Name: passivation de surface pour les études de protéines unique molécule (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Découvrez la passivation de surface par double traitement au PEG pour la microscopie de fluorescence à molécule unique. Cette méthode réduit significativement la liaison non spécifique des protéines sur verre.

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DDC, ACH, et CJ ont été soutenus par les subventions de démarrage (ERC-STG-2012-309509) par le Conseil européen de la recherche. J.-MN a été soutenue par la National Research Foundation (NRF) (2011-0018198) de Corée; et le Programme Centre de recherche Pioneer (2012-009586) par la NRF de Corée financé par le ministère de la Science, les TIC, et la planification future (PMD). Ce travail a également été soutenue par le Centre pour la santé BioNano-garde financé par MSIP de Corée que le projet Frontier mondial (H-GUARD_2013-M3A6B2078947). YKL et J.-HH ont été pris en charge par le Programme de bourses de la science Séoul de la ville de Séoul, en Corée. La protéine Rep marqué était un don généreux de M. Sua Myong.

1. Faites glisser Préparation et nettoyage Une chambre microfluidique est composé d&#39;une lame de quartz et une lamelle couvre-objet. Dans de type prisme à réflexion totale fluorescence interne (TIRF) de la microscopie, la surface de la lame de quartz est imagé. Par conséquent, il est important de nettoyer une lame de quartz à fond en utilisant H 2 O, l&#39;acétone, le KOH, et des solutions de piranha. Th est nettoyage multi-étape élimine les molécules organiques fluorescentes sur une surface qui interfèrent avec les mesures de fluorescence de la molécule unique. En outre, la gravure de piranha rend la surface hydrophile de quartz en générant des groupes hydroxyle. Les groupes hydroxyles libres sont essentiels pour la réaction amino-silanisation à l&#39;étape 3. <ol><li> Diapositives forage de quartz. Percer une paire de trous dans une lame de quartz avec un peu de 3/4 mm de forage au diamant (Figure 2a). Si plusieurs canaux sont souhaitées, forer plus pairs de trous (Figure 2b). Ces trous sont utilisés pour l&#39;injection de solutions dans une chambre microfluidique à l&#39;étape 7. <ol><li> Conserver le trépan de forage humide à H 2 O au cours du forage. H 2 O se produit comme lubrifiant, ce qui augmente la durée de vie du trépan de forage. </li><li> Occasionnellement essuyage de la pointe du foret permet de percer des trous. </li><li> Après le perçage des trous, marquer un côté de la lame pour faciliter l&#39;identification pendant le processus de PEGylation. Les marqueurs peuvent être utilisés comme référence pour éviter toute confusion plus tard. Pour le marquage, un bit de forage au diamant peut être utilisé. Ne pas utiliser de stylo depuis l&#39;encre pourrait obtenir sur la surface. </li></ol></li><li> Nettoyage avec H 2 O. Placer les lames dans un pot de peinture sur verre. Typiquement, 5 à 15 diapositives peuvent être placés dans un seul pot. Rincer les lames avec MilliQ H 2 O. Répétez 3 fois et soniquer les diapositives avec MilliQ H 2 O pendant 5 minutes pour enlever la saleté. Jeter l&#39;eau et rincer les lames à nouveau 3 fois avecMilliQ H 2 O. A noter que 130 W est la puissance de sonication utilisé pour ce protocole. Puissance de sonication plus élevée pourrait réduire la durée de vie des lames de quartz. </li><li> Nettoyage avec de l&#39;acétone. Remplacez le MilliQ H 2 O avec de l&#39;acétone. Soniquer les lames avec de l&#39;acétone pendant 20 min ou plus. </li><li> Rinçage à l&#39;H 2 O. Rejeter l&#39;acétone et rincer les lames avec MilliQ H 2 O. Répétez 3 fois afin d&#39;enlever tout résidu de l&#39;acétone. </li><li> Nettoyage avec KOH. Remplacer l&#39;eau avec 1 M KOH et soniquer les diapositives de 20 minutes ou plus. Gravure excessive (par exemple la nuit de traitement de KOH) permettra d&#39;améliorer la qualité de la surface, mais présentera des rayures, ce qui pourrait interférer avec l&#39;imagerie de fluorescence. </li><li> Rinçage à l&#39;H 2 O. Rincer les lames avec MilliQ H 2 O 3 fois pour éliminer les traces de KOH. </li><li> Piranha gravure. <ol><li> Placer les lames dans un support de diapositives Duran ou un titulaire de téflon sur mesure et place-les dans un bêcher (1 litre) qui se trouve dans une hotte chimique. </li><li> Remplir le bécher avec 450 ml d&#39;H 2 SO 4. </li><li> Ajouter 150 ml d&#39;H 2 O 2 à 03 heures 01 rapport entre H 2 SO 4 et H 2 O 2. Une fois la solution commence à bouillir spontanément, la température augmente de plus de 90 ° C. Assurez-vous que la solution H 2 O 2 est à la température ambiante avant de commencer la réaction. Dans le cas contraire, la température de la solution d&#39;ébullition peut être inférieure à 90 ° C. </li><li> Agiter la solution pour un bon mélange et laissez reposer pendant le bécher 20 min. </li><li> Prenez les diapositives de la solution de piranha avec le support de diapositives, et les mettre dans un support de diapositives contenant MilliQ H 2 O. Pendant ce temps, jetez la solution piranha dans une bouteille de déchets désignés une fois qu&#39;il atteint la température ambiante. </li><li> Rincer les lames 3 fois avec MilliQ H 2 O. Un soin particulier doit être pris en outre steps pour éviter toute contamination possible des diapositives. Continuer à l&#39;étape 3. Il est conseillé de procéder immédiatement aux étapes suivantes. * Attention: La solution de piranha est extrêmement réactif. Lors de la manipulation de cette solution prudence devrait être prise. En outre, lorsque, par erreur en mélange avec des solvants organiques tels que l&#39;acétone, il peut provoquer une explosion. </li></ol></li></ol> 2. Coverslip nettoyage Une chambre microfluidique est composé d&#39;une lame de quartz et la lèvre de couverture. Lorsqu&#39;un microscope TIRF de type prisme est utilisé, la surface d&#39;une lamelle couvre-objet n&#39;est pas imagée. Par conséquent, il suffit de nettoyer une lamelle couvre uniquement avec H 2 O et KOH. Dans le cas d&#39;une lamelle couvre-objet doit être imagée (par exemple par l&#39;intermédiaire de la microscopie TIRF du type à objectif), il est recommandé de traiter les lamelles avec une solution piranha (étape 1.7). Notez que si PEGylation de la surface de la lamelle n&#39;est pas de haute qualité, il peut agir comme un puits pour les protéines d&#39;und donner lieu à des variations de la concentration en protéines. <ol><li> Rinçage à l&#39;H 2 O. Placer les lamelles (24 x 30, 24 x 40 ou 24 x 50 mm 2) dans un bocal de verre de coloration. Typiquement, 5 à 15 lamelles couvre-objet peuvent être placées dans un seul pot. Rincer les lamelles 3 fois avec le MilliQ H 2 O. </li><li> Nettoyage avec KOH. Remplacer l&#39;eau par du KOH 1 M et soniquer les lamelles pendant 20 minutes ou plus. </li><li> Rinçage à l&#39;H 2 O. Rincer les lamelles 3 fois avec de l&#39;H 2 O MilliQ pour éliminer les traces de KOH. Passez à l&#39;étape 3. </li></ol> 3. Amino-silanisation des lames et lamelles couvre- La fonctionnalisation de la surface des lames de quartz et les lamelles couvre-objet avec un groupe amine par l&#39;intermédiaire de la chimie amino-silanisation. Le méthanol est utilisé comme solvant et l&#39;acide acétique en tant que catalyseur pour la réaction amino-silanisation. <ol><li> Rinçage avec du methanol. Remplacez le MilliQ H 2 O dans les bacs de coloration (de Steps 1 et 2) avec du méthanol. Gardez les lames et les lamelles dans du méthanol avant l&#39;étape 3.3. Ne pas stocker les lames et les lamelles dans du méthanol pour une inutilement longue période de temps (par exemple plusieurs heures) depuis impuretés dans le méthanol sera adsorber à la surface. </li><li> Préparation solution d&#39;amino-silanisation. <ol><li> Rincer un ballon en Pyrex plusieurs fois avec du methanol. Soniquer le flacon avec du methanol pendant 5 minutes, ou plus longtemps. Il est conseillé d&#39;avoir un ballon dédié qui est maintenu propre. </li><li> Verser 100 ml de methanol dans le ballon. </li><li> Ajouter 5 ml d&#39;acide acétique. </li><li> Ajouter 3 ml de APTES (3-aminopropyltriméthoxysilane) et mélanger doucement en le secouant. </li></ol></li><li> Amino-silanisation. Remplacer le méthanol dans les bacs de coloration contenant les diapositives et les lamelles couvre-objet avec le mélange réactionnel d&#39;aminosilanization. <ol><li> Incuber pendant 20-30 min. Pendant l&#39;incubation, une fois sonication pendant 1 min. </li></ol></li><li> Rinçage avec du methanol. Remplacer la uneréaction de minosilanization avec du methanol. Écarter le méthanol et ajouter une solution de méthanol frais. Répétez cette procédure trois fois. </li></ol> 4. Passivation de surface en utilisant un polymère (premier tour) Passivation de la surface d&#39;aminé revêtu de lames de quartz et des lamelles couvre-objet en conjuguant NHS-ester de polyéthylène glycol (PEG). Cette réaction est effectuée avec la concentration de saturation de la solution de PEG à pH 8,5 pendant une nuit. <ol><li> Séchage des diapositives et des lamelles. Sécher les lames et les lamelles couvre-objet à l&#39;aide de N 2 gazeux et de les placer dans des boîtes de pipette propre d&#39;une manière telle que le côté qui doit être pégylée est orientée vers le haut. La boîte de pipette est partiellement rempli avec MilliQ H 2 O. Ce milieu humide empêche solution de PEGylation de sécher pendant la nuit d&#39;incubation. </li><li> Préparation de tampon de réaction. Préparer 0,1 M de tampon frais de bicarbonate de sodium (pH 8,5) en dissolvant 84 mg de bicarbonate de sodium dans 10 ml d&#39;MilliQ H 2 O. Il n&#39;y a pas besoin d&#39;ajuster le pH. Cette solution peut être conservé congelé pour la prochaine utilisation (par exemple de l&#39;étape 6.1). </li><li> Préparer une solution de PEGylation. <ol><li> Préparer un mélange de PEG de 0,2 mg biotinylés NHS-ester de PEG (5000 Da) et 13 8 mg de NHS-ester de mPEG (5000 Da) dans un tube de 1,5 ml. Lors de la préparation de N nombre de diapositives, la préparation de N fois plus grande quantité du mélange de PEG dans un seul tube. </li><li> Ajouter 64 ul de N fois (ou 64 ul de N nombre de lames) de la mémoire tampon fraîchement préparé (étape 4.2). Introduire à la pipette de haut en bas afin de les dissoudre complètement. </li><li> Centrifugeuse avec 16 100 g pendant 1 min pour éliminer les bulles d&#39;air. Ne pas pipeter par la suite. Sinon, les bulles d&#39;air se forment qui interfèrent avec la PEGylation à l&#39;étape 4.4. </li></ol></li><li> PEGylation. <ol><li> Déposer 70 ul du mélange de PEGylation à une lame de quartz séché obtenu à l&#39;étape 4.1. Utilisez 90 pi en cas de 24 x 50 mm 2 coverslip. </li><li> Placez délicatement une lamelle séchée de l&#39;étape 4.1 sur la solution. </li><li> Pour avoir un uniforme et de haute qualité de PEGylation, prendre soin de ne pas introduire de bulles d&#39;air. En raison de la tension superficielle, la plupart des bulles d&#39;air peuvent spontanément laisser le volume de réaction dans les cinq minutes en raison de la tension superficielle. </li><li> Incuber les lames dans un environnement sombre et humide. La demi-vie de NHS-ester que l&#39;on utilise du PEG à un pH de 8 est d&#39;environ une heure. Au minimum, les incuber pendant 2 heures. Incubation pendant une nuit conduit à la meilleure qualité de PEGylation (données non présentées). </li></ol></li></ol> 5. Stockage à long terme Stockage des diapositives et des lamelles en N 2 PEGylés à -20 º C. <ol><li> Séchage des diapositives et des lamelles. Démonter délicatement la lame et la lamelle en faisant glisser la lamelle à un côté, les rincer à l&#39;eau MilliQ H 2 O, et les sécher avec N 2. </li><li> Stockage des diapositives et des lamelles. For une utilisation immédiate, suivez la procédure pour le second tour de PEGylation (étape 6). Afin de stocker pour une longue période de temps, suivre les étapes suivantes. <ol><li> Placer une paire de la lame et la lamelle couvre-objet dans un tube de 50 ml de telle sorte que les surfaces PEGylées sont confrontés à une distance l&#39;une de l&#39;autre. </li><li> Fermer partiellement le tube, le tube sous vide, puis le remplir avec N 2. Ces étapes permettent de préserver la surface pégylé pendant une longue période de temps. Visser hermétiquement le tube et le stocker à -20 ° C. La qualité des lames reste bonne pour 3 mois (Figure 3a, à droite). </li></ol></li></ol> 6. Passivation de surface en utilisant un polymère (le second tour) Série supplémentaire de PEGylation pour rendre la couche plus dense de PEG et également pour étancher tous les groupes amine qui restent sur ​​la surface. L&#39;utilisation de courts molécules NHS-ester de PEG (333 Da) peut être efficace en pénétrant dans une couche de PEG existant. Il est recmandé de faire de ce second tour de PEGylation droit avant d&#39;utiliser une diapositive. <ol><li> Préparation de tampon de réaction. Préparer 0,1 M de tampon frais de bicarbonate de sodium (pH 8,5). La solution congelée de l&#39;étape 4.2 peut aussi être utilisé. </li><li> Préparer une solution de PEGylation. Dissoudre 7 ul de 250 mM MS4-PEG dans 63 ul du tampon de bicarbonate de sodium. </li><li> PEGylation. Suivez la même procédure que dans l&#39;étape 4.4. Incuber pendant 30 min jusqu&#39;à la nuit. </li><li> Séchage des diapositives et des lamelles. Démonter la paire de la lame et la lamelle, rincez-les avec MilliQ H 2 O, les sécher avec N 2, et de les conserver dans une boîte de pipette propre. Procéder à l&#39;assemblage d&#39;une chambre microfluidique à l&#39;étape 7. </li></ol> 7. Assemblage une chambre microfluidique Assemblage d&#39;une chambre microfluidique en utilisant une paire d&#39;une lame de quartz pégylé et une lamelle couvre-objet. Ruban adhésif double face collante est utilisé comme une entretoise. La chambre est scellé avec de la colle époxy et, silutions sont introduits à travers les trous de la lame de quartz. <ol><li> Placer une lame de quartz sur une surface plane avec le côté orienté vers le haut pégylé. </li><li> Faites un canal (largeur de 5 à 7 mm) en diagonale sur la surface pégylé en mettant rubans adhésifs double face collante sur la lame. Assurez-vous que les trous sont positionnés au centre du canal. Prenez soin de ne pas abîmer la surface pégylé pendant le processus de fabrication d&#39;une chambre. Il est possible de réaliser une glissière à canaux multiples en plaçant et en collant les bandes adhésives double face différente (voir figure 2). </li><li> Placez délicatement une lamelle pégylé sur le dessus pour compléter la chambre. Le côté pégylé doit être orientée vers le bas. </li><li> Étanchéité de la chambre en appuyant sur la lamelle sur la zone où rubans adhésifs double face sont placés. Faites-le doucement mais complètement de sorte que la chambre se transforme en eau-étanche. </li><li> Fermer les bords de la chambre avec de la colle époxy. </li><li> Immobiliser streptavidine ou neutravidine sur laPEG biotinylé couche en ajoutant 50 ul de 0,1 mg / ml de solution de streptavidine ou de neutravidine à T50 (10 mM Tris-HCl, tampon mM de NaCl [pH 8,0] 50) à l&#39;aide d&#39;une pipette de p200. Après 1 min d&#39;incubation, rincer avec 100 pi de tampon T50. </li><li> Ajouter molécules biologiques biotinylés pour votre imagerie seule molécule. </li></ol> 8. Faites glisser le recyclage Recyclage des lames de quartz. Diapositives utilisées sont recyclées en enlevant les lamelles et les rubans adhésifs double face collante. <ol><li> Après utilisation, stocker les chambres dans l&#39;eau du robinet. Incubation à long terme dans l&#39;eau facilite le démontage des chambres. </li><li> Faire bouillir les chambres dans l&#39;eau du robinet à l&#39;aide d&#39;un micro-ondes. Utilisez un bécher en Pyrex. Faire bouillir pendant 10 minutes ou plus. </li><li> Enlevez les lamelles et les bandes adhésives double face en utilisant une lame de rasoir. Ne pas appuyer sur une lame de quartz perpendiculaire à son plan. Sinon, il se casse. Garder la lame de rasoir à une distance à partir du canal. Otherwise, il introduit les rayures sur le canal. </li><li> Rincer les lames à l&#39;aide d&#39;un détergent ménager en les frottant avec les doigts. </li><li> Placer les lames dans un pot de peinture sur verre. Typiquement, 5 à 15 diapositives peuvent être placés dans un seul pot. Ajouter 10% de détergent ménager et soniquer les diapositives de 20 minutes ou plus. Rincer les lames avec une grande quantité de l&#39;eau du robinet. </li><li> Passez à l&#39;étape 1.2. </li></ol>

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Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Les étapes critiques de ce protocole Il est essentiel de faire la surface hydrophile avant la réaction amino-silanisation. Ceci a été réalisé grâce à la gravure de piranha qui génère des groupes hydroxyles libres sur une surface de verre / quartz. Il est recommandé de ne pas garder la surface gravée de piranha exposée sur H 2 O ou de l&#39;air pendant une longue période de temps depuis l&#39;hydrophilie de la surface descend progressivement. Les molécules de PEG NHS-ester sont réactifs. Il est conseillé de faire des aliquotes et stocker sous azote en -20 º C. La durée de conservation du produit chimique APTES à la température ambiante est faible. Il est conseillé de le remplacer par un nouveau chaque mois. Modifications de ce protocole Lorsque vous ne pouvez pas utiliser la gravure de piranha pour toute raison pratique, vous pouvez graver à l&#39;aide de KOH pendant une longue période de temps (par exemple, overnight), qui fera également des groupes hydroxyles exposés. L&#39;écueil de cette approche alternative est que la lame devient inutilisable après quelques recyclages en raison de fortes égratignures. Il est souvent pratiqué pour brûler une surface de verre / quartz à l&#39;aide chalumeau au propane, qui est efficace pour éliminer les matières organiques fluorescentes 7. Cette procédure n&#39;a pas été inclus dans ce protocole car il est redondant de la gravure de piranha. Notez que cette procédure sera potentiellement conduire à une oxydation des groupes hydroxyle. Par conséquent, cette procédure ne devrait pas être effectuée une fois par surface a été gravé en utilisant KOH ou solution piranha. Quand un tampon avec un pH inférieur à 7 est utilisé pour l&#39;imagerie de molécule unique, la conformation de PEG passe de &quot;champignon&quot; à &quot;brosse&quot;, ce qui réduit le degré de passivation. Par conséquent, quand un pH inférieur à 7,0 est utilisé, il est recommandé en outre pour passiver la surface en utilisant le tartrate de disuccinimidyle &lt;sup&gt; 7. Perspectives Ce travail a fourni un protocole robuste pour atteindre la surface de haute qualité passivation. Ce protocole sera utile pour les études de fluorescence d&#39;une seule molécule qui sont impliqués dans 14 des protéines ainsi que des complexes de protéines à l&#39;intérieur des extraits cellulaires et les immunoprécipités 15. Il sera largement utilisé pour d&#39;autres techniques d&#39;une seule molécule comme la spectroscopie de force et de spectroscopie de couple 16. Il sera également utile pour la prévention de l&#39;adsorption des cellules sur une surface 17. Le protocole prévu dans ce travail est exigeant pour ses procédures en plusieurs étapes. passivation de surface en utilisant des lipides-PEG 8 et poly-lysine PEG 9 sont disponibles comme une approche alternative. Depuis, ils ne nécessitent pas de réactions chimiques, il est facile à mettre en œuvre. Cependant, le degré de passivation n&#39;est pas aussi élevée que celle obtenue par l&#39;intermédiaire chimique modification d&#39;une surface.

Lors d&#39;une étude de la protéine seule molécule, il est essentiel de parvenir à une qualité de passivation de surface de sorte que l&#39;expérience est libre de tout dysfonctionnement de la protéine induite en surface ou dénaturation 1,2. Bien que d&#39;une surface de verre traitée avec des agents tensioactifs, tels que l&#39;albumine de sérum bovin, est couramment utilisé pour une seule molécule d&#39;études de l&#39;acide nucléique 3, le degré de sa passivation n&#39;est pas assez élevé pour des études de protéines. Une surface de verre revêtue de polymère (polyethylene glycol, PEG) est supérieure à la 4-6 de la performance de passivation. Ainsi, il est devenu universellement utilisé pour les études de protéines mono-molécule depuis qu&#39;il a été introduit à une étude de la fluorescence de molécules simples 7-10. La procédure de revêtement de polymère nécessite plusieurs traitements de surface 7,11,12. Par conséquent, il est difficile de suivre la procédure entière sans instructions détaillées. Souvent, le degré de passivation de surface varie selon le protocole is suivi. Nous présentons ici un protocole robuste, étape par étape les instructions, ce qui éliminera l&#39;un des principaux goulets d&#39;étranglement d&#39;études de protéines d&#39;une seule molécule. Voir la figure 1 pour une présentation.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Préparation et nettoyage des lames </forte></td></tr><tr><td>acétone</td><td>Sigma</td><td>32201</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR</td><td>631-0136 631-0144 631-0147</td><td>24 x 32 mm2, 22 x 40 mm2, 24 x 50 mm2 ( N°1&frac12 ;, Rectangulaire)</td></tr><tr><td>Forets diamantés</td><td>MTN-Giethoorn, Pays-Bas</td><td>LA-0564-00DB</td><td>3/4 mm</td></tr><tr><td>Duran</td><td>Slide Holder LGS, Pays-Bas</td><td>213170003</td><td></td></tr><tr><td>Plats de coloration en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>300101</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Boom</td><td>6233905</td><td>1 L, peroxyde d’hydrogène 30 %. Les bouteilles ouvertes doivent être conservées à 4 °C.</td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Boom</td><td>80900627.9010</td><td>Acide sulfurique 95-98 %</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>30603</td><td>Hydroxyde de potassium</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td></td><td>Nettoyeur à ultrasons de table, 3510</td></tr><tr><td>Lames de quartz</td><td>Finkenbeiner</td><td></td><td>1 » x 3 », 1 mm d’épaisseur</td></tr><tr><td colspan="4">2. Nettoyage de lamelles</td></tr><tr><td>Duran slide holder</td><td>LGS, Pays-Bas</td><td>213170003</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>30603</td><td>Sonicator à hydroxyde de potassium</td></tr><tr><td></td><td>Branson</td><td></td><td>Nettoyeur à ultrasons de table, 3510</td></tr><tr><td colspan="4">3. Amino-silanisation des lames et lamelles </forte></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Sigma</td><td>320099-500ML</td><td>Acide acétique, glacial</td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778-100ML</td><td>3-aminopropyl trimethoxysilane. Conserver à température ambiante sous N2. Remplacez-le une fois par mois.</td></tr><tr><td>Flacon (200 ml)</td>Flacon <td>VWR</td><td>(200 ml)</td><td>Flacon en pyrex. Ayez un flacon dédié à l’aminosilanisation.</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td></td><td>Nettoyeur à ultrasons de table, 3510</td></tr><tr><td colspan="4">4. Passivation de surface à l’aide d’un polymère (premier tour)</fort></td></tr><tr><td>Biotine-mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SVA-5000-100mg</td><td>Biotin-PEG-SVA, MW 5,000&nbsp ;Da. Stocker des aliquotes de 1-2 mg (assez pour 10 lames) à -20 &deg ; C sous N2.</td></tr><tr><td>mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000-1g</td><td>mPEG-succinimidyl valérate (SVA), MW 5 000 Da. Stocker des aliquotes de 80 mg (assez pour 10 lames) à -20 &deg ; C sous N2.</td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>de sodium Sigma</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fort>5. Passivation de surface (le deuxième tour)</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>Dimethyl sulfoxide BioReagent, pour la biologie moléculaire, &ge ; 99,9 %</td></tr> <tr><td>DST</td><td>Pierce</td><td>20589</td><td>Tartarate de disuccinimidyle</td></tr><tr><td>MS4-PEG</td><td>Pierce</td><td>22341</td><td>PEG court NHS-ester, MW 333 Da. Dissoudre 100 mg de MS4-PEG dans 1,1 ml de DMSO. Magasin 20 & micro ; l aliquotes à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>de sodium Sigma</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fort>6. Assemblage d’une chambre microfluidique</forte></td></tr>Double <tr><td>ruban adhésif</td><td>Scotch</td><td></td><td>10 mm de large</td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>Thorlabs</td><td>G14250</td><td>Devcon 5 minute epoxy</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-1 KG</td><td>Chlorure de sodium</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Pierce</td><td>31000</td><td>ImmunoPure NeutrAvidin Biotin-Binding protein. Stock en 5 mg/ml dans H2O à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>S-888</td><td>Stock 5 mg/ml en H2O ou T50 à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Socle Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1 KG</td><td>Tris</td></tr></tbody></table>

passivation de surface pour les études de protéines unique molécule

Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies

Spectroscopie de fluorescence seule molécule s&#39;est avérée être un rôle déterminant dans la compréhension d&#39;un large éventail de phénomènes biologiques à l&#39;échelle nanométrique. Des exemples importants de ce que cette technique peut donner aux sciences biologiques sont les idées mécanistes sur protéine-protéine et les interactions protéine-acide nucléique. Lorsque les interactions des protéines sont sondés au niveau d&#39;une seule molécule, les protéines ou leurs substrats sont souvent immobilisés sur une surface de verre, ce qui permet une observation de longue durée. Ce système d&#39;immobilisation peut introduire des artefacts de surface indésirables. Par conséquent, il est essentiel pour passiver la surface du verre pour le rendre inerte. Revêtement de surface à l&#39;aide de polyéthylène glycol (PEG) se distingue par sa haute performance en matière de prévention de l&#39;interaction des protéines de manière non spécifique avec une surface de verre. Toutefois, la procédure de revêtement de polymère est difficile, en raison de la complication résultant d&#39;une série de traitements de surface et l&#39;exigence stricte que la surface doitêtre exempt de toutes les molécules fluorescentes à la fin de la procédure. Ici, nous fournissons un protocole robuste avec des instructions étape-par-étape. Il couvre le nettoyage de surface comprenant la gravure piranha, une fonctionnalisation de la surface avec des groupes amine, et enfin revêtement PEG. Pour obtenir une haute densité d&#39;une couche de PEG, nous introduisons une nouvelle stratégie de traitement de la surface avec des molécules de PEG à deux tours, ce qui améliore remarquablement la qualité de passivation. Nous fournissons des résultats représentatifs ainsi que des conseils pratiques pour chaque étape critique de sorte que n&#39;importe qui peut obtenir la qualité de surface passivation élevé.

Après le montage de la chambre microfluidique (étape 7.1 à 7.6) et avant de procéder à l&#39;étape 7.7, il est conseillé d&#39;effectuer le contrôle de la qualité de la surface pégylé. Si la passivation de surface a été effectué avec succès, il existe moins de 10 manière non spécifique des protéines adsorbées par unité de surface de formation d&#39;image (25 mm x 25 mm) observée lorsque 1-10 nM de protéine marqué par fluorescence est ajoutée dans la chambre (figure 3a, à gauche). Lorsque l&#39;une des étapes de nettoyage ou de réaction n&#39;a pas été correctement effectué, le nombre de non-spécifiquement adsorbé protéines augmente de façon significative, et l&#39;écran de CCD peut être saturé par des signaux de fluorescence. Par exemple, si la gravure de piranha est sauté, il est 100 fois plus grande quantité d&#39;une adsorption non spécifique observée (Figure 3a; compare gauche avec du milieu). Lorsque la deuxième étape de PEGylation est sauté, il y avait environ 3 foissa plus grande quantité d&#39;adsorption non spécifique observée (Figure 3b). Un faible degré de PEGylation est observée lorsque les produits chimiques périmés (par exemple APTES conservés à température ambiante pendant plusieurs mois) sont utilisés (données non présentées). La qualité de la surface diminue également vers le bas quand une quantité importante de temps a passé depuis qu&#39;il était pégylé (Figure 3a; comparer gauche à droite). À notre connaissance, c&#39;est la première fois que les deux séries de PEGylation sont introduits pour les études d&#39;une seule molécule. Les deux tours de PEGylation garantissent la plus haute qualité de PEG formation de la couche (Figure 3b). La nature supérieure de la double PEGylation est en évidence montré dans les films (Film 1a Comparer avec Movie 1b). Dans ces films, les signaux de fond à partir de molécules fluorescentes en solution sont observés à être beaucoup plus faible lorsque la double PEGylation était<html> utilisés, ce qui indique que les protéines sont repoussés de manière plus efficace par la couche doublement PEGylated. Bien que ce processus en deux étapes est fortement conseillé, la deuxième étape de PEGylation peut être ignorée si votre expérience est tolérable de passivation non optimale. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1:. Schématique des traitements de surface (a) une lame de microscope est nettoyé avec de l&#39;acétone, KOH, et des solutions de piranha. Il est fonctionnalisé avec APTES et pégylé avec NHS-ester PEG. (B) Une lamelle couvre-objet est nettoyé avec du KOH, ainsi qu&#39;avec la solution piranha, si nécessaire. Il est fonctionnalisé avec APTES et pégylé avec NHS-ester PEG. fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figure 2:. Chambre microfluidique (a) Une chambre à canal unique. La lame porte-objet comporte deux trous forés. Il est monté avec une lamelle en utilisant deux tranches d&#39;un ruban adhésif double-face collante. (B) Une chambre à trois canaux. La lame de microscope a six trous percés. Il est monté avec une lamelle en utilisant quatre tranches d&#39;un ruban adhésif double-face collante. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3: les images CCD prises avec des protéines marquées par un colorant en solution. (A) des images CCD ont été prises par type prisme totale fluorescence à réflexion interne microscopie en utilisant un objectif 60x avec 10 nM Cy3 labeld représentant en solution. (Gauche) Une surface a été préparé suivant le protocole dans cet article. (Moyen) Une surface était préparationrouge suivant le protocole dans cet article, mais piranha gravure a été sautés. (À droite) Une surface a été préparé suivant le protocole dans cet article et stocké pendant 3 mois à -20 ° C sous atmosphère d&#39;azote. (B) les images CCD prises avec 10 nM Cy3 labeld représentant en solution. (Gauche) Une surface a été préparé suivant le protocole dans cet article. (À droite) Une surface a été préparé suivant le protocole dans cet article, mais le second tour de PEGylation a été ignorée. Barre d&#39;échelle = 5 um. Film 1: films CCD prises avec des protéines marquées par un colorant en solution. films CCD ont été prises par type prisme totale fluorescence à réflexion interne microscopie en utilisant un objectif 60x avec 10 nM Cy3 labeld représentant en solution. La résolution temporelle est de 100 ms. (A) Une surface a été préparé suivant le protocole de cet article. (B) Une surface a été préparé suivant le protocole dans cet article, mais le second tour de PEGyltion a été ignorée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1a.avi" target="_blank">Cliquez ici</a> pour voir le film 1a et <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1b.avi" target="_blank">cliquez ici</a> pour voir le film 1b.

Nous décrivons un procédé pour la passivation d&#39;une surface de verre en utilisant du polyethylene glycol (PEG). Ce protocole comprend le nettoyage de surfaces, la fonctionnalisation de la surface, et le revêtement de PEG. Nous introduisons une nouvelle stratégie pour traiter la surface avec des molécules de PEG à deux tours, ce qui donne une qualité supérieure de passivation par rapport aux méthodes existantes.

Single-molecule fluorescence spectroscopy has proven to be instrumental in understanding a wide range of biological phenomena at the nanoscale. Important ...

Le but global de cette procédure est d'obtenir une surface de lame en quartz fonctionnalisée de qualité supérieure. Cela est réalisé en nettoyant d'abord les lames en quartz percées et les lamelles avec de l'eau et de l'acétone. Ensuite, la lame est gravée à l'hydroxyde de potassium et à la solution piranha afin d'améliorer la qualité de la surface.Ensuite, les lames et les lamelles sont fonctionnalisées avec des groupes amines, suivies de deux cycles de traitement de surface à l’aide d’un polymère afin de rendre la surface du verre inerte. La dernière étape consiste à assembler la chambre microfluidique à partir de la lame et de la lamelle, les surfaces recouvertes de polyéthylène glycol ou greffées avec du PEG étant placées face à face. En définitive, une nouvelle stratégie consistant à traiter la surface avec des molécules de PEG en deux cycles améliore remarquablement la qualité de la passivation, comme observé par microscopie de fluorescence de molécules uniques.L'avantage principal de cette technique par rapport aux techniques existantes, telles que le revêtement polymère après gravure à l'oxyde de potassium, est qu'elle garantit une qualité supérieure. Les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car plusieurs traitements doivent être effectués. Pour commencer le perçage, les lames de quartz doivent être préparées comme décrit dans le protocole écrit.Nettoyez les lames en les plaçant dans un bocal en verre pour coloration. Généralement, cinq à quinze lames peuvent être placées dans un seul bocal. Rincez ensuite les lames avec de l’eau UE après avoir répété le rinçage trois fois, soniquez les lames avec de l’eau UE pendant cinq minutes afin d’éliminer les impuretés, jetez l’eau, puis rincez les lames trois fois supplémentaires avec de l’eau UE.Ensuite, remplacer l'eau UE par de l'acétone et placer les lames dans un bain à ultrasons avec de l'acétone pendant 20 minutes ou plus, jeter l'acétone et rincer les lames avec de l'eau Milli Q pour éliminer tout résidu d'acétone. Ensuite, remplacer l'eau par une solution d'hydroxyde de potassium à un molaire et placer les lames dans un bain à ultrasons pendant 20 minutes ou plus. Un gravage excessif améliorera la qualité de la surface, mais introduira des rayures pouvant interférer avec l'imagerie en fluorescence.Rincez les lames trois fois avec de l'eau Milli Q pour éliminer les traces d'hydroxyde de potassium avant de procéder à la gravure au piranha. Transférez les lames dans un porte-lames Duran ou un porte-lames en téflon sur mesure, puis placez-les dans un bécher d'un litre placé sous une hotte chimique. Remplissez le bécher avec 450 millilitres d'acide sulfurique.Ensuite, ajoutez 150 millilitres de peroxyde d'hydrogène pour obtenir un rapport de trois pour un entre l'acide sulfurique et le peroxyde d'hydrogène. Agitez la solution pour un mélange adéquat et laissez le bécher au repos pendant 20 minutes. Retirez les lames de la solution piranha et placez-les dans un porte-lames contenant de l'eau millieu.Entre-temps, jetez la solution de piranha dans un flacon de déchets désigné. Une fois qu'elle a atteint la température ambiante, rincez les lames trois fois avec de l'eau UE après le nettoyage des lamelles. Remplacez l'eau UE dans les boîtes de coloration par du méthanol. Conservez les lames et les lamelles dans du méthanol.Entre-temps, préparez la solution d'aminosilanisation en versant 100 millilitres de méthanol dans le flacon. Ajoutez ensuite cinq millilitres d'acide acétique et trois millilitres de triméthoxy-(3-aminopropyle)silane, puis mélangez délicatement par agitation. Remplacez le méthanol dans les boîtes de coloration contenant les lames et les lamelles par le mélange réactionnel d'aminosilanisation.Incuber de 20 à 30 minutes ; pendant l'incubation, soniquer une fois pendant une minute. Ensuite, remplacer la réaction d'aminosilylation par du méthanol. Puis jeter le méthanol et ajouter une solution fraîche de méthanol.Répétez cette procédure trois fois pour le premier cycle de fonctionnalisation de surface. Utilisez d'abord le polymère, puis séchez les lames et les lamelles à l'aide de gaz azote. Ensuite, placez-les dans des boîtes pour pipettes propres partiellement remplies d'eau milli Q de manière à ce que la face devant être pegylée soit orientée vers le haut. Ajoutez ensuite 64 microlitres de tampon de réaction fraîchement préparé à une solution de peg préparée.Pipetez le mélange plusieurs fois afin de le dissoudre complètement. Ensuite, centrifugez à 16 100 G pendant une minute. Pour éliminer les bulles d'air, déposez 70 microlitres du mélange de polyéthylènoglycolisation sur une lame de quartz sèche.Placer délicatement une lame couvre-objet sèche sur la solution, puis incuber les lames dans un environnement sombre et humide de deux heures à toute la nuit afin de conserver les lames et les lames couvre-objets greffées au PEG. Démonter soigneusement la lame et la lame couvre-objet en faisant glisser la lame couvre-objet sur le côté, puis les rincer avec de l’eau UE avant de les sécher à l’aide de gaz azote. Placer une paire composée d’une lame et d’une lame couvre-objet dans un tube de 50 millilitres de telle sorte que les surfaces greffées au PEG soient orientées l’une loin de l’autre.Fermer partiellement le tube et le soumettre au vide avant de le remplir de gaz d'azote et de visser le couvercle hermétiquement. Le conserver à moins 20 degrés Celsius. Ces étapes permettent de préserver la surface greffée au polyéthylène glycol pendant une longue période.Effectuez une deuxième série de pégylation comme décrit dans le protocole textuel immédiatement avant d'utiliser la lame pour assembler une chambre microfluidique. Placez une lame de quartz sur une surface plane, côté pégylé vers le haut. Formez un canal en diagonale sur la surface pégylée en posant du ruban adhésif double face sur la lame.Veillez à ce que les trous soient positionnés au centre du canal. Ensuite, placez délicatement une lamelle recouverte de PEG sur le dessus pour compléter la chambre, côté PEG vers le bas.Sceller la chambre en appuyant la lame couvre-objet sur les zones où le ruban adhésif double face est placé. Procéder délicatement mais soigneusement afin que la chambre soit hermétiquement scellée. Enfin, fermer les bords de la chambre avec de la colle époxy.Procédez à l'immobilisation de la streptavidine ou de la neutravine et ajoutez des biomolécules biotinylées pour l'imagerie de molécules uniques, comme décrit dans le protocole textuel. Si l'immobilisation sur la surface a été réalisée avec succès, on observe moins de 10 protéines absorbées non spécifiquement par zone d'imagerie. Lorsqu'une protéine marquée par un fluorophore à une concentration de un à 10 nanomolaire est ajoutée dans la chambre, si l'une des étapes de nettoyage ou de réaction n'a pas été correctement effectuée, le nombre de protéines absorbées non spécifiquement augmente considérablement. Par exemple, si l'étape de gravure au piranha est omise, on observe une absorption non spécifique 100 fois plus importante.La supériorité de la double pégylation est clairement mise en évidence ici. Les signaux de fond provenant des molécules fluorescentes et de la solution ont été observés comme étant beaucoup plus faibles lorsqu'une double pégylation était utilisée, comme indiqué dans le panneau de gauche. Cela indique que les protéines sont repoussées plus efficacement par la couche doublement pégylée.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est effectuée correctement. N'oubliez pas que le travail avec l'AYA peut être extrêmement dangereux ; des précautions telles que le port de gants appropriés, de lunettes de protection et d'un tablier doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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