Name: La cartographie du site de liaison dun aptamère sur ATP utilisant MicroScale thermophorèse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-07T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Découvrez la cartographie du site de liaison d'un aptamère ADN sur l'ATP par microthermophorèse. Cette méthode quantifie l'affinité et la stœchiométrie indépendamment de la taille des partenaires.

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1. Préparation de l&#39;aptamère de travail Stock <ol><li> Suivez les instructions du fabricant et de dissoudre l&#39;oligonucléotide (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, la séquence de référence 18) dans l&#39; eau, pour atteindre une concentration finale de 100 uM. </li><li> Préparer la solution de travail en diluant aptamère l&#39;oligonucléotide actions pour 200 nM avec un tampon de liaison (Tris 20 mM, pH 7,6, NaCl 300 mM, MgCl2 5 mM, 0,01% de Tween 20). </li><li> Incuber le mélange pendant 2 min à 90 ° C, laisser refroidir l&#39;échantillon immédiatement vers le bas sur la glace, et d&#39;utiliser l&#39;échantillon à température ambiante. </li></ol> 2. Préparation de la dilution de la série Ligand <ol><li> Pour chaque ligand (adénosine triphosphate (ATP), l&#39;adénosine diphosphate (ADP), l&#39;adénosine monophosphate (AMP), l&#39;adénine, la guanosine triphosphate (GTP), cytosine triphosphate (CTP), désoxyadénosine triphosphate (dATP), et S-adénosyl méthionine (SAM) ; 10 mM chacun), préparer une série diluti 16 étapesdans 200 micro-tubes de réaction ul. NOTE: Centrifugation des stocks de ligand pendant 5 min à 14000 xg peut aider à éliminer les agrégats. Faible volume des tubes à faible réaction de liaison sont recommandés pour éviter l&#39;adsorption de molécules sur les parois du tube. </li><li> Commencer avec une concentration maximale d&#39;au moins 50 fois supérieure à l&#39;affinité estimée et réduire la concentration en ligand de 50% à chaque étape de dilution. REMARQUE: L&#39;outil concentration finder mis en œuvre dans le logiciel de contrôle simule les données de liaison et aide à trouver la plage de concentration juste pour la série de dilution. </li><li> Remplir 20 pi de ligand stock (10 mM) dans le tube 1. Ajouter 10 pi de tampon de liaison de l&#39;aptamère dans des tubes de réaction micro 2-16. </li><li> Transfert 10 pi de tube 1 à tube 2 et bien mélanger par pipetage de haut en bas plusieurs fois. Transférer 10 pi au tube suivant et répétez cette dilution pour les tubes restants. </li><li> Jeter l&#39;excès de 10 ul du dernier tube. Évitez tout bUffer effets de dilution. Le tampon dans le tube 1 et 2-16 dans les tubes doivent être identiques. </li></ol> 3. Préparation du mélange final de réaction <ol><li> Préparer les réactions de liaison individuelles avec un volume de 20 pi (10 pi de solution de travail aptamère + 10 pl de la dilution du ligand respectif) afin de minimiser les erreurs de pipetage. Un volume de seulement 4 pi est suf fi sante pour fi ll le capillaire. </li><li> Ajouter 10 ul de la solution de travail 200 nM aptamère à 10 ul de chaque dilution du ligand et bien mélanger par pipetage de haut en bas plusieurs fois. </li><li> Incuber les échantillons pendant 5 min à température ambiante et fi ll les échantillons dans les capillaires classiques en plongeant les capillaires dans l&#39;échantillon. De plus longs temps d&#39;incubation peuvent être nécessaires pour certaines interactions; cependant, 5 minutes est suffisante pour la plupart. Touchez les capillaires que sur les côtés, pas sur la partie centrale, où la mesure optique sera prise. </li><li> Placer les capillaires th SUR DESe plateau capillaire et démarrer le périphérique MST. </li></ol> 4. À partir de l&#39;appareil MST NOTE: Le dispositif fournit deux logiciels pré-installés, le &quot;logiciel pour la configuration technique des conditions expérimentales et de contrôle &#39;&#39; analyse« logiciel pour l&#39;interprétation des données produites. <ol><li> Avant de placer le bac capillaire dans le dispositif MST, démarrez le logiciel de commande et de régler la température globale souhaitée en sélectionnant &#39;&#39; activer le contrôle manuel de la température &quot;dans le &#39;&#39; contrôle de la température&quot; menu déroulant. Ajuster la température à 25 ° C de cette manière. REMARQUE: Les instruments peuvent être MST 22-45 ° C, à température contrôlée. </li><li> Attendez que la température pour atteindre le niveau attendu, puis placer le plateau capillaire dans le dispositif MST. </li><li> Réglez le canal LED &#39;&#39; rouge &quot;pour les colorants Cy5 et ajuster la puissance LED pour obtenir un fl uorescencsignal e de 300 à 1000 unités de fluorescence au niveau du dispositif MST avec un capteur standard. 25% de la puissance LED est utilisé dans cette étude. NOTE: 6.000 à 18.000 unités de fluorescence sont recommandées pour le MST avec un capteur à haute sensibilité. </li></ol> 5. Capillaire Numériser <ol><li> Effectuer une analyse capillaire pour vérifier les différents aspects de la qualité de l&#39;échantillon en choisissant la position capillaire sur le logiciel de «contrôle» et en cliquant sur &quot;start cap scan&quot; avant de commencer la mesure MST. </li><li> Inspecter l&#39;analyse capillaire pour la fluorescence d&#39;amélioration / trempe et les effets de collage (U ou aplatie pics) dans le logiciel. NOTE: Plus de détails sur la détection et la manipulation de la fluorescence et les effets de collage peuvent être trouvés dans la discussion. </li></ol> 6. MST Mesure NOTE: Avant de commencer la mesure MST, assurez-vous d&#39;exclure coller des effets, l&#39;amélioration / effets de trempe, ouerreurs de pipetage, et veiller à ce que l&#39;analyse capillaire indique que le signal de fluorescence est suffisante. Pour plus de détails, voir la discussion. <ol><li> Affecter les concentrations de ligand de la série de dilution à la position respective dans le capillaire &quot;logiciel&quot; &quot;contrôle Considérons l&#39;étape de dilution du mélange de l&#39;aptamère et un ligand. (1: 1). </li><li> Entrez la plus forte concentration de ligand (5 mM) pour capillaire # 1, sélectionnez le type de dilution correct (ici, 1: 1), cliquez sur la concentration maximale, et utiliser la fonction de glisser pour attribuer automatiquement les concentrations restantes dans les capillaires # 2- 16. La concentration la plus faible est 152,6 nm. </li><li> Entrer la concentration de l&#39;aptamère fluorescents (ici 100 nM) dans la section respective du logiciel de commande. </li><li> Utilisez les paramètres par défaut, qui détectent la fl uorescence pendant 5 secondes, enregistrer le MST pendant 30 secondes, et enregistrer la fluorescence pendant encore 5 secondes après l&#39;inactivation du laser t<html> o surveiller la diffusion arrière de molécules. </li><li> Régler la puissance du laser à 20%, dans la partie correspondante du logiciel de commande. NOTE: Afin de recevoir le meilleur rapport signal-bruit et éviter les effets non spécifiques, une puissance laser de 20-40% est recommandé. Dans certains cas, une puissance laser plus élevée peut être nécessaire pour obtenir une bonne séparation des molécules non liées et liées. </li><li> Enregistrer l&#39;expérience après avoir sélectionné le dossier de destination et démarrer la mesure MST en appuyant sur le bouton &#39;&#39; de mesure Démarrer MST &quot;. REMARQUE: Le fichier .ntp sera généré dans le dossier de destination. Grâce à cette configuration, une mesure dure 10-15 min. </li><li> Répétez la procédure expérimentale au moins deux fois pour une détermination plus précise de la valeur CE 50. NOTE: Afin de tester la reproductibilité technique, les mêmes capillaires peuvent être numérisés à plusieurs reprises (répétitions techniques). </li></ol> 7. MST Analyse des données nt &quot;&gt; NOTE: Le logiciel d&#39;analyse permet à l&#39;analyse des données sur la fl y pendant la mesure Le logiciel d&#39;analyse trace les traces de temps MST et des changements dans la normalisation de fluorescence (F norme) par rapport à la concentration de ligand 37.. <ol><li> Démarrez le logiciel d&#39;analyse MST (MO.Affinity Analysis) et charger le fichier .ntp à partir du dossier de destination. Sélectionnez &quot;MST&quot; comme le type d&#39;analyse dans le menu de sélection des données. NOTE: En cas d&#39;effets de fluorescence ligand-dépendante, la fluorescence initiale peut être choisie pour l&#39;analyse. </li><li> Ajouter la course technique ou biologique respective (s) à une nouvelle analyse par glisser-déposer ou en appuyant sur le bouton &quot;+&quot; en dessous de la course expérimentale respective. </li><li> Appuyez sur le bouton d&#39;information ci-dessous la course expérimentale respective pour obtenir des informations sur les propriétés de l&#39;expérience, des traces du MST, analyse capillaire, la forme capillaire, fluorescence initiale, et le taux de blanchiment. NOTE: Ces données brutes peuvent alalors être inspecté dans les étapes ultérieures de l&#39;analyse. </li><li> Inspecter visuellement les traces du MST pour l&#39;agrégation et de précipitation effets, visibles comme des bosses et des pointes. NOTE: Pour plus d&#39;informations sur la détection et le traitement des effets d&#39;agrégation, lisez la discussion. </li><li> Inspecter visuellement l&#39;analyse capillaire et le capillaire forme overlay pour les effets d&#39;adsorption, visible sous forme de pics aplatis ou en forme de U. Inspecter visuellement l&#39;analyse capillaire et la fluorescence initiale pour les effets de fluorescence. Inspecter visuellement le taux de blanchiment pour les effets photoblanchiment. </li><li> Passez en mode dose-réponse et modifier le paramètre d&#39;analyse en mode &quot;expert&quot; en appuyant sur la touche correspondante. Sélectionnez &quot;T-Jump» comme stratégie d&#39;évaluation MST. </li><li> Sélectionnez le modèle &quot;Hill&quot; pour la courbe fi Prép. Les paramètres de liaison seront automatiquement calculés. Normaliser les données en choisissant le type respectif de la normalisation dans le menu &quot;comparer les résultats&quot;. Export de lales données soit en tant .xls ou .pdf. NOTE: Le tableau ci-dessous le graphique de liaison résume les paramètres de liaison calculés. </li></ol>

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Les contrôles de qualité: l&#39;adhérence non spécifique / adsorption de l&#39;échantillon de matériau sur les surfaces, ainsi que des effets d&#39;agrégation, ont une influence considérable sur la qualité des données d&#39;affinité. Cependant, seulement quelques technologies state-of-the-art offrent des options précises et rapides pour surveiller et éviter ces effets. MST offre des contrôles de qualité intégrés qui détectent et aident à surmonter ces problèmes, permettant l&#39;optimisation de...

L&#39;interaction entre les molécules est la base de la nature. Par conséquent, les scientifiques dans de nombreux domaines de la recherche fondamentale et appliquée tentent de comprendre les principes fondamentaux des interactions moléculaires de différents types. MicroScale thermophorèse (MST) permet aux scientifiques d&#39;effectuer la caractérisation précise rapide, rentable et de qualité contrôlée des interactions moléculaires en solution, avec un libre choix de tampons. Il y a déjà plus de 1000 publications en utilisant MST, à partir de 2016 seulement, décrivant les différents types d&#39;analyses, y compris des projections de la bibliothèque, les validations d&#39;événements, des essais de compétition, et les expériences de liaison avec plusieurs partenaires de liaison 1-8. En général, le MST permet l&#39;étude des paramètres de liaison classiques, tels que l&#39;affinité de liaison (pM ​​mM), stoechiométrie, et de la thermodynamique, de tout type d&#39;interaction moléculaire. Un grand avantage de MST est la possibilité d&#39;étudier des événements de liaison indépendants de la taille des partenaires d&#39;interaction. Même chalinteractions lenging entre les petites aptamères d&#39;acides nucléiques (15-30 nt) et des cibles telles que des petites molécules, des médicaments, des antibiotiques, ou métabolites peuvent être quantifiés. Les technologies actuelles state-of-the-art pour caractériser les interactions aptamère-cibles sont soit en laboratoire intense et très complexe ou ne parviennent pas à quantifier les interactions aptamère-petite molécule 9,10. Surface Plasmon Resonance (SPR) à base de dosages 11,12 et approches colorimétriques vraiment sans étiquette, comme Calorimétrie titration isotherme (ITC) 13-15, élution isocratique 16, l&#39; équilibre fi ltration 17,18, en ligne de sondage 19, gel - passer des tests, arrêt - fl ux fl uorescence spectroscopie 20,21, anisotropie de fluorescence (FA) 22,23, une seule molécule fl uorescence imagerie 24,25, et Bio-couche interférométrie (BLI) 26 sont également soit imprécis ou incompatible avec la molécule d&#39;aptamères-petite interactions. Autres principal enjeux de ces méthodes sont une faible sensibilité, une consommation élevée de l&#39;échantillon, l&#39;immobilisation, les limitations de transport de masse sur les surfaces, et / ou des restrictions de mémoire tampon. Seules quelques-unes de ces technologies offrent des contrôles intégrés pour l&#39;agrégation et d&#39;adsorption des effets. MST représente un outil puissant pour les scientifiques de surmonter cette limitation pour étudier les interactions entre les aptamères et les petites molécules 27-29, ainsi que d&#39; autres cibles telles que les protéines 30-33. La technologie repose sur le mouvement de molécules à travers des gradients de température. Ce mouvement dirigé, appelé &quot;thermophorèse,&quot; dépend de la taille, la charge, et la coquille d&#39;hydratation de la molécule 34,35. La liaison d&#39;un ligand à la molécule directement altérer au moins l&#39;un de ces paramètres, ce qui entraîne une mobilité thermophorétique changé. Ligands avec de petites tailles peuvent ne pas avoir un impact considérable en termes de changement de taille de la non liée à l&#39;état lié, mais ils peuvent avoir dr<html> effets Amatic sur la coque et / ou la charge hydratation. Les changements dans le mouvement thermophorétique des molécules après interactions avec le partenaire de liaison permet la quantification des paramètres de liaison de base 2,7,34,36,37. Comme cela est représenté sur la figure 1A, le dispositif MST est constitué d&#39;un laser infrarouge focalisé sur l&#39;échantillon à l&#39; intérieur des tubes capillaires en verre optique en utilisant les mêmes que pour la détection de la fluorescence. Le mouvement thermophorétique de protéines via le fl uorescence intrinsèque de tryptophanes 6 ou d&#39;un partenaire d&#39; interaction 3,8 marqué par fluorescence peut être surveillée tandis que le laser établit un gradient de température (AT de 2-6 ° C). La différence de température dans l&#39; espace, AT, conduit à l&#39;épuisement ou l&#39; accumulation de molécules dans le domaine de température élevée, qui peut être quantifiée par la Soret coef fi cient (S T): g &quot;/&gt; c représente la concentration à chaud dans la région chauffée et froid c est la concentration initiale dans la zone froide. Comme le montre la figure 1B, un exemple typique de résultats expérimentaux MST dans un profil de mouvement MST (trace de temps), composé de différentes phases, qui peuvent être séparés par leurs échelles de temps respectives. La fluorescence initiale est mesurée au cours des 5 premières secondes en absence de gradient de température pour définir la fluorescence de départ précis et pour vérifier photoblanchiment ou photoenhancement. Le saut de température (T-Jump) représente la phase dans laquelle les changements de fluorescence avant le mouvement thermophorétique. Cette diminution initiale de la fluorescence dépend des changements de chaleur dépendant de fl uorophore rendement quantique. La phase de thermophorèse suit, dans laquelle les baisses de fluorescence (ou augmente) en raison du mouvement thermophorétique des molécules jusqu&#39;à ce que la distribution à l&#39;état d&#39;équilibre est atteint.Le tjump inverse et rétrodiffusion concomitante de molécules fluorescents peuvent être observées comme indiqué dans la figure 1B après le laser est éteint. Pour accéder aux paramètres de liaison de base, différents rapports molaires des partenaires d&#39;interaction sont analysées et comparées. En règle générale, 16 rapports différents sont étudiés dans une expérience MST, tandis que la molécule visible optique est maintenue constante et est alimentée avec une quantité croissante du ligand non marqué. L&#39;interaction entre les deux partenaires de liaison induit des changements dans la thermophorèse, et donc dans la fluorescence normalisée, F norme, qui est calculé comme suit: <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55070/55070eq2.jpg" /> F chaud et froid F représentent en moyenne fl intensités uorescence au dé fi nies points de temps des traces du MST. Les affinités de liaison (K d ou CE 50 valeurs) peuvent être calculées par curve montage (figure 1C). Dans l&#39;ensemble, le MST est un outil puissant pour étudier les interactions moléculaires de toute nature. Ce manuscrit propose un protocole pour caractériser l&#39;interaction difficile entre la petite triphosphate molécule d&#39;adénosine (ATP; 0,5 kDa) et le 25-nt court ADNss aptamère DH25.42 (7,9 kDa). Au cours du manuscrit, le site de liaison de l&#39;aptamère sur la molécule d&#39;ATP est mappée vers le bas pour le groupe adénine de l&#39;ATP.

<table><tbody><tr>Tampon <td></td><td></td><td>de liaison d’aptamère</td><td>20 mM Tris pH 7,6 ; 300 mM NaCl ; 5 mM MgCl2 ; 0,01 % Tween-20</td></tr><tr><td>Aptamère ATP marqué par fluorescence</td><td>IDT, Louvain, Belgique</td><td></td><td>séquence : DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich, Allemagne&nbsp ;</td><td>A2383</td><td>10 mM de solutions mères stockées à - 20 &deg ; C</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma Aldrich, Allemagne&nbsp ;</td><td>A2754</td><td>10 mM de solutions mères stockées à - 20 &deg ; C</td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma Aldrich, Allemagne&nbsp ;</td><td>A2252</td><td>10 mM de solutions mères stockées à - 20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma Aldrich, Allemagne&nbsp ;</td><td>A8626</td><td>10 mM de solutions mères stockées à - 20 &deg ; C</td></tr><tr><td>SAM</td><td>Sigma Aldrich, Allemagne&nbsp ;</td><td>A7007</td><td>10 mM de solutions mères stockées à - 20 &deg ; C</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Sigma Aldrich, Allemagne&nbsp ;</td><td>11934511001</td><td>10 mM de solutions mères stockées à - 20 &deg ; C</td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma Aldrich, Allemagne&nbsp ;</td><td>C1506</td><td>10 mM de solutions mères stockées à - 20 &deg ; C</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma Aldrich, Allemagne&nbsp ;</td><td>G8877</td><td>10 mM de solutions mères stockées à - 20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Monolithe NT.115&nbsp ;</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Allemagne</td><td>MO-G008</td><td>Bleu/Rouge Channel Dispositif MST avec détecteur standard, Monolith NT115 pico est un appareil MST avec détecteur haute sensibilité</td></tr><tr><td>Piles Monolith NT.115 Standard</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Allemagne</td><td>MO-K002</td><td></td></tr><tr><td>Tubes PCR Eppendorf</td><td>Eppendorf, Allemagne</td><td>30124537</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de contrôle Monolith. 2.1.33, préinstallé sur l’appareil</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MO.affinity analysis v2.1.1</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph 4.5.2</td><td>Synergy Software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la cartographie du site de liaison d&#39;un aptamère sur atp utilisant microscale thermophorèse

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

La caractérisation des interactions moléculaires en termes de paramètres de liaison de base tels que l’affinité de liaison, la stœchiométrie et la thermodynamique est une étape essentielle en sciences fondamentales et appliquées. La thermophorèse à l’échelle microscopique (MST) est une méthode biophysique sensible permettant d’obtenir ces informations importantes. S’appuyant sur un effet physique appelé thermophorèse, qui décrit le mouvement des molécules à travers des gradients de température, cette technologie permet la détermination rapide et précise des paramètres de liaison en solution et permet le libre choix des conditions tampons (du tampon aux lysats/sérums). La MST utilise le fait qu’une molécule non liée présente un mouvement thermophorétique différent de celui d’une molécule qui est en complexe avec un partenaire de liaison. Le mouvement thermophorétique est altéré au moment de l’interaction moléculaire en raison des changements de taille, de charge et de coquille d’hydratation. En comparant les profils de mouvement de différents rapports moléculaires des deux partenaires de liaison, des informations quantitatives telles que l’affinité de liaison (pM à mM) peuvent être déterminées. Même les interactions difficiles entre des molécules de petite taille, telles que les aptamères et les petits composés, peuvent être étudiées par MST. En utilisant l’interaction modèle bien étudiée entre l’aptamère d’ADN DH25.42 et l’ATP, ce manuscrit fournit un protocole pour caractériser les interactions aptamère-petites molécules. Cette étude démontre que la MST est très sensible et permet de cartographier le site de liaison de l’aptamère de l’ADN de 7,9 kDa à l’adénine de l’ATP.

Dans cette étude, le MST a été appliquée pour caractériser le site de liaison de l&#39;aptamère ADN DH25.42 18 sur l&#39; ATP. Contrairement à d&#39; autres études caractérisant l&#39;interaction de l&#39; ATP ou d&#39; ATP mimant les petites molécules avec des protéines marquées de façon aléatoire avec un ou plusieurs fluorophores 38-40, cette étude comprend une version marquée de l&#39;aptamère 7,9 kDa ADNsb avec une molécule Cy5 sur l&#39;extrémité 5 &#39; . Diff...

La thermophorèse à l’échelle microscopique (MST) est une technologie sensible pour caractériser les interactions aptamère-cible. Ce manuscrit décrit un protocole MST pour caractériser les interactions aptamère-petites molécules.

La cartographie du site de liaison d&#39;un aptamère sur ATP utilisant MicroScale thermophorèse

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

L'objectif général de cette expérience est de caractériser les interactions entre des aptamères ADN et de petites molécules, y compris la cartographie des sites de liaison, à l'aide de la thermophorèse à l'échelle microscopique. Cette méthode permet de répondre à des questions clés concernant les paramètres fondamentaux de liaison des interactions moléculaires. Le principal avantage de cette technologie réside dans son indépendance vis-à-vis de la taille des partenaires d'interaction, ce qui permet d'obtenir des données de contrôle qualité pour des interactions difficiles entre des aptamères et de petites molécules.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les interactions entre aptamères et petites molécules, elle peut également être appliquée à d'autres interactions moléculaires, telles que les interactions médicament-cible ou antigène/anticorps. Pour commencer la procédure, préparez une solution mère de 100 micromolaire de l'aptamère ADN DH25.42 marqué au Cy5 dans de l'eau distillée. Ensuite, diluez la solution mère d'aptamère à 200 nanomolaire avec du tampon de liaison.Incuber la solution d'aptamère pendant deux minutes à 90 degrés Celsius. Refroidir la solution jusqu'à la température ambiante sur de la glace. Ensuite, étiqueter et préparer des tubes microcentrifuges basse fixation de 200 microlitres pour une dilution sérielle en 16 étapes du ligand à tester.Prélvez 20 microlitres d'une solution mère de 10 millimolaire de ligand et de tampon de liaison dans le tube 1. Prélvez 10 microlitres de tampon de liaison dans les tubes 2 à 16. Ensuite, transférez 10 microlitres de la solution mère de ligand du tube 1 vers le tube 2 et mélangez soigneusement à l'aide de la pipette.Transférez 10 microlitres du mélange dilué dans le tube 3 et mélangez soigneusement. Poursuivez la dilution en série de cette manière, en corrigeant les effets de dilution du tampon si nécessaire, et jetez les 10 microlitres excédentaires du tube 16 une fois terminé. Ajoutez 10 microlitres de la solution d'aptamère en travail à chaque dilution et mélangez soigneusement à l’aide de la pipette.Incubez les échantillons pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, aspirez chaque mélange dans une capillaire standard propre, en veillant à ne toucher la capillaire qu'à ses extrémités. Placez les capillaires dans le support de plateau en ordre décroissant de concentration.Démarrez l'appareil MST et ouvrez le logiciel de contrôle de l'instrument. Activez la commande manuelle de la température et réglez la température de l'instrument à 25 degrés Celsius. Une fois que l'instrument a atteint la température correcte, insérez le plateau de capillaires.Réglez le canal LED sur rouge pour l'aptamère marqué au Cy5. Réglez la puissance de la LED afin d'obtenir un signal de fluorescence de 500 unités. Effectuez ensuite une analyse capillaire pour déterminer les positions des capillaires et vérifier la qualité de l'échantillon.Si les pics obtenus ont une forme en U ou sont aplatis, préparez de nouveaux échantillons dans des capillaires codés afin de minimiser les effets d'adhérence. Dans le logiciel de l'appareil MST, renseignez la concentration du ligand et le type de dilution pour le premier capillaire. Cliquez et faites glisser pour indiquer les concentrations et les dilutions des capillaires restants.Saisissez la concentration de l'aptamère dans le mélange final. Assurez-vous que la méthode d'expérience est réglée pour détecter la fluorescence pendant cinq secondes, enregistrer la MST pendant 30 secondes, puis enregistrer la fluorescence pendant cinq secondes après avoir éteint le laser. Réglez la puissance du laser à 20 %. Définissez le chemin du fichier et enregistrez le fichier d'expérience.Ensuite, lancez la mesure de MST. Effectuez au moins trois mesures de cette manière. Pour commencer l'analyse des données, ouvrez le logiciel d'analyse MST et chargez le fichier d'expérience.Sélectionnez MST comme type d'analyse. Le logiciel d'analyse permet de comparer des réplicats techniques où toutes les mesures ont été effectuées sur le même ensemble de capillaires. Des réplicats biologiques provenant d'un ensemble différent de capillaires peuvent également être ajoutés à l'analyse.Cliquez sur le bouton d'information sous la première mesure. Examinez les tracés de MST à la recherche de bosses ou de pics indiquant des effets d'agrégation ou de précipitation. Ensuite, inspectez le balayage capillaire et la superposition de la forme capillaire pour détecter des pics aplatis ou en forme de U, signes d'effets d'adhérence ou d'absorption.Étant donné que les effets d'agrégation et d'absorption sont rapidement détectables en MST, cette méthode permet une optimisation rapide du dispositif technique afin de garantir une qualité optimale des données. Recherchez les effets de modulation de la fluorescence dépendants du ligand (extinction ou amplification) lors du balayage capillaire et dans la fluorescence initiale. Examinez l'évolution de la fluorescence dans le temps afin de détecter des signes de photodégradation ou de photo-amplification.Une fois la qualité des données vérifiée, passez au mode réponse dose. Sélectionnez le paramètre d'analyse experte dans la stratégie d'évaluation T Jump MST. Ensuite, sélectionnez le modèle de Hill pour l'ajustement de courbe afin de calculer automatiquement les paramètres de liaison.Dans le menu de comparaison des résultats, sélectionnez un type de normalisation. Exportez les données normalisées sous forme de fichier tableur ou PDF. Dans cette procédure, la MST a été utilisée pour étudier les interactions de liaison d'un aptamère ADN simple brin avec une série de ligands de petite taille.Les courbes de MST ont été ajustées à l'aide de l'équation de Hill et les valeurs de concentration efficace maximale à 50 % ont été déterminées. Dans cinq mesures biologiques indépendantes répétées de l'aptamère avec l'ATP, l'interaction entre l'aptamère et l'ATP a montré une amplitude de liaison négative de 6 à 13 unités, ainsi qu'une valeur moyenne de CE50 d'environ 52,3 micromolaire. Les données pour chaque ligand ont été normalisées par rapport à la fraction de molécules liées, puis comparées.Les valeurs d'EC50 pour l'ADP, l'AMP et le SAM par rapport à l'ATP suggèrent que le nombre de groupes phosphate a tout au plus une faible influence sur le comportement de liaison de l'aptamère. La suppression du groupe hydroxyle en C2 du ribose a également montré un effet mineur sur l'affinité de liaison de l'aptamère. L'aptamère ne s'est pas lié en l'absence d'une base appariée ou si la base appariée était remplacée par de la guanine.L'aptamère s'est bien lié à l'adénine seule, indiquant davantage que le groupe adénine constitue le site de fixation principal pour l'aptamère. Une fois maîtrisée, cette technique peut fournir en quelques minutes à heures des informations essentielles sur les paramètres fondamentaux de liaison, si elle est correctement réalisée.

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SELEX protocoles comprennent plusieurs tours de sélection, dont chacun nécessite la régénération des ligands, qui exigent à leur tour des séquences d'amorces flanquant les régions fixes bibliothèque aléatoire. Ces séquences d'amorces fixes peuvent interférer avec le processus de sélection (faux positifs et négatifs). Nous présentons ici un apprêt sans protocole.

Primaire-Libre Choix aptamères en utilisant une bibliothèque d&#39;ADN aléatoires

Cette vidéo démontre la thermophorèse à l’échelle microscopique pour l’étude de l’interaction protéine-lipide. Le test détecte l’interaction entre les molécules en quantifiant le mouvement thermophorétique des protéines marquées par fluorescence en réponse à un gradient de température. La molécule fluorescente est mélangée à différentes concentrations de molécules lipidiques non fluorescentes, et le mélange de molécules dans la solution est chargé dans des capillaires. Un gradient de...

Thermophorèse à l’échelle microscopique pour étudier les interactions protéine-lipide en solution

Thermophorèse Microscale (MST) peut être largement utilisé pour la détermination de l'affinité de liaison sans purification de la protéine cible à partir de lysats cellulaires. Le protocole implique une surexpression de la protéine GFP-condensé, la lyse des cellules dans des conditions non dénaturantes, et la détection des signaux HNR en présence de concentrations variables du ligand.

Protein Purification méthode sans la détermination de l&#39;affinité de liaison par thermophorèse Microscale

Un protocole est fourni pour sélectionner des aptamères à commutation de structure pour des cibles à petites molécules sur la base d’une méthode de sélection de billes magnétiques à rigueur accordable. Les aptamères sélectionnés avec des propriétés de changement de structure sont bénéfiques pour les tests qui nécessitent un changement de conformation pour signaler la présence d’une cible, tels que le dosage des nanoparticules d’or décrit.

Une méthode de sélection aptamères Structure commutation Appliqué à un colorimétrique Or nanoparticules Assay

Un protocole de sélection de in vitro et la caractérisation de l’acide phtalique spécifique au groupe ester-liaison ADN aptamères est présenté. L’application de l’aptamère sélectionné dans un aptasensor électrochimique est également incluse.

Phthalic Acid Ester-liaison ADN aptamère sélection, caractérisation et Application d’un Aptasensor électrochimique

La thermophorèse à micro-échelle permet d’obtenir rapidement des constantes de liaison à faible coût matériel. La thermophorèse micro-échelle étiquetée ou sans étiquette est disponible dans le commerce; cependant, la thermophorèse sans étiquette n’est pas capable de la diversité des mesures d’interaction qui peuvent être effectuées à l’aide d’étiquettes fluorescentes. Nous fournissons un protocole pour les mesures de thermophorèse marquées.

Utilisation de la thermophorèse à micro-échelle pour mesurer les interactions protéine-lipide

Ce protocole présente une méthode de mesure de la liaison des nucléotides adénine aux récepteurs en temps réel dans un environnement cellulaire. La liaison est mesurée par le transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET) entre les dérivés nucléotidiques du trinitrophényle et la protéine marquée avec un acide aminé fluorescent non canonique.

Mesure de la liaison des nucléotides aux protéines membranaires fonctionnelles intactes en temps réel

Le présent protocole décrit l’utilisation de la calorimétrie de titrage isotherme (ITC) pour analyser l’association et la cinétique de dissociation de la liaison entre un aptamère d’ADN et la tétracycline, y compris la préparation des échantillons, les étalons et les échantillons, et l’interprétation des données résultantes.

Détermination de l’association thermodynamique et cinétique d’un aptamère d’ADN et d’une tétracycline à l’aide de la calorimétrie de titrage isotherme

Une étape nécessaire dans le développement d’aptamères anticancéreux est de tester sa liaison à la cible. Nous démontrons un test basé sur la cytométrie en flux pour étudier cette liaison, en soulignant l’importance d’inclure un aptamère témoin négatif et des cellules cancéreuses positives ou négatives pour cette protéine particulière.

Essai de liaison à une protéine de surface cellulaire basé sur la cytométrie en flux pour évaluer la sélectivité et la spécificité d’un aptamère anticancéreux

Le présent protocole démontre l’utilisation d’un test d’amplification exponentielle rapide en 3 étapes, basé sur des aptamères, pour détecter des cibles. La préparation des échantillons, l’amplification du signal et le développement de la couleur sont couverts pour mettre en œuvre ce système afin de reconnaître la présence de théophylline par rapport à celle de la caféine.

Détection de cible basée sur des aptamères facilitée par une réaction d’amplification exponentielle isotherme G-quadruplex en 3 étapes

Ce protocole décrit la conception de sondes d’hybridation fractionnée utilisant l’aptamère lumineux fluorescent DAP-10-42 comme rapporteur de signal et leur application pour la détection des acides nucléiques et la différenciation entre les cibles avec des substitutions de nucléotides uniques.

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Découvrez la cartographie du site de liaison d'un aptamère ADN sur l'ATP par microthermophorèse. Cette méthode quantifie l'affinité et la stœchiométrie indépendamment de la taille des partenaires.

La cartographie du site de liaison d'un aptamère sur ATP utilisant MicroScale thermophorèse

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