passivation de surface pour les études de protéines unique molécule

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir une surface de glissement en quartz de qualité supérieure. Pour ce faire, il faut d’abord nettoyer les lames de quartz percées et les lamelles avec de l’eau et de l’acétone. Ensuite, la lame est gravée avec de l’hydroxyde de potassium et la solution de piranha pour améliorer la qualité de la surface.

Ensuite, les lames et les lamelles sont fonctionnalisées avec des groupes amines suivis de deux cycles d’ation de surface à l’aide d’un polymère pour rendre la surface du verre inerte. La dernière étape consiste à assembler la chambre microfluidique à partir de la lame et de la lamelle avec les surfaces revêtues de polyéthylène glycol ou pégylées face à face. En fin de compte, une nouvelle stratégie de traitement de la surface avec des molécules de cheville sur deux tours améliore remarquablement la qualité de la passivation observée par la microscopie à fluorescence à molécule unique.

Le principal avantage de cette technique ou des techniques existantes telles que le revêtement polymère après gravure à l’oxyde de potassium est que cette technique garantit une qualité supérieure. Les personnes novices dans cette méthode auront du mal car plusieurs traitements de service doivent être effectués. Le pour commencer l’exercice, les lames de quartz comme détaillé dans le protocole de texte.

Nettoyez les lames en les plaçant dans un bocal en verre. En règle générale, cinq à 15 lames peuvent être placées dans un seul bocal. Ensuite, rincez les lames avec de l’eau UE après avoir répété le rinçage trois fois, sonisez les lames avec de l’eau UE pendant cinq minutes pour éliminer la saleté, jetez l’eau et rincez les lames trois fois de plus avec de l’eau UE.

Ensuite, remplacez l’eau UE par de l’acétone et sonicez les lames avec de l’acétone pendant 20 minutes ou plus, jetez l’acétone et rincez les lames avec de l’eau Milli Q pour éliminer tout résidu d’acétone. Ensuite, remplacez l’eau par une molaire d’hydroxyde de potassium et sonicez les lames pendant 20 minutes ou plus. Une gravure excessive améliorera la qualité de la surface, mais introduira des rayures qui pourraient interférer avec l’imagerie par fluorescence.

Rincez les lames avec de l’eau Milli Q trois fois pour éliminer les traces d’hydroxyde de potassium afin d’effectuer une gravure au piranha. Transférez les lames dans un support de diapositives Duran ou un support en téflon sur mesure, et placez-les dans un bécher d’un litre situé dans une hotte chimique. Remplissez le bécher avec 450 millilitres d’acide sulfurique.

Ajoutez ensuite 150 millilitres de peroxyde d’hydrogène pour un rapport de trois à un entre l’acide sulfurique et le peroxyde d’hydrogène. Remuez la solution pour bien mélanger et laissez le bécher tranquille pendant 20 minutes. Sortez les lames de la solution de piranha et mettez-les dans un porte-lames contenant de l’eau millieu.

Pendant ce temps, jetez la solution de piranha dans une bouteille de déchets désignée Une fois qu’elle atteint la température ambiante, rincez les lames trois fois avec de l’eau UE après le nettoyage de la lamelle. Remplacez l’eau UE dans les boîtes de coloration par du méthanol. Conservez les lames et les lamelles dans du méthanol.

Pendant ce temps, préparez la solution d’aminémination en versant 100 millilitres de méthanol dans le ballon. Ajoutez ensuite cinq millilitres d’acide acétique et trois millilitres de trois amino propyle, triméthyle, et mélangez doucement en secouant. Remplacez le méthanol dans les boîtes de coloration contenant les lames et les lamelles de recouvrement par le mélange de réaction d’aminés-siloisation.

Incuber pendant 20 à 30 minutes pendant l’incubation sonicate une fois pendant une minute. Ensuite, remplacez la réaction d’aminémissement par du méthanol. Ensuite, jetez le méthanol et ajoutez une solution de méthanol frais.

Répétez cette procédure trois fois pour le premier tour d’analyse de surface En utilisant d’abord le polymère, séchez les lames et les lamelles à l’aide d’azote gazeux. Ensuite, placez-les dans des boîtes à pipettes propres, partiellement remplies d’eau milli Q, de manière à ce que le côté, qui doit être pégylé, soit tourné vers le haut. Ensuite, ajoutez 64 microlitres du tampon de réaction fraîchement préparé à une solution de cheville préparée.

Pipetez le mélange de haut en bas afin de le dissoudre complètement. Puis centrifuger à 16, 100 G pendant une minute. Pour éliminer les bulles d’air, déposez 70 microlitres du mélange de pégylation sur une lame de quartz séchée.

Placez délicatement une lamelle séchée sur la solution, incubez les lames dans un environnement sombre et humide pendant deux heures à toute la nuit pour stocker les lames pégylées et les lamelles de couverture. Il a soigneusement démonté la glissière et la lamelle en glissant la lamelle sur le côté et en les rinçant à l’eau UE avant de les sécher à l’azote gazeux. Placez une paire de lames et de lamelles dans un tube de 50 millilitres de sorte que les surfaces pégylées soient orientées l’une vers l’autre.

Fermez partiellement le tube et aspirez-le avant de le remplir d’azote gazeux et de bien visser le couvercle. Conservez-le à moins 20 degrés Celsius. Ces étapes aident à préserver la surface pégylée pendant une longue période.

Effectuez un deuxième tour de pégylation comme décrit dans le protocole textuel immédiatement avant d’utiliser la lame pour assembler une chambre microfluidique. Placez une lame de quartz sur une surface plane avec le côté pégylé vers le haut. Faites un canal en diagonale sur la surface pégylée en mettant du ruban adhésif double face sur la diapositive.

Assurez-vous que les trous sont positionnés au centre du canal. Ensuite, placez délicatement une lamelle de couverture pégylée sur le dessus pour compléter la chambre. Avec le côté pégylé vers le bas.

Scellez la chambre en appuyant sur la lamelle de recouvrement sur les zones où le ruban adhésif double face est placé. Faites-le doucement mais soigneusement afin que la chambre devienne étanche. Enfin, fermez les bords de la chambre avec de la colle époxy.

Procéder à l’immobilisation de la streptavidine ou du neut travain et ajouter des molécules biologiques biotinylées pour l’imagerie d’une seule molécule comme décrit dans le protocole de texte, si l’évaluation de surface a été faite avec succès, il y a moins de 10 protéines non spécifiquement absorbées par zone d’imagerie observée. Lorsqu’une à 10 nanomolaires de protéines marquées par fluorescence sont ajoutées dans la chambre, lorsque l’une des étapes de nettoyage ou de réaction n’a pas été correctement effectuée, le nombre de protéines non spécifiquement absorbées augmente considérablement. Par exemple, si la gravure du piranha est sautée, il y a 100 fois plus d’absorption non spécifique observée.

La nature supérieure de la double pégylation est mise en évidence ici. On a observé que les signaux de fond des molécules fluorescentes et de la solution étaient beaucoup plus faibles lorsque la double pégylation était utilisée, comme le montre le panneau de gauche. Cela indique que les protéines sont repoussées plus efficacement par la couche doublement pégylée.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est correctement exécutée. N’oubliez pas que travailler avec AYA peut être extrêmement dangereux, des précautions telles que des gants, des lunettes et un tablier appropriés doivent toujours être pris lors de l’exécution de cette procédure.