Pour visualiser la morphologie mitochondriale de la monocouche de cellules primaires qui reconstitue le milieu, ajoutez MIT tracker red five 80 et remettez les plats dans l’incubateur pendant 30 minutes.

Ensuite, examinez les monocouches vivantes sous un microscope fluorescent en utilisant une immersion dans l’eau. Deuxième objectif. Pour évaluer la fonction mitochondriale, il faut évaluer l’état trois de respiration de la suspension RPTC dans une chambre de consommation d’oxygène équipée d’une électrode de type Clark.

Première mesure de l’état deux respiration en l’absence de DP. Ajoutez ensuite un DP à une concentration finale de 0,4 millimolaire. Pour initier la respiration de l’état trois pour la respiration de l’état quatre. Ajoutez de l’oligomycine à une concentration finale de 0,5 microgramme par millilitre.

Incluez également une mesure de la respiration découplée en ajoutant 0,5 FCCP micromolaire aux cellules respirant à l’état trois. Ajoutez lentement 20 microlitres de 0,5 millimolaire JC une solution dans chaque boîte de culture RPTC et remuez pour bien mélanger le colorant. Remettez la vaisselle dans l’incubateur pendant 30 minutes.

Ensuite, placez les cultures sur de la glace et effectuez deux lavages PBS à froid glacé. Récoltez ensuite les cellules. Transférez les cellules RPT dans un tube einor et décomposez les monocouches en suspension unicellulaire par pipetage.

Analysez la fluorescence par cytométrie en flux en utilisant l’excitation par un laser ionique argon de 488 nanomètres. Calculez ensuite le potentiel de la membrane mitochondriale des mitochondries isolées. Faciliter l’évaluation de l’intégrité de la chaîne respiratoire.

Après deux lavages des monocouches RPTC avec un tampon PBS glacé, récoltez les cellules et les granulés par centrifugation. Lavez la pastille une fois dans un millilitre de tampon A, puis homogénéisez les cellules dans un homogénéisateur à duvet jusqu’à ce que la plupart des cellules de l’homogénat soient brisées lors de l’inspection au microscope. Ensuite, retirez les débris cellulaires par centrifugation à basse vitesse.

Granulez les mitochondries brutes du surnageant à 15 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et effectuez trois lavages des mitochondries granulées dans le tampon c, remettez en suspension la pastille mitochondriale dans 50 à 100 microlitres du tampon de dosage et congelez dans de l’azote liquide pour doser l’activité de la NADH ubiquinone oxyde réductase. Ajoutez 500 microlitres du tampon de test avec les ajouts et les mitochondries comprennent également un échantillon vierge qui contient tous les ajouts mais pas de mitochondries. Équilibrez la plaque à 30 degrés Celsius en mélangeant pendant cinq minutes.

Ensuite, placez la plaque dans la spécification et ajoutez 10 microlitres d’ubiquinone de 3,25 millimolaires pour démarrer la réaction dans chacun. Eh bien, enregistrez l’absorbance à 340 nanomètres pendant trois minutes à intervalles de 22e. Dans un test similaire, mesurer l’activité de la cytochrome C oxydase en utilisant du cytochrome C réduit comme substrat pour la réaction A TP synthase.

Préparez des mélanges pour mesurer l’activité totale des APA et l’activité des APA insensibles aux oligomycines de chaque groupe de traitement. Incuber les échantillons dans un mélange réactionnel à 31 degrés Celsius pendant 10 minutes. Démarrez la réaction en ajoutant un substrat TP et incubez à 31 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Transférez 200 microlitres du mélange d’incubation dans un tube contenant 50 microlitres de TCA à trois molaires, précipitez les protéines sur de la glace pendant 10 minutes. Puis granulé par centrifugation. Ensuite, chargez une plaque de 96 puits avec 50 microlitres de chaque étalon de phosphate et 50 microlitres de chaque surnageant d’échantillon en double.

Ajoutez ensuite 250 microlitres de réactif Sumner dans chaque puits, incubez à 30 degrés Celsius pendant 15 minutes. Enregistrez ensuite l’absorbance à 595 nanomètres. Lavez les monocouches RPTC deux fois avec un tampon PBS glacé.

Récoltez les cellules dans un millilitre de PBS et transférez la suspension cellulaire dans un tube einor. Granulez les échantillons RPTC par centrifugation et déterminez une teneur en TP à l’aide de la méthode luciférase d’un kit de dosage de bioluminescence A TP. Pour l’analyse de la viabilité cellulaire dans des boîtes de 35 millimètres, utilisez cinq monocouches RPTC pour trois groupes de traitement de contrôle de cellules positives pour les cellules sur osis positives pour l’apoptose et un contrôle sans coloration pour deux boîtes.

Ajoutez deux microlitres de cisplatine 50 millimolaires au deuxième ensemble. Ajoutez deux microlitres d’hydroperoxyde de butyle de tourte de 500 millimolaires. Après avoir coloré les cellules à l’aide d’iodure de propidium comme détaillé dans le texte d’accompagnement, lavez les monocouches avec le tampon de liaison.

Ensuite, colorez les cellules à l’aide d’ANNEXIN cinq conjugué à ZI, comme détaillé dans le protocole texte. Ensuite, récoltez doucement les cellules et suspendez-les dans 500 microlitres de tampon de liaison. Utilisation d’un policier en caoutchouc.

À l’aide d’une pipette, dispersez les cellules en une suspension unicellulaire et transférez la suspension cellulaire dans des tubes de cytométrie en flux. Dispersez les cellules en une suspension unicellulaire. Procéder immédiatement à la quantification de la fluorescence pour PI et FE par cytométrie en flux, l’administration adénovirale de CD, NA enrobant le CONSTITUENTEMENT actif et les mutants inactifs de la protéine kinase C epsilon entraîne une augmentation significative des niveaux de protéines de la protéine kinase C epsilon dans le RPTC et dans les mitochondries.

Comme prévu, la forme constitutivement active de l’enzyme est phosphorylée dans le TCS RP et l’enzyme négative dominante n’est pas phosphorylée. La présence de la protéine kinase C epsilon active diminue la respiration mitochondriale dans le RPTC, quel que soit le substrat utilisé pour dynamiser les mitochondries. Mais la protéine kinase C epsilon inactive n’a aucun effet sur la respiration mitochondriale.

Il est intéressant de noter que l’activation de la protéine kinase C epsilon dans le TCS RP réduit l’activité des complexes une sur quatre. Cette diminution de la respiration RPTC est associée à une augmentation du potentiel de la membrane mitochondriale. Le mutant négatif dominant n’a pas un tel effet.

Ces changements s’accompagnent également d’une diminution de l’activité d’une TP synthase dans les mitochondries isolées à partir de RPTC par rapport à l’expression de la protéine kinase active C epsilon. En conséquence, la teneur en A TP de RPTC supérieure à l’expression de la protéine kinase C epsilon active est une diminution de l’activation soutenue de la protéine kinase. C epsilon a des effets profonds sur la morphologie mitochondriale, comme en témoigne la fragmentation mitochondriale.

protéine kinase C, mais pas inhibition. Entraîne également des changements dans la morphologie des RPTC, provoquant le rétrécissement cellulaire et l’allongement des cellules survivantes. Ces effets mitochondriaux de la surexpression de la protéine kinase C epsilon active dans les bacs réutilisables étaient également corrélés avec la mort cellulaire par ons et par apoptose.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de surexprimer les protéines dans les cultures primaires à l’aide de la technique adénovirale et comment évaluer la capacité mitochondriale pour une synthèse de TP. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est exécutée correctement. Et déficient, n’oubliez pas que travailler avec l’adénovirus y accéder, alors prenez des précautions appropriées.