La cartographie du site de liaison d'un aptamère sur ATP utilisant MicroScale thermophorèse

L’objectif global de cette expérience est de caractériser les interactions entre les petites molécules d’aptamères d’ADN, y compris la cartographie des sites de liaison, en utilisant la thermophorèse à l’échelle microscopique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur les paramètres de liaison de base des interactions moléculaires. Le principal avantage de cette technologie est qu’elle est indépendante de la taille du partenaire d’interaction, ce qui permet d’obtenir des données de contrôle de la qualité des interactions difficiles entre les aptamères et les petites molécules.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des interactions entre les petites molécules d’aptamères, elle peut également être appliquée à d’autres interactions moléculaires telles que les interactions médicament-cible ou antigène/anticorps. Pour commencer la procédure, préparez une solution mère de 100 micromolaires de l’aptamère ADN DH25.42 marqué Cy5 dans de l’eau distillée. Ensuite, diluez la solution mère d’aptamère à 200 nanomolaires avec un tampon de liaison.

Incuber la solution de travail de l’aptamère pendant deux minutes à 90 degrés Celsius. Refroidissez la solution à température ambiante sur de la glace. Ensuite, étiquetez et disposez des tubes de microcentrifugation de 200 microlitres à faible liaison pour une dilution en série en 16 étapes du ligand à tester.

Pipette de 20 microlitres d’une solution mère de 10 millimolaires de ligand et de tampon de liaison dans le tube 1. Pipeter 10 microlitres de tampon de liaison dans les tubes 2 à 16. Transférez ensuite 10 microlitres de ligand du tube 1 au tube 2 et mélangez bien avec la pipette.

Transférez 10 microlitres du mélange dilué dans le tube 3 et mélangez bien. Continuez la dilution en série de cette manière, en corrigeant les effets de dilution du tampon si nécessaire, et jetez les 10 microlitres en excès du tube 16 lorsque vous avez terminé. Ajouter 10 microlitres de la solution de travail de l’aptamère à chaque dilution et bien mélanger avec la pipette.

Incuber les échantillons pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, aspirez chaque mélange dans un capillaire standard propre, en veillant à ne toucher le capillaire qu’aux extrémités. Placez les capillaires dans le porte-plateau par ordre décroissant de concentration.

Démarrez l’appareil MST et ouvrez le logiciel de contrôle de l’instrument. Activez le contrôle manuel de la température et réglez la température de l’instrument sur 25 degrés Celsius. Une fois que l’instrument est à la bonne température, insérez le plateau capillaire.

Réglez le canal LED sur rouge pour l’aptamère étiqueté Cy5. Réglez la puissance de la LED pour atteindre un signal de fluorescence de 500 unités. Effectuez ensuite un balayage capillaire pour obtenir les positions capillaires et vérifier la qualité de l’échantillon.

Si les pics résultants sont en forme de U ou aplatis, préparez de nouveaux échantillons dans des capillaires codés pour minimiser les effets de collage. Dans le logiciel de l’instrument MST, indiquez la concentration du ligand et le type de dilution du premier capillaire. Cliquez et faites glisser pour renseigner les concentrations et les dilutions des capillaires restants.

Entrez la concentration de l’aptamère dans le mixage final. Assurez-vous que la méthode d’expérience est réglée pour détecter la fluorescence pendant cinq secondes, enregistrer le MST pendant 30 secondes, puis enregistrer la fluorescence pendant cinq secondes après avoir éteint le laser. Réglez la puissance laser sur 20 %Définissez le chemin d’accès au fichier et enregistrez le fichier d’expérience.

Démarrez ensuite la mesure MST. Obtenez au moins trois mesures de cette manière. Pour commencer l’analyse des données, ouvrez le logiciel d’analyse MST et chargez le fichier d’expérience.

Sélectionnez MST pour le type d’analyse. Le logiciel d’analyse permet de comparer des répétitions techniques où toutes les mesures provenaient du même ensemble de capillaires. Des répétitions biologiques d’un ensemble différent de capillaires peuvent également être ajoutées à l’analyse.

Cliquez sur le bouton d’information sous la première mesure. Inspectez les traces MST à la recherche de bosses ou de pics indiquant des effets d’agrégation ou de précipitation. Ensuite, inspectez le balayage capillaire et la superposition de la forme capillaire pour détecter des pics aplatis ou en forme de U indiquant des effets de collage ou d’absorption.

Comme les agrégats et les effets d’absorption sont rapidement détectables dans les MST, la méthode permet d’optimiser rapidement et rapidement la configuration technique pour garantir une qualité optimale des données. Vérifiez les effets d’extinction ou d’amélioration de la fluorescence dépendants du ligand dans le balayage capillaire et la fluorescence initiale. Inspectez le changement de fluorescence au fil du temps pour détecter des signes de photoblanchiment ou d’amélioration photo.

Une fois la qualité des données vérifiée, passez en mode dose-réponse. Sélectionnez le paramètre d’analyse expert dans la stratégie d’évaluation T Jump MST. Sélectionnez ensuite le modèle de colline pour l’ajustement de la courbe afin de calculer automatiquement les paramètres de liaison.

Dans le menu Comparer les résultats, sélectionnez un type de normalisation. Exportez les données normalisées sous forme de tableur ou de fichier PDF. Dans cette procédure, la MST a été utilisée pour étudier les interactions de liaison d’un aptamère d’ADN simple brin avec une sélection de ligands de petites molécules.

Les courbes MST ont été ajustées à l’aide de l’équation de colline et les valeurs de concentration effective demi-maximale ont été déterminées. Dans cinq mesures biologiques répétées indépendantes de l’aptamère avec ATP, l’interaction de l’aptamère ATP a montré une amplitude de liaison négative de 6 à 13 unités et une valeur moyenne de CE50 d’environ 52,3 micromolaires. Les données de chaque ligand ont été normalisées à la fraction de molécules liées, puis comparées.

Les valeurs EC50 pour l’ADP, l’AMP et la SAM par rapport à l’ATP suggèrent que le nombre de groupes phosphate a tout au plus une influence mineure sur le comportement de liaison de l’aptamère. L’élimination du groupe hydroxal robo C2 n’a également montré qu’un effet mineur sur l’affinité de liaison de l’aptamère. L’aptamère ne s’est pas lié en l’absence d’un groupe d’appariement ou si le groupe d’appariement a été changé en guanine.

L’aptamère s’est lié à l’adénine seule, ce qui indique en outre que le groupe adénine est le principal site de liaison de l’aptamère. Une fois maîtrisée, cette technique peut fournir des informations essentielles sur les paramètres de liaison de base en quelques minutes à quelques heures si elle est correctement exécutée.