Name: Mesure intracellulaire de Ca 2 + Les changements dans le sperme humain à laide de quatre techniques: FLUOROMETRIE conventionnel, sest arrêté Fluorimétrie du flux, la cytométrie en flux et limagerie cellulaire unique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 26 s
Description: Découvrez la mesure des fluctuations de calcium intracellulaire dans le sperme humain par fluorimétrie conventionnelle, cytométrie en flux et imagerie cellulaire. Cette méthode sensible remplace les techniques radioactives.

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Les auteurs remercient Jose Luis De la Vega, Erika Melchy et le Dr Takuya Nishigaki pour l&#39;assistance technique. Ce travail a été soutenu par Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Mexique) (99333 et 128566 pour CT); Dirección General de Asuntos del Personal Académico / Universidad Nacional Autónoma de México (IN202212-3 CT).

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</ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

Signalisation intracellulaire est vital pour la plupart des activités cellulaires; Ca 2 + est un messager ubiquitaire qui accompagne les cellules de mammifères pendant toute leur durée de vie, de leur origine à la fécondation, à la fin de leur cycle de vie. En réponse à différents stimuli, [Ca 2 +] i augmente, oscille et diminue avec la codification spatio-temporelle, en conséquence, divers procédés sont activés, modulés ou résilié par le Ca 2 + messages codés. Ca2 + intracell...

Ca 2 + est un second messager universel de voies de transduction de signaux dans les cellules eucaryotes. Ca2 + intracellulaire (Ca 2 + i) participe à la régulation de nombreux processus physiologiques fondamentaux dans les cellules excitables à la fois et non excitable. L&#39;importance et l&#39;universalité de Ca 2 + comme second messager pendant les événements de transduction du signal est dérivé de sa polyvalence spatio-temporelle dans la transmission des informations au sein de la cellule. Alors que Ca 2 + ne peut pas être synthétisé de novo ou dégradés au sein de la cellule, sa concentration intracellulaire ([Ca 2 +] i) est maintenue dans des limites très strictes à travers différents mécanismes cellulaires tampon en continu, séquestrer, compartimenter et / ou accumuler Ca 2 +. Les variations de la concentration de cet ion peuvent se produire dans des zones très localisées à l&#39;intérieur de la cellule 1, et à déchiffrer ces fluctuations est essentielle pour avoir une decompréhension de l&#39;EPER (1) de leur rôle dans le mécanisme de signalisation, (2) leur signification physiologique, et (3) les mécanismes généraux de la signalisation cellulaire. Ca 2 + signalisation médiée revêt une importance particulière dans la physiologie de sperme 2. La motilité des spermatozoïdes est l&#39;une des fonctions les plus importantes pour la réussite de la fécondation, et, en fait, plusieurs anomalies de la motilité des spermatozoïdes peut causer la stérilité 3-5. L&#39;importance de Ca 2 + dans le mouvement du flagelle est reconnu depuis longtemps 6, mais le mécanisme de la façon Ca 2 + contrôle la forme spécifique de flagelles flexion n&#39;est pas entièrement comprise. Avant de fusionner avec l&#39;ovule, les spermatozoïdes doivent subir la capacitation, un processus complexe dépendant de résidence de spermatozoïdes dans le tractus génital féminin. Au cours de capacitation, lipides l&#39;architecture et l&#39;organisation du sperme membrane sont modifiés, principalement en raison de l&#39;élimination du cholestérol de la membrane plasmique. En outre, plusieurs protéines sont tyrosine-phosphoreylated 7. Fait important, au cours de capacitation il ya une augmentation du pH intracellulaire (pH i) et de [Ca 2 +] i, et le potentiel de membrane hyperpolarise chez certaines espèces 2. Capacitation n&#39;a lieu que dans une sous-population de spermatozoïdes (20-40%), et les mécanismes impliqués dans toutes ces modifications cellulaires sont loin d&#39;être claires. Il est généralement admis que seule une sous-population de spermatozoïdes capacités subir la réaction de l&#39;acrosome (AR) lorsqu&#39;ils sont exposés à des inducteurs physiologiques. L&#39;AR est aussi un événement + 2 réglementé Ca nécessaire pour la fécondation chez toutes les espèces possédant un acrosome (organite spécialisé avec membranes externes et internes). Au cours de ce processus, les fusibles de la membrane acrosomique externe avec la membrane plasmique du spermatozoïde, libérant des enzymes hydrolytiques qui permettent au spermatozoïde de pénétrer dans la matrice glyco-protéique qui entoure l&#39;ovule (zone pellucide, ou ZP). Le RA expose également une nouvelle surface de la cellule de sperme fusogène qui interagit avecde la membrane plasmique des oeufs pour la fusion finale des deux gamètes. Il ya plusieurs ligands cellulaires qui induisent l&#39;AR, la progestérone est l&#39;un des plus étudiés parmi eux. Dans ce travail, nous présentons quatre différentes techniques impliquant l&#39;utilisation d&#39;un 2 colorant fluorescent + sensible Ca à mesurer [Ca 2 +] i changements dans le sperme humain provoqué par la progestérone (à l&#39;exception de la cytométrie de flux, dans laquelle nous avons mesuré la [Ca 2 + ] i augmentation induite pendant le processus de capacitation in vitro). Dans ce cas particulier, nous avons utilisé Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), un colorant membrane perméable avec un Kd = 325 nM. In vitro, nous avons suivi les changements de fluorescence en fonction du temps avec trois des méthodologies, et avec la quatrième technique, nous avons mesuré des valeurs de fluorescence en un seul point donné dans le temps. Ces différentes approches se complètent les uns les autres, car ensemble, ils fournissent res spatiales et temporellesolution, tant au niveau de la population cellulaire de la cellule unique et. Population cellulaire ou expériences en vrac Techniques en vrac sont largement utilisés non seulement parce que les instruments dont ils ont besoin sont disponibles, mais aussi parce qu&#39;ils sont simples, bien établi, et permettent l&#39;étalement de l&#39;information à partir de mesures effectuées sur des millions de cellules en une seule expérience. Technique n ° 1. Fluorimétrie conventionnel Cette technique surveille les variations de la fluorescence en fonction du temps, et les expériences sont réalisées dans des cuves en verre avec des volumes d&#39;échantillon allant de 200 à 1000 pl. Un bon mélange de réactifs ont été ajoutés nécessite une agitation magnétique, et donc la résolution temporelle obtenue est de l&#39;ordre de quelques secondes. La gamme de concentration cellulaire typique des échantillons analysés est de 10 5 -10 8 cellules / ml. Technique n ° 2. Fluorimétrie Flow arrêté Tsa technique surveille également les variations de la fluorescence en fonction du temps, mais les réactifs sont rapidement mélangés ensemble (en utilisant la pression) dans une cuvette d&#39;enregistrement contenant un très faible volume de l&#39;échantillon (allant de 25 à 100 pl). Par conséquent, l&#39;homogénéisation des réactifs est instantané, ce qui permet une haute résolution temporelle de l&#39;ordre de millisecondes. L&#39;analyse des traces de fluorescence en fonction du temps qui en résultent sont aptes à déterminer les taux de réaction, l&#39;élucidation de la complexité du mécanisme de réaction, d&#39;obtenir des informations sur les intermédiaires de réaction de courte durée, etc La gamme de concentration cellulaire commun des échantillons analysés est de 10 5 -10 7 cellules / ml. Simples expériences sur des cellules Expériences en vrac signalent le comportement moyen d&#39;un grand nombre de cellules, mais une population peut souvent présenter des propriétés hétérogènes qui sont négligés au cours de ce type de mesures. Techniques unicellulaires sont donc utilisés pour compléter èmeinformation e obtenu avec les expériences des populations cellulaires. Technique n ° 3. cytométrie en flux Malgré l&#39;importance de l&#39;information découlant de mesures de cellules simples, il est important d&#39;analyser un grand nombre de cellules afin d&#39;éviter l&#39;extrapolation erronée des propriétés spécifiques des cellules d&#39;une population entière. Pour cette raison, des techniques à haut débit sont favorisés et la méthode la plus populaire est la cytométrie de flux, dont 10.000 cellules par état sont classiquement analysées. Cette méthode permet une analyse multi-paramétrique de populations hétérogènes, car elle classe les cellules en fonction de leur taille (diffusion vers l&#39;avant (FSC)), la granularité (diffusion latérale (SSC)) et de l&#39;intensité de fluorescence (marquage spécifique avec un anticorps, un marqueur de viabilité, etc) , fournissant ainsi des informations sur la répartition des paramètres d&#39;un groupe de cellules. La cytométrie en flux permet instant plutôt que de l&#39;information dépendant du temps 8. Avant et sur le côté des valeurs disperser are aussi utile pour sélectionner une porte qui comporte des cellules, mais discrimine les débris cellulaires, la poussière, etc Pour des mesures de fluorescence, les contrôles de fluorescence négatifs et positifs doit également être inclus. Si plus d&#39;un canal de fluorescence est utilisé, un processus connu sous le nom compensation doit être effectué (voir détails <a href="http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp</a> ). Compensation permet de chevauchement spectral discrimination entre les fluorophores. La cytométrie en flux permet en outre la discrimination de cellules mortes, généralement au moyen d&#39;iodure de propidium coloration. Technique n ° 4. Imagerie cellulaire unique La microscopie est une autre méthode commune pour étudier le comportement de cellules individuelles, il est bien adapté pour les études en fonction du temps et il fournit également la résolution spatiale. Un inconvénient majeur est que l&#39;analyse à haut débit est seulement à ses débuts à l&#39;heure actuelle <sup&gt; 9.

<table><tbody><tr><td>Ham’s F-10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-6013</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté env. 99 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-3881</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de comptage Makler</td><td>SEFI Medical Insruments Ltd</td><td>SEF-MAKL</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td>20 flacons/50 &mu ; g chacun</td></tr><tr><td>Ionomycine</td><td>Alomone</td><td>I-700</td><td></td></tr><tr><td>Progestérone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0130</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td>Réactifs pour spermatozoïdes humains (HSM)</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3911</td><td>Réactifs pour spermatozoïdes humains (HSM)</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>JT Baker</td><td>3506</td><td>Réactifs pour milieu spermatique humain (HSM)</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2670</td><td>Réactifs pour milieu spermatique humain (HSM)</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium anhydre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1016</td><td>Réactifs pour milieu spermatique humain (HSM)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3125</td><td>Réactifs pour milieu spermatique humain (HSM)</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>JT Baker</td><td>1906-01</td><td>Réactifs pour spermatozoïdes humains milieu (HSM)</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2256</td><td>Réactifs pour spermatozoïdes humains (HSM)</td></tr><tr><td>L-lactate de sodium (environ 99 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L- 7022</td><td>Réactifs pour spermatozoïdes humains (HSM)</td></tr><tr><td>Iodure de propidium </td><td>Invitrogen</td><td>L-7011</td><td>Composant B</td></tr><tr><td>Triton X-100 (t-Octylphénoxypolyéthoxyéthanol)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>X-100</td><td>solution de 2,4 mM dans l’eau </td></tr><tr><td>Lamle ronde </td><td>VWR</td><td>48380 080</td><td>25 mm de diamètre</td></tr><tr><td>Solution de poly-L-lysine </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de manganèse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3634</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor ; Chambre cellulaire, pour la microscopie</td><td>Life technologies</td><td>A-7816</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>5x5 ml</td></tr></tbody></table>

mesure intracellulaire de ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; les changements dans le sperme humain à l&#39;aide de quatre techniques: fluorometrie conventionnel, s&#39;est arrêté fluorimétrie du flux, la cytométrie en flux et l&#39;imagerie cellulaire unique

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Les spermatozoïdes sont des cellules reproductrices mâles spécialement conçues pour atteindre, à reconnaître et fusionner avec l&#39;ovule. Pour effectuer ces tâches, les spermatozoïdes doivent être prêts à faire face à un environnement en constante évolution et de surmonter plusieurs obstacles physiques. Être en essence transcription et translation silencieuse, ces cellules mobiles comptent profondément sur divers mécanismes de signalisation de s&#39;orienter et se baigner dans un mode scène et à composer avec des conditions environnementales difficiles au cours de leur voyage pour trouver l&#39;œuf. En particulier, le Ca 2 + signalisation médiée est essentiel pour plusieurs fonctions de sperme: activation de la motilité, la capacitation (un processus complexe qui prépare le sperme pour la réaction de l&#39;acrosome) et la réaction de l&#39;acrosome (un événement exocytotique qui permet la fusion de sperme oeuf). L&#39;utilisation de colorants fluorescents pour suivre les fluctuations intracellulaires de cet ion est d&#39;une importance remarquable en raison de leur facilité d&#39;application, la sensibilité et la polyvalence de detection. L&#39;utilisation d&#39;un protocole colorant charge unique, nous utilisons quatre techniques différentes fluorimétriques pour surveiller sperme Ca 2 + dynamique. Chaque technique fournit des informations distincte qui permet une résolution spatiale et / ou temporelle, la génération de données, tant au niveau des populations cellulaires cellule unique et.

<img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma du protocole expérimental pour le sperme préparation d&#39;échantillons par la méthode swim-up. Les principales étapes de la séparation de spermatozoïdes mobiles et pour l&#39;ajustement de leur concentration sont illustrés. La dernière étape d&#39;incubation est effectuée uniquement lorsque la capacita...

Intracellulaire de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamique est très importante dans le sperme physiologie et Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sensibles à des colorants fluorescents constituent un outil polyvalent pour les étudier. expériences de la population (fluorimétrie et arrêté fluorometrie de flux) et des expériences de cellules individuelles (cytométrie en flux et l&#39;imagerie cellulaire unique) sont utilisés pour suivre spatio-temporelle [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;] Changements dans les cellules du sperme humain.

Mesure intracellulaire de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Les changements dans le sperme humain à l&#39;aide de quatre techniques: FLUOROMETRIE conventionnel, s&#39;est arrêté Fluorimétrie du flux, la cytométrie en flux et l&#39;imagerie cellulaire unique

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer les fluctuations intracellulaires de calcium dans les spermatozoïdes humains à l'aide de colorants fluorescents. Cela est réalisé en préparant d'abord l'échantillon de spermatozoïdes par la méthode du remontage et, si nécessaire, en induisant la capacitation. La deuxième étape consiste à charger les spermatozoïdes avec un colorant fluorescent au calcium.Ensuite, à l'aide de la fluorométrie classique, de la fluorométrie en flux arrêté, de la cytométrie en flux ou de l'imagerie monocellulaire, réalisez l'expérience et enregistrez les mesures de calcium. Enfin, les résultats sont analysés afin de déterminer les variations des concentrations intracellulaires de calcium induites par la progestérone ou survenant au cours du processus de capacitation. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que celles impliquant la radioactivité, réside dans sa grande sensibilité.Il est sûr et facile à réaliser. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation calcique SPR, telles que l'identification de composés induisant des augmentations de calcium intracellulair

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Techniques d&#39;imagerie Ca 2 + Signalisation dans le sperme humain

Le calcium est impliqué dans de nombreuses voies de signalisation physiologiques et physiopathologiques. Imagerie des cellules vivantes nécessite un équipement spécialisé et peut prendre du temps. Une méthode simple et rapide à l'aide d'un cytomètre de flux pour déterminer les changements relatifs au calcium cytosolique dans les cellules épithéliales adhérentes mises en suspension a été optimisée.

Mesures de calcium cytosolique dans les cellules épithéliales rénales par cytométrie en flux

Actuellement, la plupart des indicateurs calciques disponibles sont utilisés pour quantifier les transitoires calciques cytoplasmiques en tant que mesures indirectes du calcium libéré par le réticulum sarcoplasmique dans les cellules musculaires lisses en culture. Ce protocole décrit l’utilisation d’un indicateur spécifique basé sur le FRET qui permet de mesurer directement les signaux calciques dans la lumière du réticulum sarcoplasmique.

Imagerie confocale à base de FRET mesure des fluctuations de calcium à l&#39;intérieur du réticulum sarcoplasmique de Cultured cellules musculaires lisses Utilisation

Nous présentons ici les méthodes pour évaluer l’intégrité membranaire de spermatozoïde, une fonctionnalité cellulaire associée à compétence de fertilisation de sperme. Nous décrivons trois techniques pour l’évaluation fluorimétrique des membranes des spermatozoïdes : coloration simultanée avec des sondes fluorescentes spécifiques, microscopie à fluorescence et avancé cytométrie dédiés au sperme. Exemples de combiner les méthodes sont également présentés.

Fluorimétrique Techniques pour l’évaluation des Membranes des spermatozoïdes

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Moyen-throughput Screening tests pour l’évaluation des effets sur Ca2 +-signalisation et Acrosome Reaction en sperme humain

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Analyse par cytométrie en flux de biomarqueurs pour la détection des défauts fonctionnels des spermatozoïdes humains

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Imagerie calcique unicellulaire pour l’étude de l’activation des canaux ioniques calciques

Une méthode efficace pour obtenir des fractions hautement purifiées viables méiotiques de la souris testicule est décrit, qui combine un cadre raffiné dissociation cellulaire protocole avec le tri de cellules fluorescentes (FACS). Cette méthode tire parti des différences dans le contenu en ADN et de la densité nucléaire de fractions distinctes méiotique.

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Mesure intracellulaire de Ca

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