L'analyse de la fonction des gènes et visualisation de Cilia généré par l'écoulement des fluides dans des vésicules de Kupffer

Le but de cette procédure est de moduler les gènes de fonction dans la vésicule de Kavas ou le KV dans l’embryon de poisson-zèbre qui est responsable de la structuration gauche-droite et d’analyser l’écoulement de fluide asymétrique généré par le motil clia en délivrant des billes fluorescentes dans le kv. Ceci est accompli en injectant d’abord des oligonucléotides de forme fluorescente qui répriment l’expression d’un gène d’intérêt spécifique dans la cellule vitelline d’un embryon au stade Dilla moyen, de sorte qu’ils se chargent dans les cellules précurseurs dorsales qui donnent naissance au kv. Ensuite, les embryons injectés qui ont des morphos fluorescents uniquement dans la cellule vitelline et le kv sont sélectionnés pour une analyse plus approfondie.

Ensuite, les embryons sont montés dans des lames de dépression et des billes fluorescentes sont injectées dans la lumière vésiculaire remplie de liquide du kv. Enfin, la vidéomicroscopie est utilisée pour enregistrer les billes s’écoulant à l’intérieur du kv. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui déterminent si l’appauvrissement spécifique du tissu d’un gène candidat dans le KV modifie l’écoulement de fluide asymétrique grâce à l’analyse quantitative des mouvements des billes.

La démonstration virale de ce semestre est essentielle car les injections de molino spécifiques au stade et les injections de billes de fluorescence sont difficiles à apprendre car les deux dépendent de la proposition de l’embryon et du moment du développement de l’expérience. Pour effectuer des injections globales de morphing ou de MO, prélevez les embryons immédiatement après la fécondation et chargez-les dans une plaque d’injection. À l’aide d’un feu poli devant notre pipette, placez les embryons dans la plaque d’injection pour immobiliser les embryons.

Cassez la pointe d’une aiguille d’injection et ajustez les paramètres d’injection pour créer une goutte d’injection d’un volume d’un nanolitre. À l’aide d’un microscope à dissection, injectez un nanolitre de MO dans le joug d’au moins 50 embryons entre le stade d’une et de quatre cellules. Pour l’injection ciblée DFC Mmo, prélever les embryons immédiatement après la fécondation et incuber à 28,5 degrés Celsius.

Lorsque les embryons atteignent le stade de 256 cellules, chargez-les rapidement dans une plaque d’injection et injectez un nanolitre de MO fluorescent dans le jaune. Injectez au moins 100 embryons entre les stades 256 et 1000 cellulaires pour effectuer une injection ciblée sur le vitellus. Après avoir incubé les œufs fécondés jusqu’au stade de dôme, injectez un nanolitre de MO fluorescent dans l’empiècement d’au moins 100 embryons entre le dôme et 30 % sont des stades de pli.

Lorsque M mo injecté, les embryons atteignent 75 % du stade de la couche. Retirez les embryons non fécondés et morts sous un microscope de dissection pour des injections globales de MO. Choisissez des embryons vivants pour une fluorescence uniformément répartie dans toutes les cellules.

Pour les injections ciblées de DFC, sélectionnez des embryons avec une fluorescence diffusée dans tout le jaune et concentrée sur la marge dorsale du derme. Pour les injections ciblées de MO du jaune. Choisissez des embryons dans lesquels la fluorescence est uniformément répartie dans tout le jaune et n’est observée dans aucune cellule embryonnaire entre deux et quatre.

Donc les étapes des acariens. Sélectionnez les embryons ciblés par DFC qui présentent une fluorescence uniquement dans les cellules KV et le vitellus et jetez le reste pour des injections ciblées sur le vitellus. Sélectionnez des embryons avec une fluorescence exclusivement dans le jaune pour analyser le flux asymétrique dans le KV des embryons injectés de MO Commencez par utiliser des pinces tranchantes pour enrober soigneusement environ 20 embryons entre les quatre et six.

De même, les étapes peuvent transférer un embryon sur une lame de dépression en verre et retirer autant d’eau que possible. Immobilisez l’embryon en ajoutant suffisamment d’aéro chaud à faible point de fusion de 1 % pour le couvrir pendant que l’aéro se solidifie. Utilisez des pinces pour le positionner de manière à ce que le KV soit orienté vers le haut, montez 10 embryons en travaillant rapidement pour vous assurer que toutes les injections sont terminées par les 10.

Donc stade des acariens. Après dilution de microbilles fluorescentes de 0,5 micron de diamètre à une à 50 dans de l’eau stérile. Mélangez soigneusement les billes et chargez trois microlitres dans une aiguille capillaire à l’aide du même micro-injecteur que celui utilisé pour les injections de MO.

Utilisez une pince pour casser la pointe de l’aiguille et ajustez les paramètres d’injection pour générer l’injection la plus petite possible. Goutte. Ensuite, sous un microscope de dissection, alignez l’aiguille avec la lumière KV du premier embryon monté. Insérez ensuite l’aiguille dans la lumière et injectez moins de 0,5 nanolitre de billes.

Ajoutez une goutte d’eau stérile sur l’aros pour éviter que l’embryon ne se dessèche sous un microscope fluorescent vertical. À l’aide d’un criblage objectif 20x, les embryons injectés pour une livraison réussie de billes pour chaque embryon sélectionné avec des billes à l’intérieur du KV à une goutte d’eau stérile pour couvrir les aros. Observez ensuite à l’aide d’un microscope composé fluorescent avec un objectif d’immersion dans l’eau 63x.

À l’aide d’une caméra haute vitesse montée sur le microscope, enregistrez un film de dix secondes. Utilisez le canal fluorescent pour enregistrer les perles à environ 70 images par seconde et le fond clair ou le contraste interférentiel différentiel pour enregistrer le lumen KV. Importez les films dans Image J.Créez un maximum de projections et utilisez le logiciel pour suivre les mouvements des différentes perles.

Cette figure montre la distribution de MO fluorescente dans les embryons injectés vivants spécifiques au stade de réussite. Une injection infructueuse de MO dans laquelle la solution reste agrégée dans la cellule vitelline est illustrée ici. L’écoulement du fluide dans les embryons injectés avec succès peut être mesuré qualitativement ou quantitativement dans un embryon témoin avec des billes d’écoulement normal.

Suivez des trajectoires dans le sens inverse des aiguilles d’une montre qui peuvent être visualisées en faisant une projection maximale des positions des billes fluorescentes au fil du temps ou en suivant les billes individuelles au fil du temps. Pour démontrer la perte de flux coordonné, les embryons ont été injectés avec MO pour décomposer la kinase de rangée deux B ou rocher deux B, ce qui perturbe l’écoulement, et par conséquent, les billes se déplacent aléatoirement en kv, la vitesse moyenne de cinq billes de contrôle et de balancer deux embryons B mo est montrée ici Après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du développement pour explorer les gènes et les mécanismes permettant d’établir l’accès gauche droit au corps du poisson zèbre.