Une méthode simple et efficace pour détecter l'activation du facteur nucléaire dans les neutrophiles humains par cytométrie en flux

Cette expérience utilise la cytométrie en flux pour détecter et quantifier des protéines nucléaires dans des noyaux isolés et marqués par immunofluorescence provenant de neutrophiles, afin de purifier les neutrophiles à partir de sang périphérique humain. Éliminer les globules rouges à l’aide de dextrine, puis réaliser une centrifugation en gradient de densité du plasma. Ensuite, stimuler les neutrophiles purifiés, via les intégrines ou les récepteurs FC, à l’aide d’anticorps dirigés contre des récepteurs.

Procédez à l'isolement des noyaux et fixez les échantillons pour le marquage immunohistochimique à l'aide d'anticorps spécifiques contre le facteur nucléaire NU d'intérêt. Par exemple, NF kappa B, puis analysez finalement les noyaux par cytométrie en flux afin de détecter de légers changements dans l'activation du facteur nucléaire. Les résultats obtenus montrent que la stimulation des neutrophiles via leurs intégrines entraîne une augmentation de la concentration nucléaire du facteur de transcription N de kappa B. Les voies de signalisation menant à l'activation des facteurs nucléaires sont généralement étudiées par des tests de gène rapporteur ou par des tests de migration en électrophorèse sur gel en présence d'anticorps spécifiques dans des cellules primaires.

Souvent, ces méthodes ne sont pas adaptées. La cytométrie en flux permet une détection et une quantification rapides de protéines nucléaires dans des noyaux isolés. Commencez avec 10 millilitres de sang fraîchement recueilli auprès de donneurs adultes en bonne santé.

Prélvez deux millilitres de solution de dextrine T 500 à 6 % dans un tube conique de centrifugation de 15 millilitres. Ajoutez ensuite 10 millilitres de sang en retournant le tube deux ou trois fois, puis laissez sédimenter les érythrocytes par gravité pendant 45 minutes dans un tube conique de centrifugation de 15 millilitres fraîchement préparé. Placez cinq millilitres du conditionnement FI fial.

Récupérez le plasma riche en leucocytes qui s'est formé au-dessus des érythrocytes sédimentés. Superposez-le soigneusement sur le pack de fiole afin de former deux phases, puis centrifugez à 516 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Éliminez le surnageant et dispersez le culot cellulaire en tapotant le tube contre la grille.

Ensuite, resuspendre les cellules dans 10 millilitres de PBS froid. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de centrifugeuse de 50 millilitres et centrifuger à 290 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Disperser le culot cellulaire comme précédemment et ajouter 10 millilitres de solution hypotonique froide pour lyser les érythrocytes.

Mélanger en agitant doucement le tube par de légers mouvements de rotation pendant exactement une minute. Ensuite, ajouter 10 millilitres de solution hypertonique froide et conserver sur de la glace. Ensuite, dénombrer les cellules après avoir mis en pellet les neutrophiles par centrifugation.

Nous suspendons les PMN à 107 cellules par millilitre. Conserver les cellules dans du PBS froid sur glace. Répartir 100 microlitres de suspension de PMN dans des tubes Eppendorf de 1,5 millilitre.

Ensuite, ajoutez l'anticorps monoclonal correspondant à 10 microgrammes par millilitre et incubez sur glace pendant 15 minutes. Pour laver les cellules, ajoutez un millilitre de PBS froid, centrifugez et aspirez le surnageant. Puis redispensez délicatement le culot cellulaire et effectuez deux autres lavages avec du PBS.

Pour éliminer l'anticorps non lié, reprendre les PMN lavés dans le même volume initial de PBS chaud contenant 60 microgrammes par millilitre d'IgG anti-souris, puis incuber à 37 degrés Celsius pendant une à 20 minutes selon le facteur nucléaire d'intérêt. Ajouter ensuite un millilitre de PBS froid. Après avoir centrifugé les cellules pour former un culot, éliminer le surnageant et congeler immédiatement les culots cellulaires dans un bain d'éthanol et de glace sèche. Pour chaque échantillon, retirer le tube du bain d'éthanol et de glace sèche, essuyer soigneusement et reprendre.

Suspendre les pastilles de PMN congelées dans 100 microlitres de solution hypotonique froide. Placer tous les échantillons sur de la glace afin de surveiller l'intégrité des noyaux. Colorer une éloqua de la suspension de noyaux avec du bleu de trian.

Si la suspension de noyaux contient de nombreuses cellules intactes ou des débris, il est préférable de jeter la préparation et de recommencer la procédure avec un autre échantillon. Après avoir mis les noyaux en pellet par centrifugation, retirez soigneusement le surnageant, puis fixez les noyaux dans 100 microlitres de solution fraîche d'aldéhyde paraformique à 4 % et incubez les noyaux sur glace. Après avoir mis soigneusement les noyaux en pellet, retirez le surnageant et ajoutez 100 microlitres de tampon de perméabilisation froid ; incubez les échantillons sur glace pendant 10 minutes.

Ensuite, récolter les noyaux perméables par centrifugation. À ce stade, les pastilles de noyaux ne s'attachent pas bien au fond du tube. Il est recommandé de centrifuger à nouveau.

Si le culot se détache, pour bloquer les sites de liaison non spécifiques, nous suspendons les noyaux dans 500 microlitres de sérum de veau fœtal froid à 4 % dans du PBS et incubons sur de la glace pendant 20 minutes. Centrifuger pour former un culot des noyaux, puis resuspendre les noyaux dans 100 microlitres de PBS froid contenant 4 % de FBS et 2,5 microgrammes par millilitre d'anticorps monoclonal dirigé contre le facteur nucléaire d'intérêt. Incuber les échantillons sur de la glace pendant 20 minutes ; après avoir lavé les échantillons deux fois avec 500 microlitres de PBS froid contenant 4 % de FBS, nous suspendons les noyaux dans 100 microlitres de PBS froid contenant 4 % de FBS et 10 microgrammes par millilitre de l'anticorps secondaire marqué correspondant, incubons sur de la glace pendant 20 minutes ; après deux lavages, resuspendre les noyaux dans 400 microlitres de PBS froid contenant 4 % de paraformaldéhyde.

Analyser les noyaux immuno-marqués sur un cytomètre en flux, tel qu’un cytomètre FACS ou un appareil similaire. Régler les paramètres d'acquisition : FSC en échelle logarithmique à 10 à la puissance moins un, SSC en échelle logarithmique à 196, et sélectionner les noyaux sur un diagramme dot plot. Acquérir 10 000 noyaux par échantillon.

Ensuite, analyser la fluorescence des noyaux marqués avec le colorant fitsy à l’aide du canal FL1, réglé sur une échelle logarithmique à 400. Cette méthode de purification des PMN fournit généralement des neutrophiles non stimulés avec une pureté supérieure à 95 % ; les noyaux de PMN sont isolés avec de hauts rendements, et une fois isolés, peuvent être facilement reconnus comme une population distincte des PMN intacts en cytométrie en flux, sur un diagramme de dispersion, après stimulation. Par réticulation des intégrines bêta1, le facteur NF-kappa B est transloqué vers le noyau, et cet accroissement du NF-kappa B nucléaire est détecté comme une augmentation de la fluorescence.

De même, la stimulation des PMN par le réticulation des intégrines bêta deux induit également l'activation de NF-kappa B, comme en témoigne une augmentation de la fluorescence. La sensibilité de cette méthode permet la détection de faibles variations des niveaux de facteurs nucléaires, comme le montre le fait que les intégrines bêta un, qui se lient à des protéines de la matrice extracellulaire telles que la fibronectine, induisent une activation plus forte de NF-kappa B que les intégrines bêta deux, qui se lient à des molécules d'adhésion présentes sur d'autres cellules. Cette méthode offre une grande souplesse, car de nombreuses fluorochromes différentes peuvent être utilisées, et elle permet la préparation de noyaux provenant de différents types cellulaires ; utilisez cette approche simple et économique pour des études de transduction de signal impliquant des variations des niveaux protéiques dans le noyau d'une grande variété de types cellulaires.