Enregistrement des courants électriques à travers la membrane plasmique des spermatozoïdes de mammifères

L’enregistrement de l’activité électrique des spermatozoïdes à l’aide de la technique du patch-clamp a été déterminant pour identifier différents canaux ioniques du spermatozoïde et comprendre l’électrophysiologie du spermatozoïde au niveau moléculaire. Cette méthode excelle dans la mesure des empreintes électrophysiologiques et pharmacologiques des canaux ioniques et constitue l’outil le plus fiable pour l’identification des canaux ioniques. Compte tenu de l’importance physiologique des canaux ioniques et des transporteurs électrogéniques pour la fertilité masculine, cette technique est un outil puissant pour comprendre certains défauts du spermatozoïde conduisant à l’infertilité.

Pour la fabrication de micropipettes, commencez par des capillaires en verre borosilicaté d’un diamètre extérieur de 1,5 millimètre, d’un diamètre intérieur de 0,86 millimètre et d’un filament interne. Assurez-vous que le diamètre intérieur de la pointe de la pipette soit d’environ deux micromètres avant le polissage au feu et qu’il soit réduit à 0,5 micromètre après un polissage approprié. Assemblez un pont d’agar pour maintenir l’environnement autour de l’électrode de référence stable.

Fabriquez un capillaire en verre en forme de L en le pliant sous un petit feu de Bunsen et laissez refroidir. Préparez une solution de 1 % d’agarose dans une molaire de chlorure de potassium et chauffez-la au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose fonde et que la solution devienne transparente. Remplissez soigneusement le capillaire en verre en forme de L avec l’agarose pour éviter les bulles d’air et laissez-le refroidir à température ambiante.

Sinon, immergez le capillaire en verre en forme de L dans l’agarose fondue. Faites tourner le récipient plusieurs fois et réchauffez-le au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose bouille, ce qui expulsera les bulles d’air du pont d’agar. Ouvrez la partie inférieure de l’abdomen de la souris avec des ciseaux et extrayez les deux épididymes.

Placez-les dans un bol de culture cellulaire de 35 millimètres rempli d’une solution saline élevée ou de HS préchauffée à température ambiante. Transférez les épididymides dans une nouvelle boîte de culture cellulaire contenant une solution de HS et éliminez soigneusement toute graisse résiduelle. Séparez les épididymides en caput, corpus et cauda à l’aide d’une lame de scalpel numéro 15.

Transférez le corpus de chaque épididyme dans une nouvelle boîte de culture cellulaire contenant une solution d’HS. Réalisez plusieurs incisions dans la partie isolée de l’épididyme à l’aide d’une lame pointue de scalpel numéro 11. Transférez les parties de l’épididymide avec plusieurs incisions dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre contenant 1,5 millilitre de solution HS.

Secouez brièvement les spermatozoïdes de l’épididyme dans la solution à l’aide de pinces Superfine Dumont Type 5A. Ensuite, jetez les épididymides et laissez le tube à température ambiante pendant 10 minutes. Attendez que la matière solide se sédidisse au fond du tube.

Ensuite, transférez le surnageant dans un autre tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Trouvez le spermatozoïde approprié avec une gouttelette cytoplasmique en utilisant un grossissement de 600x. Assurez-vous que la gouttelette cytoplasmique est ovale et présente une forme légèrement allongée en forme de fuseau.

Sélectionnez un spermatozoïde mobile avec la tête attachée à la gaine de couverture de sorte que le spermatozoïde est partiellement fixé, mais que la gouttelette cytoplasmique et le reste du flagellan continuent de bouger avec des flagelles battus. Assurez-vous que la tête du spermatozoïde est fixée de façon lâche à la gaine de couverture. Après sélection visuelle d’un spermatozoïde avec une morphologie appropriée, remplissez la micropipette avec la solution de pipette et fixez-la dans le porte-pipette.

Pour garder la pointe de la pipette propre des débris, appliquez une pression positive sur la pipette à l’aide de l’ensemble en forme de tube en U. Baissez la pipette et immergez sa pointe dans la solution du bain. Pour visualiser clairement la cellule, il faut positionner la pointe de la pipette au-dessus de la gouttelette cytoplasmique de façon à ce que l’ouverture de la pointe soit alignée en diagonale vers la gouttelette.

Abaissez rapidement la pointe de la pipette vers la gouttelette afin qu’elles soient dans le même plan focal. Dès que la pointe de la pipette touche la gouttelette, appliquez une pression négative sur la pipette pour déplacer une partie de la gouttelette dans la pointe et former un joint giga-ohm. Ensuite, soulevez le spermatozoïde de la couverture de la couvre-feuille.

Compensez la transience de capacité parasite en utilisant le mode compensatoire de l’amplificateur avant de passer au mode cellule globale. Effectuez un rodage et la transition vers le mode cellule globale en appliquant une milliseconde d’impulsions de tension croissantes progressivement, combinées à une aspiration très légère. Après l’application de chaque impulsion de tension d’adaptation, lancez l’outil de test à membrane pour vérifier si une capacité transitorielle plus importante apparaît.

Ajustez la plus grande capacité transitoire pour déterminer la capacité de toute la cellule, ainsi que sa résistance d’accès. Après un percément réussi, procéder aux expériences prévues de patch-clamp de cellule entière, telles que l’application de diverses solutions de bain contenant différents composés ou la mesure des activités des canaux à l’aide de protocoles de tension ou de rampe de tension. Les enregistrements CatSper ont été réalisés en établissant un sceau à haute résistance entre la pipette patch et le spermatozoïde des mammifères au niveau de sa gouttelette cytoplasmique.

Les densités des courants CatSper de césium ont été enregistrées à partir de spermatozoïdes neuronaux caudaux sauvages et de spermatozoïdes de neurones caudaux déficients en CatSper. Les spermatozoïdes de différentes espèces sont diverses dans leur morphologie et leurs voies régulatrices internes. Les spermatozoïdes primates et humains présentaient des propriétés et une régulation similaires des canaux CatSper.

Fait intéressant, l’activation de la progestérone de CatSper semble unique chez les spermatozoïdes primates. Les spermatozoïdes de sangliers, de taureaux et de rongeurs n’ont montré aucune altération stimulée par la progestérone de leurs courants CatSper. Chez les spermatozoïdes de taureau et de sanglier, même l’activité basale des canaux CatSper était inférieure aux limites détectables, ce qui suggère que l’afflux de calcium et l’hyperactivation qui en découle sont entraînés par d’autres canaux ou transporteurs, ou qu’un autre stimulateur naturel est nécessaire pour activer leurs canaux CatSper.

Les petites gouttelettes cytoplasmiques lisses, uniformes et pas trop gonflées sont les mieux adaptées au patch-clamp. Vous devriez éviter d’utiliser ces petites gouttelettes cytoplasmiques unilatérales, gonflées et totalement transparentes, car elles entraîneront une étanchéité faible ou inexistante. Cette technique permet l’étude détaillée de canaux d’air spécifiques dans leur système d’expression naturel, et le succès dépend de la qualité des spermatozoïdes variables, des régions pures, des compétences en physiologie intellectuelle de base, de la patience et, surtout, de la persévérance.