Analyse quantitative de l'autophagie en utilisant avancée Fluorescence Microscopy 3D

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir des images quantitatives des cellules tumorales de la prostate traitées afin de mesurer le degré et l’étendue de l’autophagie à différents points temporels. Ceci est accompli en traitant d’abord les cellules avec de l’arginine, de la dase ou d’autres réactifs expérimentaux pour induire l’autophagie et/ou la mort cellulaire. La deuxième étape consiste à décider s’il faut imager des cellules vivantes ou des cellules fixes et à préparer les échantillons en conséquence.

Ensuite, obtenez des images de fluorescence 3D de cellules vivantes ou fixes à l’aide de la microscopie à fluorescence à large champ, à déconvolution ou à éclairage structuré. La dernière étape consiste à collecter des données statistiques sur la distribution de la taille des autophagosomes et la colocalisation avec d’autres structures intracellulaires. À l’aide d’un logiciel d’analyse d’images numériques 3D, cette approche permet d’obtenir des résultats qui montrent que non seulement l’induction automatique de phages par l’arginine dase peut provoquer la mort des cellules tumorales de la prostate, mais aussi que ces cellules présentent des changements structurels morphologiquement distincts des changements associés à l’apoptose et à la nécrose.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres méthodes actuellement existantes est que l’imagerie 3D quantitative peut montrer quand et où un événement moléculaire spécifique se produit à l’intérieur d’une cellule vivante, puis le présenter dans un format tridimensionnel Pour commencer à cultiver des cellules cancéreuses de la prostate humaine exprimant une protéine fluorescente verte, une chaîne lumineuse couplée à trois sur des boîtes de culture à fond de verre revêtues de poly de lycine de 35 millimètres, comme décrit dans le protocole de texte, les cellules doivent être plaquées à une densité suffisante pour faciliter une prolifération rapide, mais pas au point que les cellules soient envahies par la végétation et agglutinées au moment de l’imagerie. Traitez des échantillons cellulaires sélectionnés avec de l’arginine dase ou un DI dans le PBS pour épuiser les cellules d’arginine libre et induire un stress métabolique dans les cellules cancéreuses environ une heure avant l’imagerie, diluez 1,5 microlitre de Lyo tracker red avec 20 millilitres de RPMI contenant 10 % FPS et 1 % d’antibiotiques. Préparez des solutions avec un DI pour les échantillons sélectionnés qui ont été traités après avoir chauffé tous les milieux à 37 degrés Celsius.

Injectez des cellules avec du RPMI contenant LYO Tracker rouge pendant 15 à 45 minutes à 37 degrés Celsius, environ 30 minutes avant l’imagerie. Allumez l’enceinte environnementale de la station météo et laissez l’équilibre à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone laver les cellules avec du PBS et remplacez le média par du RPMI standard contenant seulement 10 % de FBS et 1 % d’antibiotiques. Ajouter un DI aux échantillons comme indiqué.

Montez des boîtes de culture à fond en verre de 35 millimètres dans un adaptateur personnalisé. Utilisez de l’huile d’immersion sur l’objectif à six grossissement DX et à ouverture numérique de 1,42 et positionnez la boîte de culture montée sur la platine du microscope. Dans cette vidéo, la microscopie 3D est démontrée à l’aide de la position appliquée IDV personnelle de Delta vision, du microscope à déconvolution et de la suite d’applications Associated Soft Works.

Pour commencer, allumez le système de microscope, y compris le poste de travail d’acquisition et le contrôleur de l’instrument. Ouvrez l’application de contrôle de l’ordinateur resolve 3D pour initialiser la platine du microscope et allumer la source lumineuse au xénon. Attendez 10 minutes pour que la source lumineuse se réchauffe et atteigne des conditions stables.

Ajoutez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif à six grossissement DX, ouverture numérique de 1,42 et centrez l’échantillon de diapositive avec la lamelle vers le bas sur l’objectif en utilisant un éclairage en fond clair ou externe ainsi que la mise au point grossière. Ajustez le bouton et soulevez lentement l’objectif jusqu’à ce que le battement de l’huile d’immersion entre en contact avec la vitre de protection inversée. À partir de ce point, la couche cellulaire devrait devenir nette en quelques tours du bouton de réglage de la mise au point fine.

Lorsque vous travaillez avec des échantillons fixes sur les lames, il est recommandé d’éviter les cellules à l’intérieur ou à proximité des zones contenant des bulles. Lors de l’observation avec des échantillons vivants sur la parabole à fond en verre, évitez de déplacer la lentille de l’objectif à l’extérieur de la limite de la lamelle de protection en verre. Sélectionnez le champ de vision souhaité.

Idéalement, les cellules devraient présenter un bon signal fluorescent dans tous les canaux appropriés et être suffisamment attachées et étalées sur la surface de la lamelle pour que le contenu intracellulaire soit facile à visualiser. De petits ajustements de la mise au point latérale X, Y et Z peuvent être contrôlés par l’ordinateur à l’aide de l’interface d’acquisition 3D. Réglez benning sur un par un ou deux par deux en fonction du champ de vision souhaité pour une image donnée à travers la section médiane d’une cellule, réglez les paramètres d’exposition de manière à ce que l’intensité maximale des pixels ne dépasse pas 3000 points.

En règle générale, le pourcentage de transmission doit être réglé aussi bas que possible sans augmenter l’exposition correspondante. Temps supérieur à une seconde. Répétez cette procédure pour chaque couleur de fluorescence à imager et pour chaque champ de vision distinct.

Pour obtenir des images de la plus haute qualité, réglez les limites supérieure et inférieure du Zack en ajustant légèrement la mise au point sur le haut et le bas de l’échantillon de cellule respectivement. Le nombre total d’images dans une pile Z donnée sera donc déterminé par ces limites et par l’espacement entre les couches. Pour minimiser les artefacts de mouvement lors de l’acquisition d’image, le mode d’acquisition d’image peut être réglé sur la longueur d’onde.

Puis pile ZS pour les échantillons fixes et pile ZS puis longueur d’onde pour les échantillons en direct. Une fois tous les paramètres définis, les images de fluorescence peuvent être acquises. Les images de fluorescence sont ensuite décentralisées à l’aide de travaux doux, puis analysées à l’aide de la vitesse.

La séquence d’images présentée ici montre les changements physiques qui se produisent dans les cellules cwr 22 au cours des 80 premières minutes de l’induction de l’autophagie. Sur ces images, la ligne pointillée blanche représente le contour de la cellule et la région légèrement ombragée représente la position du noyau. Pendant 80 minutes, les images révèlent le déplacement du noyau loin du centre de la cellule, la réduction des points d’adhésion focaux et la translocation générale des autosomes et des lysosomes vers le centre de la cellule, affichés ici en vert et en rouge respectivement à des moments ultérieurs.

Une petite augmentation de la colocalisation a également été observée entre les autosomes et les lysosomes, comme l’indique la couleur jaune. La suite d’applications d’imagerie numérique velocity a ensuite été utilisée pour identifier, compter et collecter des données statistiques sur les autosomes et lysosomes marqués dans les images des cellules CWR 22. Montré ici, le nombre et la taille des autosomes après leur formation initiale à l’apparition varient avec le temps.

Après 80 minutes d’induction de l’autophagie, il y a eu une diminution nette progressive du nombre d’autosomes avec une augmentation correspondante de la taille moyenne des autosomes. De plus, il y a eu une augmentation mesurable de la colocalisation des autosomes et des lysosomes sur la base de l’analyse des coefficients de corrélation de Pearson. Ensemble, ces résultats suggèrent que lors de la stimulation de l’autophagie, de nombreux petits autosomes se sont transformés en autosomes plus grands au fil du temps.

Voici une comparaison côte à côte d’images acquises et reconstruites en mode DV, déconvolution à grand champ simulée par rapport au mode d’éclairage structuré. En utilisant le microscope OMX, la résolution latérale a été améliorée jusqu’à 120 nanomètres, soit deux fois la résolution de la microscopie conventionnelle à diffraction limitée. La colocalisation à petite échelle des autosomes et des lysosomes était clairement apparente avec la microscopie à super résolution, alors qu’elle était à peine évidente avec l’imagerie de fluorescence conventionnelle.

L’un des avantages de l’utilisation de la microscopie à déconvolution est de reconstruire toutes les images dans un modèle 3D qui révélera des informations spatiales plus précises entre différentes molécules. Voici une image globale d’une cellule Cwr 22 RV subissant une autophagie à un moment ultérieur où une quantité significative de colocalisation entre les autosomes et les lysosomes commence à se produire. La coloration cohérente indiquée en couleur blanche, révèle le contour de la cellule cible dans ce film.

Le modèle reconstruit en 3D fournit plus de détails spatiaux sur la fusion entre les autosomes et les lysosomes. Comme indiqué en jaune, l’interaction entre les signaux de la chaîne lumineuse verte trois et les signaux de lysosome rouge est évidente en présence des signaux fusionnés pour produire du jaune. Cette approche permettra donc de relever deux défis majeurs pour les chercheurs qui étudient l’autophagie.

Tout d’abord, nous voulons maintenir un environnement sans stress en utilisant le micro fluide, la chambre de profusion pour maintenir son état physiologique d’origine sur les platines du microscope. Le deuxième défi consiste à collecter des données d’image quantitatives statistiquement pertinentes et, pour les cellules fixes, nous prenons généralement beaucoup d’images de différentes cellules et les compilons en informations utiles. Cependant, avec la cellule de vie, nous ne suivons qu’une seule cellule au fil du temps pour acquérir des informations équivalentes.

Nous pensons donc que cette technique permettra à d’autres chercheurs d’étudier la fonction et le rôle de l’autophagie dans différents organes et différentes maladies.