Une méthode simple et efficace pour détecter l'activation du facteur nucléaire dans les neutrophiles humains par cytométrie en flux

Cette expérience utilise la cytométrie en flux pour détecter et quantifier les protéines nucléaires dans les noyaux isolés et immunomarqués des neutrophiles afin de purifier les neutrophiles du sang périphérique humain. Retirer les globules rouges avec la dextrine suivi d’une centrifugation du plasma par gradient de densité. Ensuite, à l’aide d’anticorps anti-récepteurs, stimulez les neutrophiles purifiés via des intégrines ou des récepteurs FC.

Procéder à l’isolement des noyaux et fixer les échantillons pour l’immunomarquage avec des anticorps spécifiques contre le facteur nucléaire d’intérêt NU. Par exemple, NF kappa B analyse enfin les noyaux par cytométrie en flux afin de détecter de petits changements dans l’activation du facteur nucléaire. Les résultats obtenus montrent que la stimulation des neutrophiles via leurs intégrines conduit à une augmentation de la concentration nucléaire du facteur de transcription N de kappa B. Les voies de signalisation qui conduisent à l’activation du facteur nucléaire sont généralement étudiées par des tests de gènes rapporteurs ou par des tests de déplacement de mobilité électrophorétique dans les cellules primaires.

Souvent, ces méthodes ne sont pas adaptées. La cytométrie en flux permet de détecter et de quantifier rapidement les protéines nucléaires dans des noyaux isolés. Commencez avec 10 millilitres de sang fraîchement prélevé sur des volontaires adultes en bonne santé.

Pipeter deux millilitres de solution de dextrine T 500 à 6 % dans un tube à centrifuger conique de 15 millilitres. Ajoutez ensuite 10 millilitres de sang mélangé en inversant le tube deux ou trois fois et attendez 45 minutes pour la sédimentation des érythrocytes par gravité dans un tube à centrifuger conique frais de 15 millilitres. Placez cinq millilitres de FI fial pack.

Récoltez le plasma riche en leucocytes qui s’est formé au-dessus des érythrocytes sédimentés. Superposez-le soigneusement sur le paquet de fial pour former deux phases, centrifugez à 516 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant et cassez la pastille de cellule en tapotant le tube contre la grille.

Remettez ensuite les cellules en suspension dans 10 millilitres de PBS froid. Transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger conique de 50 millilitres et centrifugez à 290 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Cassez la pastille cellulaire comme précédemment et ajoutez 10 millilitres de solution hypotonique froide aux érythrocytes de lessive.

Mélangez en remuant doucement le tube pendant exactement une minute. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de mélange de solution hypertonique froide et conservez-le sur de la glace. Énumérez maintenant les cellules après avoir granulé les neutrophiles par centrifugation.

Nous suspendons le PMN à 10 à sept cellules par millilitre. Dans le PBS froid, gardez les cellules sur de la glace. Aliquote 100 microlitres de suspension PMN dans des tubes einor de 1,5 millilitre.

Ajoutez ensuite l’anticorps monoclonal correspondant à 10 microgrammes par millilitre et incubez sur glace pendant 15 minutes. Pour laver les cellules, ajoutez un millilitre de centrifugeuse PBS froide et aspirez le surnageant. Ensuite, cassez doucement la pastille cellulaire et lavez-la deux fois de plus avec du PBS.

Pour éliminer l’anticorps non lié, suspendez à nouveau le PMN lavé dans le même volume initial de PBS chaud contenant 60 microgrammes par millilitre d’incubation d’IgG anti-muse à 37 degrés Celsius pendant une à 20 minutes selon le facteur nucléaire d’intérêt. Ajoutez maintenant un millilitre de PBS froid Après avoir granulé les cellules par centrifugation, retirez le snat et congelez immédiatement les granules de cellules dans un bain d’éthanol de glace carbonique. Pour chaque échantillon, retirez le tube de l’ensemble de glace sèche, nettoyez et réhydratez le bain à l’éthanol.

Suspendre les granulés de PMN congelés dans 100 microlitres de solution hypotonique froide. Placez tous les échantillons sur de la glace pour surveiller l’intégrité des noyaux. Tache d’un Eloqua de la suspension des noyaux avec du bleu trian.

Si la suspension de noyaux contient de nombreuses cellules ou débris intacts, il est préférable de jeter la préparation et de commencer la procédure avec un autre échantillon. Après avoir granulé les noyaux par centrifugation, retirez le surnageant très soigneusement puis fixez les noyaux à 100 microlitres de solution d’aldéhyde paraforme froid à 4 % et incubez les noyaux sur de la glace. Après avoir granulé les noyaux, retirez soigneusement le rince à 100 microlitres de tampon de perméation froide et incubez les échantillons sur de la glace pendant 10 minutes.

Récoltez ensuite les noyaux de perme par centrifugation. À ce stade, les pastilles de noyaux ne se fixent pas bien au fond du tube. Il est recommandé de centrer à nouveau l’avenir.

Pour bloquer les sites de liaison non spécifiques, nous suspendons les noyaux dans 500 microlitres de sérum bovin fœtal froid à 4 % dans du PBS et incubons sur de la glace pendant 20 minutes. Granuler les noyaux par centrifugation, puis remettre en suspension les noyaux et 100 microlitres de PBS froid contenant 4 % de FBS et 2,5 microgrammes par millilitre de l’anticorps monoclonal contre le facteur nucléaire d’intérêt. Incuber les échantillons sur de la glace pendant 20 minutes après avoir lavé les échantillons deux fois avec 500 microlitres de PBS froid avec 4 % FBS, nous suspendons les noyaux dans 100 microlitres de PBS froid contenant 4 % FBS et 10 microgrammes millilitres de l’anticorps secondaire correspondant marqué FZ incuber sur de la glace pendant 20 minutes après deux lavages, remettre les noyaux en suspension dans 400 microlitres de paraldéhyde froid à 4 % dans PBS.

Analysez les noyaux immunomarqués dans un cytomètre en flux, tel qu’un scan de faits ou un appareil similaire. Ajustez les paramètres d’acquisition : deux FSC à l’échelle logarithmique à 10 à moins un, SSC à l’échelle logarithmique à 196 et noyaux de porte dans le graphique d’adoption. Acquérir 10 000 noyaux par échantillon.

Analysez ensuite la fluorescence des noyaux de coloration ajustés à travers le canal FL défini à l’échelle logarithmique à 400. Cette méthode de purification PMN fournit généralement des neutrophiles non stimulés avec une pureté supérieure à 95 % à partir de noyaux PMN sont isolés avec des rendements élevés, isolés à des noyaux, peuvent être facilement reconnus comme une population différente de PMN intacts dans le cytomètre en flux avec un graphique à points lors de la stimulation. En réticulant les intégrines bêta un NF kappa B sont traduites vers le noyau et cette augmentation de NF kappa B nucléaire est détectée comme une augmentation de la fluorescence.

De même, la stimulation de PMN par la réticulation des intégrines bêta deux induit également l’activation de NF kappa B, comme l’indique une augmentation de la fluorescence. La sensibilité de cette méthode permet de détecter de petits changements dans les niveaux de facteurs nucléaires, comme en témoigne le fait que les intégrines bêta un, qui se lient aux protéines de la matrice extracellulaire telles que la fibronectine, induisent une activation NF kappa B plus forte que les intégrines bêta deux, qui se lient aux molécules d’adhésion sur d’autres cellules. Cette méthode présente une grande flexibilité car de nombreux fluorochromes différents peuvent être utilisés et parce qu’elle permet de préparer des noyaux de différents types de cellules, cette approche simple et économique a été utilisée pour les études de transduction du signal qui impliquent des changements de niveaux de protéines dans le noyau d’une variété de types de cellules.