Vivre Imaging test pour évaluer les rôles de Ca ^{2 +} Et Sphingomyélinase dans la réparation des pores formant blessures à toxines

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser le colorant lipophile FM 1 43 dans l’imagerie de cellules vivantes pour mesurer la cinétique précise de l’élimination des toxines de la membrane plasmique. Ceci est accompli en pré-liant d’abord la toxine à quatre degrés Celsius. La deuxième étape consiste à transférer la parabole sur la platine du microscope chauffé et à trouver un plan focal où les cellules peuvent être visualisées.

Ensuite, ajoutez le support préchauffé approprié et commencez immédiatement l’imagerie. La dernière étape consiste à analyser et à quantifier la fluorescence intracellulaire FM 1 43. En fin de compte, ce test sensible peut être utilisé pour évaluer les besoins en calcium, en fingale, en myéline et d’autres facteurs pour la réparation de la membrane plasmique.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la blessure au laser, est que ce test de perméation SLL permet la formation synchronisée de lésions de membrane plasmique de taille très uniforme après le déclenchement de la cellisation. L’imagerie en temps réel de l’afflux de colorant lipophile permet de déterminer avec précision la cinétique de refermeture de la membrane plasmique de manière sensible et très reproductible. Ce test est idéal pour déterminer l’effet de divers agents tels que le calcium et la malase recombinante sur la réparation de la membrane plasmique sans la variabilité associée à d’autres méthodes de blessure de la membrane plasmique.

Pour commencer la procédure de silençage transcriptionnel de la sphingomyéline acide ou d’une graine SM, les cellules heela dans un milieu de croissance DMEM sur des plats à fond de verre de 35 millimètres, incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone le lendemain, au moins une heure avant d’ajouter le mélange de transfection IRNA, aspirez le milieu de culture et remplacez-le par deux millilitres de milieu sérique réduit DMEM. Remettez les cellules dans l’incubateur, préparez quatre tubes pour le mélange d’oligo-transfection de l’ARN SI. La quantité indiquée de réactif est par boîte de 35 millimètres à transfecter dans les tubes A et C, ajoutez 250 microlitres de sérum réduit optimal et quatre microlitres de lipectomie ARNi max dans le tube B.Ajoutez 250 microlitres de sérum réduit Optum et huit microlitres ou 160 picomoles de témoins dans le tube D.Ajoutez 250 microlitres de sérum réduit optimal et huit microlitres ou 160 picomoles de A-S-M-I-A, Incuber les tubes à température ambiante pendant cinq minutes.

Ensuite, combinez les tubes A et B pour former le complexe de transfection pour le contrôle S, irna et les tubes C et D.Pour l’irna A SMS, incubez les réactions à température ambiante pendant 20 minutes. Après 20 minutes, ajoutez lentement chaque mélange de réaction de transfection dans le verre de 35 millimètres correspondant. Les plats inférieurs incuberont à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

24 heures après la transfection, aspirez doucement le milieu et remplacez-le par un milieu de croissance DMEM frais pour une élimination efficace de A SM. Les boîtes doivent être incubées à 37 degrés Celsius et à 5 % de dioxyde de carbone pendant environ 31 heures, pour un total de 55 heures, avant l’imagerie en direct. Les réactifs suivants sont nécessaires pour la microscopie à cellules vivantes, la PO recombinante, la toxine, la streptocoque lysine O ou la solution SLO à une concentration de 100 nanogrammes par microlitre dans du PBS froid sans calcium ni magnésium.

Une solution mère de 25 millimolaires de FM 1 43 dans la solution A de DMSO, qui est de la FM 1 43, diluée dans du DMEM froid avec du calcium jusqu’à une concentration finale de quatre micromolaires et la solution B, qui est de la FM 1 43 diluée dans du DMEM froid sans calcium et de 10 millimolaires EGTA jusqu’à une concentration finale de quatre micromolaires avant l’imagerie de cellules vivantes. Préchauffer des aliquotes d’un millilitre de la solution A et de la solution B dans des microtubes de centrifugation à 37 degrés Celsius. Conservez le DMEM avec du calcium et sans calcium sur de la glace.

Commencez les préparatifs pour l’imagerie de cellules vivantes en remplissant un récipient métallique peu profond de taille moyenne avec de la glace pilée. Retournez-le dans un grand récipient en verre avec de la glace et ajoutez de la glace supplémentaire, en ne laissant que la surface inférieure du récipient métallique exposée. Placez une serviette en papier humide sur le fond métallique exposé pour permettre un transfert thermique uniforme.

Placez un contrôle, un plat à fond en verre traité de 35 millimètres sur l’essuie-tout froid et humide, aspirez doucement tous les supports et lavez-les trois fois avec du DMEM froid sans calcium après le dernier lavage, aspirez tous les supports dans la boîte pour imager la cellule associée FM 1 43 dans les cellules sans SLO blessé en présence de calcium. Ajoutez 180 microlitres de solution froide B dans la lamelle centrale en verre du plat à fond en verre de 35 millimètres et incubez pendant cinq minutes sur de la glace. L’imagerie de cellules vivantes est réalisée à l’aide d’un disque rotatif, d’un système de microscopie confocale et du logiciel d’imagerie approprié.

Le microscope est équipé d’une chambre environnementale pour maintenir la température, l’humidité et les niveaux de dioxyde de carbone. Placez la parabole sur la platine du microscope chauffée à 37 degrés Celsius et replacez le couvercle de la chambre environnementale à l’aide d’une ouverture numérique de 40 fois. 1.3 Objectif.

Trouver le champ de cellules qui seront imagés pour la réussite de l’expérience. Un module de mise au point automatisé sur le microscope pour corriger la dérive thermique pendant l’imagerie est essentiel si disponible. Activez la mise au point parfaite ou un appareil similaire pour corriger la dérive thermique.

Retirez maintenant le couvercle de la chambre environnementale et ajoutez doucement un millilitre de solution préchaude sur le côté de la parabole de 35 millimètres. Replacez le couvercle de la chambre climatique. Le réglage des paramètres d’excitation d’imagerie de FM 1 43 est accompli avec une ligne laser de 488 nanomètres.

L’utilisation d’un filtre dichroïque avec un passe-bande de 488 nanomètres et la discrimination d’émission est obtenue grâce à l’utilisation d’un filtre d’émission 5 à 27, réglez les niveaux de puissance du laser et la sensibilité de la caméra pour obtenir des expositions d’image de 100 millisecondes. Acquérez des images pendant quatre minutes à raison d’une image toutes les trois secondes. Le même protocole général est suivi pour l’imagerie en direct des cellules dans différentes conditions expérimentales avec quelques modifications comme indiqué dans ce tableau pour détecter FM 1 43 dans les cellules témoins traitées à S irna sans blessure SLO en l’absence de préchauffage calcique, la solution B doit être ajoutée sur le côté de la boîte de 35 millimètres.

Au lieu d’appliquer la solution A avant l’imagerie pour mesurer l’afflux de FM 43 dans les cellules témoins traitées par siRNA blessées par SLO en présence de calcium, ajoutez la solution froide B avec SLO à la lamelle de verre centrale de la parabole de 35 millimètres et incubez pendant cinq minutes sur de la glace. Ajoutez ensuite la solution chaude A dans le plat. Le transfert de l’échantillon sur la platine chaude du microscope déclenchera une mauvaise formation transmembranaire pour mesurer l’afflux de FM 1 43 dans les cellules témoins traitées à S irna blessées par SLO En l’absence de calcium, ajoutez la solution froide B avec SLO à la lamelle de verre centrale de la boîte de 35 millimètres et incubez pendant cinq minutes sur de la glace.

Ajoutez ensuite la solution B tiède dans le plat. Pour déterminer le rôle d’un SM dans la réparation de la membrane plasmique, utilisez des cellules traitées à SM irna pour toutes les conditions. Enfin, pour déterminer le rôle des myélines bingo recombinantes extracellulaires sur la cinétique de la réparation de la membrane plasmique, la myéline bingo est ajoutée à la solution chaude A ou à la solution B, puis ajoutée aux cellules.

Lors de l’imagerie de cellules vivantes dans un volume total d’un millilitre après l’acquisition de films, l’intensité de fluorescence intracellulaire de FM 1 43 est mesurée. À l’aide d’un logiciel d’analyse d’images, dessinez une région d’intérêt dans la région cytosolique de chaque cellule sur le terrain et appliquez les outils logiciels pour déterminer l’intensité moyenne de fluorescence FM 1 43 Sur toutes les images de la vidéo, sélectionnez l’acquisition d’échantillon à quantifier dans la liste des séquences d’images à droite, double-cliquez sur l’outil de tampon pour afficher la configuration. Boîte de dialogue du tampon ROI.

Pour l’analyse d’intensité, il est préférable de sélectionner un tampon elliptique. La taille de l’ellipse doit être déterminée empiriquement en fonction de la taille et de la forme de la cellule. Cependant, pour la plupart des cellules de culture tissulaire, une ellipse de quatre micromètres sur quatre est appropriée.

Il est important d’utiliser le même ROI pour chaque séquence d’images à analyser tout au long de la quantification. Ensuite, déplacez le curseur temporel jusqu’au dernier point temporel afin de trouver le point d’intensité maximale à l’intérieur de la cellule avec l’outil tampon. Mettez en évidence le retour sur investissement de chaque cellule, comme illustré.

Remettez maintenant le curseur temporel sur le point temporel zéro, en vous assurant que le retour sur investissement reste dans les limites du choisi pendant toute la durée de l’acquisition. Sélectionnez les mesures. Pour commencer la quantification, un menu déroulant des mesures est maintenant disponible À partir de ce menu déroulant, sélectionnez mesurer tous les points temporels.

Encore une fois, cliquez sur le menu déroulant des mesures et sélectionnez créer un élément de mesure. Une boîte de dialogue apparaît, qui permet de donner un nom aux données en sélectionnant, d’accord, un nouvel élément contenant les données apparaît avec le nom choisi. Répétez cette séquence pour toutes les acquisitions.

Pour l’analyse des données, sélectionnez l’élément de données souhaité dans la liste de droite, sélectionnez l’onglet d’analyse dans la fenêtre de données pour afficher l’élément de menu déroulant d’analyse. Dans le menu déroulant de l’analyse, sélectionnez l’élément de menu Analyser et une boîte de dialogue s’affiche. Six paramètres sont disponibles dans la zone d’analyse de modification.

Le premier ensemble limite l’analyse deux aux ROI. Pour la deuxième case, analyser ces données signifie doit être mis en évidence. La valeur doit être sélectionnée dans la zone Résumé par.

Enfin, le choix des temps R doit être sélectionné pour RO et le choix du nom doit être sélectionné pour la colonne. Une fois ces valeurs définies, cliquez sur OK pour transformer les données en une feuille de calcul avec des valeurs d’intensité par temps. Pour chaque retour sur investissement, les données peuvent également être visualisées sous forme de graphique En sélectionnant l’onglet graphique dans la fenêtre de données, les données peuvent désormais être exportées sous forme de fichier délimité par des tabulations à utiliser dans un programme d’analyse statistique graphique au choix de l’utilisateur. Les résultats représentatifs des expériences démontrées sont présentés ici.

L’afflux du colorant lipophile FM 1 43 a été imagé à raison d’une image toutes les trois secondes pendant quatre minutes, et la fluorescence intracellulaire FM 1 43 a été quantifiée et exprimée comme une augmentation de l’intensité de la fluorescence au fil du temps. Ce premier graphique montre qu’en l’absence de calcium, les cellules témoins traitées à l’ARNi et à l’ARSS A étaient perméables par SLO, ce qui indique qu’une appauvrissement en SM n’interfère pas avec la sensibilité à la toxine. 18 à 27 cellules ont été analysées dans chaque condition et les barres d’erreur correspondent à la moyenne plus ou moins SEM.

Les résultats présentés dans le graphique suivant indiquent qu’en présence de cellules calciques traitées avec un contrôle, S-I-R-N-A ont pu refermer leur membrane plasmique et arrêter l’afflux de colorant tandis que les cellules traitées avec un ARNi SMS n’ont pas réussi à se refermer. De plus, l’ajout exogène de faibles doses de sphingomyéline complète le défaut de la membrane plasmique d’une cellule traitée par SMS irna. 18 à 62 cellules ont été analysées dans chaque condition et les barres d’erreur correspondent à la moyenne plus ou moins SEM Les périodes sélectionnées des films analysés sont montrées dans ces images.

Il est intéressant de noter qu’une récupération complète de la capacité d’une cellule déficiente en SM à se refermer après une exposition à la SLO a été observée avec de faibles concentrations de Flonase cinq et 7,5 microunités par millilitre. Au fur et à mesure que la concentration enzymatique ajoutée au milieu augmentait, il y avait une perte progressive dans le sauvetage. Les cellules phénotypiques exposées à 10 microunités par millilitre ne sont que partiellement bloquées.

L’afflux de FM 1 43. Après l’exposition à SLO et les cellules exposées à 50 microunités par millilitre ont montré un fort afflux de colorant reflétant un défaut de refermeture complète similaire à celui observé dans des cellules appauvries en MS. Ces résultats suggèrent que l’élimination endocytaire des pores SLO est étroitement régulée par les niveaux de céramides générés au niveau de la membrane plasmique.

Par la myéline fcom au-dessus d’un certain niveau, le processus ne se déroule pas normalement et les cellules ne peuvent pas éliminer les lésions. Remarquablement, l’ajout de fluoronase bactérienne aux cellules perméées par SLO en l’absence de calcium a également sauvé la réparation de la membrane plasmique. 18 à 31 cellules ont été analysées dans chaque condition, et les barres d’erreur correspondent à la moyenne plus ou moins SEM observée dans les cellules exposées à la toxine performeuse des pores en présence de calcium uniquement.

De faibles concentrations de sphingomyéline ont été efficaces pour bloquer l’afflux de FM 1 43. Ces résultats indiquent que la flonase fonctionne en aval de l’étape dépendante du calcium de la réparation de la membrane plasmique. Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’avoir une toxine active qui a déjà été testée et titrée pour déterminer la concentration de travail correcte.

Ceci est important car les cycles répétés de congélation et de décongélation peuvent inactiver la toxine SLO. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de tester la membrane plasmique, la réparabilité des cellules et la culture à l’aide d’un test basé sur l’imagerie d’images sensibles en direct qui permet une quantification précise de la cinétique de refermeture de manière très reproductible. Vous apprendrez également à ajouter des agents solubles spécifiques aux cellules pendant la procédure d’imagerie et à évaluer leur effet sur la réparation de la membrane plasmique.