Quantifier glomérulaire perméabilité des macromolécules fluorescentes en microscopie 2 photons à Munich chez le rat Wistar

L’objectif global de cette procédure est de visualiser avec succès l’unité de filtration du néphron et de quantifier la filtration des macromolécules fluorescentes à travers la barrière de filtration dans l’espace urinaire in vivo. Pour ce faire, il faut d’abord préparer la platine du microscope pour l’animal vivant. Ensuite, le rein est exposé et le rat est placé sur la scène.

Ensuite, les glomérules individuels sont identifiés et cartographiés et des images 3D d’arrière-plan sont acquises. Enfin, de l’albumine fluorescente est infusée. Les volumes 3D des glomérules individuels sont acquis et la perméabilité est quantifiée.

En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent le coefficient de filtration des macromolécules à travers les glomérules du rein grâce à l’utilisation de la microscopie à deux photons intra-flacon. Le principal avantage de la microscopie à deux photons est qu’elle permet de quantifier simultanément la filtration glomérulaire et la réabsorption tubulaire proximale et la transcytose chez l’animal. Dans le même temps, les implications de la technique s’étendent au-delà de la mécanisme pour atteindre le diagnostic et la thérapeutique, car il est important de comprendre à la fois le rôle de la filtration glomérulaire et du tube proximal.

La réabsorption de l’albumine est essentielle pour déterminer le ciblage du traitement. Après avoir anesthésié le rat, insérez une ligne d’accès veineuse à demeure à travers la veine jugulaire ou fémorale et rasez le flanc gauche juste en dessous de la cage thoracique jusqu’au-dessus de la cuisse gauche. Il s’agit d’une chirurgie de non-survie.

Placez le rat à plat sur son côté droit de sorte que le côté rasé gauche soit tourné vers le haut. Assurez-vous qu’il est à plat sur le banc, avec sa posture allongée et non accroupie, les pattes avant se touchant et les pattes arrière se touchant très doucement. Palpez pour sentir le rein afin de déterminer où il se trouve naturellement dans le rétropéritoine, et utilisez un sharpie pour tracer une ligne droite parallèle au corps avec une paire de pinces à dents.

Ramassez la peau et utilisez une paire d’hémostats pour pincer la peau le long de la ligne dessinée afin d’écraser le tissu et d’éviter les saignements à l’aide d’une paire de ciseaux chirurgicaux. Coupez le long de l’incision. Utilisez la même procédure pour couper la couche musculaire externe, qui est mince au besoin.

Utilisez des hémostatiques pour prévenir les saignements de l’incision dans la couche musculaire interne, ce qui exposera le péritoine. Repalper le rein pour estimer la taille. Pincez une ligne d’incision plus petite que le rein pour vous assurer que l’incision est juste au-dessus du rein.

Il est préférable de rendre cette incision trop petite et de l’agrandir si nécessaire. Localisez le rein et utilisez une pince pour saisir la graisse environnante en travaillant vers le pôle inférieur du rein de manière main sur main. Une fois que le pôle inférieur du rein est atteint, tirez doucement le rein à travers l’incision tout en le pressant très doucement sous le rein pour l’extérioriser.

Si l’incision est trop petite, écrasez la couche musculaire et coupez-la pour l’élargir. Répétez la procédure d’extériorisation du rein après avoir extériorisé le rein du rat et placé le rat sur la platine du microscope pour l’imagerie. Si votre microscope est équipé d’une platine motorisée capable de marquer des emplacements, à l’aide d’une tige de fluorescéine à double passe, d’un filtre de dominance et d’un objectif de faible puissance, trouvez et centrez les glomérules individuels, qui apparaîtront comme des structures circulaires vides entourées de tubules proximaux.

Avoir une autofluorescence jaune orange inhérente marque chaque emplacement, basculez la tourelle sur un objectif d’immersion dans l’eau de plus grande puissance et prenez des ensembles de données 3D de chaque glomérules. S’assurer que les boucles capillaires et l’espace Bowman sont clairement visibles. L’utilisation d’une pseudo palette de couleurs aidera à visualiser ces structures.

Ensuite, en se concentrant sur un vaisseau sanguin superficiel infuser lentement de l’albumine fluorescente, en s’assurant que le temps est donné pour permettre une distribution systémique pour les molécules à faible coefficient de cing glomérulaire ou GSC, il est essentiel de maximiser les valeurs d’intensité dans le plasma, mais de ne pas atteindre des niveaux qui satureront les photodétecteurs au microscope. Après avoir attendu environ 10 minutes pour permettre à tout fragment potentiel de petit poids moléculaire de s’échapper, acquérez des volumes 3D à des intervalles d’un micron à utiliser pour calculer l’albumine à l’aide d’un logiciel de traitement d’images métamorphes. Chargez les ensembles de données 3D avec les images d’arrière-plan de chaque glomérules du volume contenant l’albumine fluorescente.

Localisez une boucle capillaire superficielle avec suffisamment d’espace vide entre ses marges définies et le bord de la capsule de Bowman. Dans le volume d’arrière-plan. Localisez le même plan focal, qui doit contenir tous les repères visuels de l’image contenant de l’albumine.

Sélectionnez une région dans la boucle capillaire d’intérêt et notez la lecture de l’intensité moyenne. Ensuite, sélectionnez une région dans l’espace de Bowman et notez la lecture de l’intensité moyenne. Celles-ci seront utilisées comme valeurs de fond pour la quantification.

Sélectionnez la région similaire dans l’espace Bowman dans l’image contenant de l’albumine. Faites-le pour au moins deux autres régions afin d’obtenir une valeur pour l’intensité moyenne dans l’espace de Bowman. Sélectionnez la boucle capillaire avec l’intensité de plasma la plus brillante et dessinez une région autour d’elle.

Ensuite, à l’aide de la fonction de seuil, mettez en évidence les valeurs lumineuses dans le plasma circulant, en évitant les traînées sombres qui sont les globules rouges en circulation. Notez les valeurs d’intensité moyennes de l’espace plasma sélectionné. Il est important de sélectionner de préférence les zones lumineuses du plasma, car les facteurs sanguins ne serviront qu’à sous-estimer les niveaux de fluorescence plasmatique.

Entrez les valeurs dans une feuille de calcul Excel pour calculer la GSC où GSC est égale à la différence de l’espace brut de l’archer. Intensité moins l’intensité de l’espace de Bowman divisée par la différence entre l’intensité brute de la boucle capillaire moins l’intensité de la boucle capillaire de fond. L’absorption de l’albumine fluorescente filtrée se produit principalement dans le segment précoce des tubules proximaux.

Le S, ce panneau montre une coupe transversale d’un glomérule et d’un segment S un prélevés sur un rat prompteur Wistar de Munich, environ 20 minutes après la perfusion d’un bolus initial de RSA rouge Texas. L’ouverture de l’espace Bowman et l’adoption avide de l’albumine en rouge sont montrées dans le segment S un. Ce panneau montre une projection 3D peu profonde de 20 microns du même ensemble de données, et une projection de puissance plus faible prise environ 60 minutes après la perfusion.

Ces images démontrent que la microscopie intra-vitale peut permettre de visualiser le devenir de la matière infusée après filtration, corroborant dans une certaine mesure, le coefficient de filtration observé montré ici sont des images prises du glomérule de surface. Ce panneau est une image d’arrière-plan et cette image a été prise environ 12 minutes après la perfusion d’albumine sérique de rat rouge du Texas. Ces deux panneaux sont dessinés en pseudo couleur.

Trois petites régions d’intérêt dessinées dans l’espace de Bowman sont utilisées pour calculer l’intensité moyenne de l’albumine fluorescente qui s’est déplacée à travers la barrière de filtration. Les valeurs d’intensité moyennes pour les différentes régions ont été signalées dans la zone en surbrillance de la boîte de dialogue Afficher les statistiques de la région. La valeur GSC de 0,0111 pour l’albumine dérivée de ce glomérule individuel se situe dans la plage de cette souche de rats étoiles de Munich lorsqu’ils sont nourris.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’analyse quantitative et qualitative peuvent être effectuées sur d’autres structures rénales pour répondre à des questions supplémentaires telles que le trafic éventuel de la macromolécule après filtration dans l’espace urinaire après son développement. Cette technique a permis aux chercheurs en physiologie rénale d’explorer les processus physiologiques et pathologiques dynamiques, non pas une seule fois, mais longitudinalement. Au fil du temps, c’était le cas.