Mesure intracellulaire de Ca ^{2 +} Les changements dans le sperme humain à l'aide de quatre techniques: FLUOROMETRIE conventionnel, s'est arrêté Fluorimétrie du flux, la cytométrie en flux et l'imagerie cellulaire unique

L’objectif global de cette procédure est de mesurer les fluctuations intracellulaires du calcium dans les spermatozoïdes humains à l’aide de colorants fluorescents. Ceci est accompli en préparant d’abord l’échantillon de sperme par la méthode de nage vers le haut et, si nécessaire, en favorisant la capacitation. La deuxième étape consiste à charger le sperme avec un colorant fluorescent de calcium.

Ensuite, à l’aide de la fluorométrie conventionnelle, de la fluorométrie en flux arrêté, de la cytométrie en flux ou de l’imagerie unicellulaire, effectuez l’expérience et enregistrez les mesures de calcium. En fin de compte, les résultats sont analysés pour déterminer les changements dans les concentrations de calcium intracellulaire déclenchées par la progestérone ou pendant le processus de capacitation. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme celles impliquant la radioactivité est qu’il s’agit d’une procédure très sensible.

Il est sûr et facile à réaliser. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation calcique SPR, telles que l’identification des composés qui induisent le calcium intracellulaire, augmente avec une résolution spatiale et temporelle élevée et l’identification de différentes sous-populations cellulaires dans un échantillon de siemen. Les implications de l’utilisation, par exemple, de la technique de cytométrie en flux s’étendent au diagnostic des problèmes de fertilité par l’analyse de l’état physiologique des gamets masculins.

Même si cette méthode peut fournir des informations dans l’étude de la mobilisation du calcium des spermatozoïdes humains, elle peut également être appliquée à d’autres types de cellules telles que les gammes masculines d’autres espèces ou différents types de cellules telles que les neurones ou les cellules musculaires. En général, les personnes qui utilisent cette méthode auront du mal car la manipulation des spermatozoïdes n’est pas facile et il est important de maintenir des conditions appropriées pour obtenir des cellules viables et motrices grâce à l’expérience. Nous avons mis en œuvre l’utilisation de ces techniques en combinant des stratégies utilisant différents domaines.

La démonstration visuelle de cette méthode est importante car la préparation et la manipulation de l’échantillon, ainsi que l’ajout des composés, sont difficiles à apprendre car les spermatozoïdes peuvent être endommagés pendant la procédure et des artefacts dans les réponses peuvent être obtenus lors de l’édition des composés. Pour préparer l’échantillon de sperme, un millilitre de jambon F 10 doit être soigneusement superposé à chaque 500 microlitres de sperme liquéfié. Eloqua, touchez la paroi du tube avec l’extrémité de la micro-pipette et distribuez doucement le milieu au-dessus de l’échantillon.

Il est crucial de le faire lentement pour éviter de mélanger l’échantillon et les couches moyennes. Le milieu est complété par deux millimolaires de chlorure de calcium et cinq milligrammes par millilitre de BSA. Pour favoriser la capacitation in vitro, inclinez soigneusement les tubes à un angle d’environ 30 degrés.

Cela augmentera la surface entre les deux liquides, améliorant ainsi le déplacement ou la remontée des spermatozoïdes de l’échantillon vers le milieu pendant l’incubation. Ensuite, placez les tubes à essai maigres à l’intérieur d’un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. 95 %air pendant une heure après une heure.

À l’aide d’une micro-pipette, retirez soigneusement de chaque tube les 700 microlitres supérieurs du milieu F 10 qui contient maintenant des spermatozoïdes mobiles. Regroupez tous les échantillons collectés dans un seul tube en verre propre, en évitant la formation de bulles. Placez 10 microlitres d’échantillon groupé sur le verre plat optique de la base d’une chambre de comptage maculaire et placez le verre de couverture.

Assurez-vous d’éviter la formation de bulles à l’intérieur de la chambre, car cela entraînerait un comptage inexact des cellules. Observez sous un microscope composé équipé d’un objectif 20x. Le verre de couverture de la chambre de comptage maculaire a un grand carré composé de 100 carrés plus petits.

Comptez les cellules dans n’importe quelle bande de 10 carrés. Ce nombre représente la concentration cellulaire en millions de cellules par millilitre. Répétez le comptage sur deux bandes supplémentaires de 10 carrés et calculez la moyenne des trois comptages pour charger les cellules avec un colorant fluorescent.

Combinez dans un tube fuge de 1,5 millilitre, le volume requis de suspension de spermatozoïdes avec suffisamment d’une solution mère de grippe millimolaire oh 3:00 AM pour obtenir une concentration finale de deux micromolaires de grippe oh 3:00 AM incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius et à l’abri de la légère centrifuger le tube à 750 G pendant cinq minutes. La formation d’un nuage plutôt que d’une pastille indique que les cellules sont en bon état, aspirent et jettent le surnageant et remettent la pastille en suspension dans le volume approprié de spermatozoïde humain ou HSM. Pour commencer cette expérience, combinez dans un tube de verre à fond plat, 570 microlitres de HSM et 30 microlitres de suspension de cellules de spermatozoïdes préalablement chargées de grippe oh 3h00 du matin et remises en suspension dans HSM pour obtenir une fois 10 à la huitième cellules par millilitre.

Placez une barre d’agitation magnétique à l’intérieur du tube en verre et insérez le tube dans la chambre de lecture du spectomètre préchauffé à 37 degrés Celsius. L’échantillon doit être agité tout au long de la période d’acquisition. Démarrez l’expérience à l’aide du logiciel oli et procédez à l’acquisition des valeurs de fluorescence à une fréquence de 0,5 hertz pendant 300 secondes.

Après avoir acquis la fluorescence basale pendant 30 secondes, utilisez une seringue Hamilton Micro pour injecter le volume approprié de composé d’essai, dans ce cas-ci pour la progestérone micromolaire à 100 secondes. À 20 micromolaires, la mycine en tant que contrôle positif pour obtenir la valeur de fluorescence maximale. Dans cette expérience, les changements intracellulaires du calcium sont mesurés avec une résolution temporelle élevée.

À l’aide d’un mélangeur à flux arrêté SFM 20 couplé à un système optique cinétique enragé, remplissez l’une des seringues de l’instrument avec un millilitre de cellules de spermatozoïdes chargées à 3h00 et la deuxième seringue avec un millilitre du composé à tester. 20 micromolaires de progestérone dissoute dans HSM.

Dans cet exemple, il est crucial d’éviter la formation de bulles lors de l’aspiration des liquides dans les seringues. Soulevez les deux pistons de l’instrument jusqu’à ce qu’ils touchent l’extrémité des pistons de la seringue. Réglez le temps total d’échantillonnage dans ce cas sur 50 secondes et la fréquence sur 10 millisecondes afin de minimiser les dommages aux cellules, réglez le débit sur la valeur minimale qui fournira un déclencheur de réponse mesurable.

Le mélange des réactifs, la trace de fluorescence brute par rapport au thym seront affichés sur l’écran de l’ordinateur. Répétez cette procédure en remplaçant la progestérone par du HSM comme contrôle négatif et de la mycine à 10 ions micromolaires comme contrôle positif avant la cytométrie en flux. Préparez les échantillons expérimentaux en plaçant 500 microlitres de suspension cellulaire par tube cytométrique dans chaque condition à tester.

Configurez une expérience à l’aide du logiciel de l’équipement. Tout d’abord, créez un nouveau dossier, un spécimen d’expérience et un nombre de tubes. Sélectionnez ensuite les paramètres de cytomètre appropriés pour la grippe O 3h00. Utilisez les filtres à fluorescéine, isothiocyanate et iodure de propidium.

Faites passer les tubes de contrôle un et deux non colorés dans le cytomètre. Collectez des données de diffusion directe et latérale pour vérifier que les paramètres de seuil sont appropriés et pour créer la porte correspondante afin de distinguer les débris des cellules. Faites fonctionner les tubes expérimentaux et collectez des données de fluorescence à partir de 10 000 événements par échantillon.

À la fin. Exportez toutes les données vers le logiciel disponible pour l’analyse. Préparez les lamelles rondes nécessaires à cette procédure en appliquant une goutte de cinq microlitres de solution de lysine poly L au centre de chaque lamelle.

Laisser agir au moins une heure avant l’utilisation rincer la zone traitée à l’eau. Cela éliminera l’excès de polylysine et permettra aux spermatozoïdes d’adhérer à la gaine de leur tête tandis que leurs flagelles peuvent encore bouger. Assemblez la lamelle à l’intérieur de la chambre d’enregistrement.

Placez 10 microlitres de cellules chargées de grippe oh 3h00 du matin à une concentration de un fois 10 à la septième cellules par millilitre. Au centre de la lamelle. Couvrez les cellules avec 200 microlitres de HSM préchauffé.

Placez la chambre sur la platine du microscope, préchauffée à 37 degrés Celsius, et visualisez les cellules à l’aide du contraste de phase. Sélectionnez une zone où la densité cellulaire est appropriée pour l’imagerie. Trop de cellules rendent l’analyse difficile en raison du chevauchement des signaux.

Les cellules doivent être fermement attachées à la lamelle par leur tête, mais présentent un mouvement de flagelle, ce qui confirme la viabilité. Démarrez l’expérience en activant le logiciel d’acquisition d’images de séries chronologiques. En règle générale, quatre images sont nécessaires par seconde avec un éclairage de deux millisecondes par image.

Acquérez des images de fluorescence en mode direct. Pour régler la mise au point et la luminosité. Dans ce cas, à l’aide d’une micro-pipette, ajoutez délicatement la progestérone du composé d’essai et poursuivez l’acquisition d’images si nécessaire.

Effectuez deux ajouts de contrôle séquentiels dans la même chambre. 20 mycine d’ions micromolaires pour obtenir une fluorescence maximale et cinq millimolaires de chlorure de manganèse pour obtenir une fluorescence minimale. Effectuez une analyse d’images hors ligne à l’aide du logiciel IQ.

Dessinez les régions d’intérêt ou les zones d’intérêt autour de chaque cellule ou partie d’une cellule. De plus, sélectionnez une zone sans cellule pour la soustraction automatique de l’arrière-plan par le logiciel. Une série d’intensité de fluorescence temporelle est ensuite obtenue pour chaque retour sur investissement et ces données peuvent être exportées vers Microsoft Excel pour une analyse plus approfondie.

La progestérone est l’un des inducteurs de réaction acrosomique connus et, comme prévu, provoque une augmentation transitoire de la concentration intracellulaire de calcium dans les spermatozoïdes humains, mesurée par fluorométrie conventionnelle. La trace de fluorescence rouge en fonction du temps montre des changements de concentration de calcium intracellulaire causés par l’ajout de quatre micromolaires de progestérone en tant que témoin négatif HSM a été ajouté, ce qui n’a pas entraîné de changement dans les niveaux de concentration de calcium intracellulaire comme indiqué par la trace de fluorescence bleue en tant que contrôle positif. Le changement induit par la mycine ionique 10 micromolaires est montré pour chaque trace.

L’ajout de cet ionophore calcique provoque l’augmentation maximale de la concentration cellulaire de calcium RA, qui ne revient pas aux niveaux basaux. Ce graphique à barres a montré la variation moyenne du delta de fluorescence F à partir de chaque condition, plus ou moins l’erreur type où N est égal à trois et l’astérisque indique une valeur P inférieure à 0,001 par rapport au témoin. L’augmentation de la concentration de calcium intracellulaire induite par la progestérone a été mesurée avec une plus grande résolution temporelle par fluorométrie à flux arrêté et des résultats représentatifs sont présentés ici.

Des traces brutes sont montrées dans le panneau A, la progestérone représentée par la ligne rouge et la mycine ionique représentée par la ligne bleue ont provoqué une augmentation rapide de la concentration intracellulaire de calcium. La trace verte est le témoin négatif où les cellules ont été mélangées avec le HSM. Le panneau B montre des traces corrigées pour les signaux induits par la progestérone ou avec la mycine ionique obtenue en soustrayant le signal de contrôle de leurs signaux bruts correspondants.

La progestérone a provoqué une augmentation très rapide et transitoire de la concentration de calcium intracellulaire, avec une valeur de fluorescence maximale survenant 2,7 secondes après l’ajout de l’inducteur. D’autre part, la CIN a provoqué une augmentation rapide et soutenue de la concentration de calcium intracellulaire pendant 50 secondes. L’encart du panneau B montre une vue agrandie des 500 premières millisecondes pour chaque réponse.

L’absence d’un retard dans l’augmentation de la concentration de calcium intracellulaire induite par la progestérone est cohérente avec les rapports précédents suggérant que la progestérone active directement l’éperon du chat du canal calcique sans signalisation intermédiaire. La concentration intracellulaire de calcium a également été mesurée chez les spermatozoïdes humains incapables et non capables à l’aide de la cytométrie en flux. Dans ces diagrammes de dispersion représentatifs vers l’avant et sur les côtés.

Les cellules capacitaires sont en bleu et les cellules non capacitaires sont en rouge. La porte sélectionnée est indiquée par une ligne bleue et seules les cellules de cette zone ont été utilisées pour une analyse plus approfondie. Le panneau B montre l’histogramme de fluorescence dans le canal Fitzy de spermatozoïdes non colorés, et le panneau D montre l’histogramme de fluorescence dans le canal FZ de spermatozoïdes colorés par la grippe à 3h00 comme observé dans le panneau D.La distribution des valeurs de fluorescence pour les spermatozoïdes capacités représentés par la trace bleue est décalée à des valeurs plus élevées par rapport aux spermatozoïdes non capacités représentés par la trace rouge.

Le panneau C montre l’histogramme de fluorescence dans le canal PI à partir de cellules non colorées et le panneau E montre l’histogramme de fluorescence dans le canal PI à partir de cellules mortes. Les valeurs de fluorescence de chaque cellule individuelle peuvent être observées dans les diagrammes de points de fluorescence bidimensionnels présentés ici. Pour les cellules non colorées et les cellules doublement colorées avec la grippe oh 3:00 AM et pi, le pourcentage de cellules enregistrées dans chaque quadrant est indiqué par le nombre rouge.

Il est important de noter que le signal provenant des cellules mortes peut être éliminé. Enfin, le changement de concentration intracellulaire de calcium induit par la progestérone a été mesuré dans des spermatozoïdes individuels en imageant ces images pseudocolores représentatives montrant les cellules visualisées au début et après les ajouts de progestérone, de CIN et de chlorure de manganèse. L’ajout de progestérone provoque une augmentation de la concentration de calcium intracellulaire, à la fois dans la tête du spermatozoïde et le chlorure de manganèse est utilisé pour diminuer la grippe.

Oh 3:00 AM Fluorescence par extinction représentative des traces de fluorescence normalisées de neuf cellules individuelles de l’expérience sont montrées dans cette figure. Comme observé dans les expériences de population, l’analyse de cellules uniques a révélé une augmentation transitoire et une augmentation soutenue de la progestérone et de la mycine ionique respectivement. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures si elle est exécutée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier de vérifier la viabilité des cellules et d’effectuer les contrôles appropriés après cette procédure. D’autres méthodes comme l’électrophysiologie pourraient être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’identification de canaux ioniques spécifiques impliqués dans l’augmentation du calcium en utilisant des solutions spécifiques et des protocoles de simulation après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la physiologie cellulaire pour explorer la dynamique du calcium dans les cellules vivantes avec une haute résolution spatiale et temporelle.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de sélectionner la technique la plus appropriée pour mesurer les augmentations de calcium intracellulaire à l’aide de la fluorescence dans n’importe quel type de cellule, en fonction de la question spécifique à laquelle vous souhaitez répondre. N’oubliez pas que travailler avec des échantillons de siemen humain peut être dangereux et que des précautions telles que l’utilisation de donneurs de santé prouvée. L’utilisation de globes en latex pendant la procédure et l’élimination appropriée de la solution et des matériaux doivent toujours être prises en compte lors de l’exécution de cette procédure.