Mesure intracellulaire de Ca

L'objectif général de cette procédure est de mesurer les fluctuations intracellulaires de calcium dans les spermatozoïdes humains à l'aide de colorants fluorescents. Cela est réalisé en préparant d'abord l'échantillon de spermatozoïdes par la méthode du remontage et, si nécessaire, en induisant la capacitation. La deuxième étape consiste à charger les spermatozoïdes avec un colorant fluorescent au calcium.

Ensuite, à l'aide de la fluorométrie classique, de la fluorométrie en flux arrêté, de la cytométrie en flux ou de l'imagerie monocellulaire, réalisez l'expérience et enregistrez les mesures de calcium. Enfin, les résultats sont analysés afin de déterminer les variations des concentrations intracellulaires de calcium induites par la progestérone ou survenant au cours du processus de capacitation. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que celles impliquant la radioactivité, réside dans sa grande sensibilité.

Il est sûr et facile à réaliser. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation calcique SPR, telles que l'identification de composés induisant des augmentations de calcium intracellulaire avec une haute résolution spatiale et temporelle, ainsi que l'identification de différentes sous-populations cellulaires dans un échantillon de sperme. Les implications de l'utilisation, par exemple, de la cytométrie en flux s'étendent vers le diagnostic des troubles de la fertilité par l'analyse de l'état physiologique des gamètes mâles.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'étude de la mobilisation du calcium dans les spermatozoïdes humains, elle peut également être appliquée à d'autres types de cellules, comme les gamètes mâles d'autres espèces ou différents types cellulaires tels que les neurones ou les cellules musculaires. En général, les personnes utilisant cette méthode éprouvent des difficultés, car la manipulation des spermatozoïdes n'est pas aisée et il est essentiel de maintenir des conditions appropriées pour obtenir des cellules viables et mobiles tout au long de l'expérience. Nous avons mis en œuvre l'utilisation de ces techniques en combinant des stratégies utilisant différents domaines.

La démonstration visuelle de cette méthode est importante car la préparation et la manipulation de l'échantillon, ainsi que l'ajout des composés, sont difficiles à maîtriser, les cellules spermatiques pouvant être endommagées durant le protocole et des artefacts dans les réponses pouvant apparaître lors de l'ajout des composés. Pour préparer l'échantillon de sperme, il faut déposer soigneusement un millilitre de milieu hams F 10 au-dessus de chaque échantillon de 500 microlitres de sperme liquéfié. Eloqua, touchez la paroi du tube avec la pointe de la micropipette et délivrez délicatement le milieu au-dessus de l'échantillon.

Il est essentiel de procéder lentement afin d'éviter de mélanger les couches d'échantillon et de milieu. Le milieu est enrichi avec du chlorure de calcium à deux millimolaire et de l'albumine sérique bovin à cinq milligrammes par millilitre. Pour favoriser la capacitation in vitro, incliner délicatement les tubes à un angle d'environ 30 degrés.

Cela augmentera la surface de contact entre les deux liquides, améliorant ainsi le déplacement ou la remontée des cellules spermatiques de l'échantillon vers le milieu pendant l'incubation. Ensuite, placez les tubes à essai inclinés dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, 95 % d'air, pendant une heure après une heure.

Utilisez une micropipette pour prélever soigneusement de chaque tube les 700 microlitres supérieurs du milieu Hams F 10, qui contient désormais des spermatozoïdes mobiles. Rassemblez tous les échantillons prélevés dans un seul tube en verre propre, en évitant la formation de bulles. Déposez 10 microlitres de l'échantillon regroupé sur la lame de verre plane d'une chambre de comptage maculaire et placez la lamelle de couverture.

Veillez à éviter la formation de bulles à l'intérieur de la chambre, car cela entraînerait un décompte cellulaire inexact. Observer au microscope composé équipé d'un objectif 20 x. Le couvre-objet de la chambre de comptage maculaire présente un grand carré constitué de 100 petits carrés.

Comptez les cellules dans n'importe quelle bande de 10 carrés. Ce nombre représente la concentration cellulaire en millions de cellules par millilitre. Répétez le comptage dans deux bandes supplémentaires de 10 carrés et calculez la moyenne des trois comptages pour charger les cellules avec un colorant fluorescent.

Combiner, dans un tube Eppendorf de 1,5 millilitre, le volume requis de suspension de spermatozoïdes avec suffisamment de solution mère de flu oh 3:00 AM à une millimolaire pour obtenir une concentration finale de deux micromolaire de flu oh 3:00 AM. Incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, à l’abri de la lumière. Centrifuger le tube à 750 ×g pendant cinq minutes. La formation d’un précipité diffus plutôt que d’un culot indique que les cellules sont en bon état. Aspirer et jeter le surnageant, puis resuspendre le culot dans le volume approprié de milieu pour spermatozoïdes humains ou HSM. Pour commencer cette expérience, combiner dans un tube en verre à fond plat, 570 microlitres de HSM et 30 microlitres de suspension de cellules spermatiques préalablement chargées avec flu oh 3:00 AM et resuspendues dans du HSM afin d’obtenir une concentration de un fois dix puissance huit cellules par millilitre.

Placer une barrette magnétique à l'intérieur du tube en verre et insérer le tube dans la chambre de lecture du spectromètre préchauffé à 37 degrés Celsius. L'échantillon doit être agité en continu pendant toute la durée d'acquisition. Démarrer l'expérience à l'aide du logiciel oli et procéder à l'acquisition des valeurs de fluorescence à une fréquence de 0,5 hertz pendant 300 secondes.

Après avoir acquis la fluorescence de base pendant 30 secondes, utilisez une seringue Hamilton Micro pour injecter le volume approprié du composé testé, dans ce cas de la progestérone micromolaire à 100 secondes. Ajoutez 20 micromolaire d'ionomycine comme contrôle positif afin d'obtenir la valeur maximale de fluorescence. Dans cette expérience, les variations de calcium intracellulaire sont mesurées avec une haute résolution temporelle.

À l’aide d’un mélangeur à flux arrêté SFM 20 couplé à un système optique de cinétique rapide, remplir l'une des seringues de l'appareil avec un millilitre de cellules spermatiques chargées au flu. 3:00 AM et la seconde seringue avec un millilitre du composé à tester, soit 20 micromolaire de progestérone dissoute dans HSM.

Dans cet exemple, il est essentiel d'éviter la formation de bulles lors du prélèvement des liquides dans les seringues. Relevez les pistons des deux instruments jusqu'à ce qu'ils touchent l'extrémité des embouts des pistons de seringue. Réglez dans ce cas la durée totale d'échantillonnage sur 50 secondes et la fréquence sur 10 millisecondes afin de minimiser les dommages cellulaires, puis réglez le débit à la valeur minimale permettant d'obtenir un déclenchement de réponse mesurable.

Le mélange des réactifs et le tracé de la fluorescence brute en fonction du temps seront affichés sur l'écran de l'ordinateur. Répétez cette procédure en remplaçant la progestérone par du HSM comme témoin négatif et de l'ionomycine à 10 micromolaire comme témoin positif avant la cytométrie en flux. Préparez les échantillons expérimentaux en plaçant 500 microlitres de suspension cellulaire par tube de cytomètre dans chaque condition à tester.

Configurer une expérience à l'aide du logiciel de l'équipement. Commencez par créer un nouveau dossier, un spécimen d'expérience et un nombre de tubes. Sélectionnez ensuite les paramètres appropriés du cytomètre pour flu O 3:00 AM. Utilisez les filtres d'isothiocyanate de fluorescéine et d'iodure de propidium.

Exécutez les tubes témoins non colorés un et deux dans le cytomètre. Recueillez les données de diffusion avant et latérale afin de vérifier que les seuils sont appropriés et de créer la fenêtre correspondante pour discriminer les débris des cellules. Exécutez les tubes expérimentaux et recueillez les données de fluorescence à partir de 10 000 événements par échantillon.

À la fin, exportez toutes les données vers le logiciel disponible pour analyse. Préparez les lamelles rondes nécessaires pour cette procédure en appliquant une goutte de cinq microlitres de solution de poly-L-lysine au centre de chaque lamelle.

Laisser reposer pendant au moins une heure avant utilisation, puis rincer la zone traitée à l’eau. Cela éliminera l’excès de polylysine et permettra aux cellules spermatiques d’adhérer au lamelle par leur tête, tout en laissant leurs flagelles libres de se mouvoir. Monter le lamelle à l’intérieur de la chambre d’enregistrement.

Placez 10 microlitres de cellules chargées de flu oh 3:00 AM à une concentration de 1 × 10⁷ cellules par millilitre au centre du lamelle. Recouvrez les cellules avec 200 microlitres de HSM préalablement réchauffé.

Placer la chambre sur la platine du microscope préchauffé à 37 degrés Celsius, et observer les cellules en contraste de phase. Sélectionner une zone où la densité cellulaire est appropriée pour l'acquisition d'images. Un nombre excessif de cellules rend l'analyse difficile en raison du recouvrement des signaux.

Les cellules doivent être fermement attachées à la lame par la tête, mais présenter un mouvement des flagelles, ce qui confirme leur viabilité. Commencez l'expérience en activant le logiciel d'acquisition d'images en série temporelle. Généralement, quatre images par seconde sont nécessaires, avec une illumination de deux millisecondes par image.

Acquérir des images de fluorescence en mode direct. Ajuster la mise au point et la luminosité. À l’aide d’une micropipette, ajouter soigneusement goutte à goutte le composé test, dans ce cas-ci la progestérone, et poursuivre l’acquisition des images selon les besoins.

Réalisez deux ajouts de contrôle séquentiels dans la même chambre : 20 micromolaire d’ionomycine pour obtenir une fluorescence maximale et cinq millimolaire de chlorure de manganèse pour obtenir une fluorescence minimale. Effectuez l’analyse des images hors ligne à l’aide du logiciel IQ.

Dessinez les régions d’intérêt ou ROI autour de chaque cellule ou partie de cellule. En outre, sélectionnez une zone sans cellule pour la soustraction automatique du fond par le logiciel. Une série temporelle de l’intensité de fluorescence est ensuite obtenue pour chaque ROI, et ces données peuvent être exportées vers Microsoft Excel pour une analyse ultérieure.

La progestérone est l'un des inducteurs connus de la réaction acrosomique et, comme prévu, provoque une augmentation transitoire de la concentration intracellulaire en calcium dans les spermatozoïdes humains, mesurée par fluorométrie conventionnelle. La courbe de fluorescence rouge en fonction du temps montre les variations de la concentration intracellulaire en calcium provoquées par l'ajout de quatre micromoles de progestérone ; en tant que contrôle négatif, du milieu HSM a été ajouté, ce qui n'a provoqué aucun changement des niveaux de concentration intracellulaire en calcium, comme indiqué par la courbe de fluorescence bleue. En tant que contrôle positif, la variation induite par l'ionomycine à 10 micromoles est indiquée pour chaque courbe.

L'ajout de cet ionophore calcique provoque une augmentation maximale de la concentration intracellulaire de calcium, qui ne revient pas aux niveaux basaux. Ce diagramme en barres montre la variation moyenne de la fluorescence delta F pour chaque condition, plus ou moins l'erreur standard, où N est égal à trois et où l'astérisque indique une valeur P inférieure à 0,001 par rapport au témoin. L'augmentation de la concentration intracellulaire de calcium induite par la progestérone a été mesurée avec une meilleure résolution temporelle par fluorométrie en flux arrêté, et des résultats représentatifs sont présentés ici.

Les tracés bruts sont présentés dans le panneau A ; à la fois la progestérone, représentée par la ligne rouge, et l'ionomycine, représentée par la ligne bleue, ont provoqué une augmentation rapide de la concentration intracellulaire en calcium. Le tracé vert correspond au témoin négatif, dans lequel les cellules ont été mélangées avec du HSM. Le panneau B montre les tracés corrigés pour les signaux induits par la progestérone ou par l'ionomycine, obtenus en soustrayant le signal du témoin de leurs signaux bruts respectifs.

La progestérone a provoqué une augmentation très rapide et transitoire de la concentration intracellulaire de calcium, avec une valeur maximale de fluorescence atteinte 2,7 secondes après l'ajout de l'inducteur. En revanche, le CIN a provoqué une augmentation rapide et soutenue de la concentration intracellulaire de calcium pendant 50 secondes. L'encart du panneau B montre un agrandissement des premières 500 millisecondes de chaque réponse.

L'absence de délai dans l'augmentation de la concentration intracellulaire de calcium induite par la progestérone est conforme aux rapports antérieurs suggérant que la progestérone active directement le canal calcique cat spur sans signalisation intermédiaire. La concentration intracellulaire de calcium a également été mesurée dans des spermatozoïdes humains capacités et non capacités à l'aide de la cytométrie en flux. Sur ces graphiques représentatifs de diffusion directe et latérale.

Les cellules capacités apparaissent en bleu et les cellules non capacités en rouge. La porte sélectionnée est indiquée par la ligne bleue, et seules les cellules situées dans cette zone ont été utilisées pour les analyses ultérieures. Le panneau B montre l'histogramme de fluorescence dans le canal Fitzy obtenu à partir des spermatozoïdes non marqués, tandis que le panneau D montre l'histogramme de fluorescence dans le canal FZ obtenu à partir des spermatozoïdes marqués avec flu oh 3:00 AM, comme observé dans le panneau D. La distribution des valeurs de fluorescence pour les spermatozoïdes capacités, représentée par le tracé bleu, est décalée vers des valeurs plus élevées par rapport à celle des spermatozoïdes non capacités, représentée par le tracé rouge.

Le panneau C montre l'histogramme de fluorescence dans le canal PI provenant des cellules non marquées, et le panneau E montre l'histogramme de fluorescence dans le canal PI provenant des cellules mortes. Les valeurs de fluorescence pour chaque cellule individuelle peuvent être observées sur les diagrammes de dispersion bidimensionnels présentés ici. Pour les cellules non marquées et les cellules doublement marquées avec flu oh 3:00 AM et PI, le pourcentage de cellules enregistrées dans chaque quadrant est indiqué par le nombre rouge.

Il est important de noter que le signal provenant des cellules mortes peut être éliminé. Enfin, la variation de la concentration intracellulaire de calcium induite par la progestérone a été mesurée dans des cellules spermatiques individuelles en imagerie ; ces images représentatives en fausses couleurs montrent des cellules visualisées au début et après l'ajout de progestérone, de CIN et de chlorure de manganèse. L'ajout de progestérone provoque une augmentation de la concentration intracellulaire de calcium, tant dans la tête du spermatozoïde que dans la pièce intermédiaire ; le chlorure de manganèse est utilisé pour diminuer la flu.

À 3h00 du matin, la fluorescence par extinction, représentée par des tracés de fluorescence normalisés de neuf cellules individuelles provenant de l'expérience, est montrée sur cette figure. Comme observé dans les expériences sur des populations, l'analyse au niveau de la cellule unique a révélé une augmentation transitoire pour la progestérone et une augmentation soutenue pour l'ionomycine, respectivement. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures si elle est effectuée correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de vérifier la viabilité des cellules et de réaliser les contrôles appropriés après avoir suivi cette procédure. D'autres méthodes, comme l'électrophysiologie, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que l'identification des canaux ioniques spécifiques impliqués dans l'augmentation du calcium, en utilisant des solutions de perfusion et des protocoles de stimulation après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la physiologie cellulaire pour explorer la dynamique du calcium dans les cellules vivantes avec une résolution spatiale et temporelle élevée.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment choisir la technique la plus appropriée pour mesurer les augmentations de calcium intracellulaire à l’aide de colorants fluorescents dans tout type de cellule, en fonction de la question précise que vous souhaitez répondre. N’oubliez pas que le travail avec des échantillons humains peut présenter des risques et que des précautions, telles que l’utilisation de donneurs dont la santé est attestée, doivent être prises. L’utilisation de gants en latex pendant la procédure ainsi qu’une élimination adéquate des solutions et des matériaux doivent toujours être respectées lors de la réalisation de cette procédure.