passivation de surface pour les études de protéines unique molécule

Le but global de cette procédure est d'obtenir une surface de lame en quartz fonctionnalisée de qualité supérieure. Cela est réalisé en nettoyant d'abord les lames en quartz percées et les lamelles avec de l'eau et de l'acétone. Ensuite, la lame est gravée à l'hydroxyde de potassium et à la solution piranha afin d'améliorer la qualité de la surface.

Ensuite, les lames et les lamelles sont fonctionnalisées avec des groupes amines, suivies de deux cycles de traitement de surface à l’aide d’un polymère afin de rendre la surface du verre inerte. La dernière étape consiste à assembler la chambre microfluidique à partir de la lame et de la lamelle, les surfaces recouvertes de polyéthylène glycol ou greffées avec du PEG étant placées face à face. En définitive, une nouvelle stratégie consistant à traiter la surface avec des molécules de PEG en deux cycles améliore remarquablement la qualité de la passivation, comme observé par microscopie de fluorescence de molécules uniques.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux techniques existantes, telles que le revêtement polymère après gravure à l'oxyde de potassium, est qu'elle garantit une qualité supérieure. Les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car plusieurs traitements doivent être effectués. Pour commencer le perçage, les lames de quartz doivent être préparées comme décrit dans le protocole écrit.

Nettoyez les lames en les plaçant dans un bocal en verre pour coloration. Généralement, cinq à quinze lames peuvent être placées dans un seul bocal. Rincez ensuite les lames avec de l’eau UE après avoir répété le rinçage trois fois, soniquez les lames avec de l’eau UE pendant cinq minutes afin d’éliminer les impuretés, jetez l’eau, puis rincez les lames trois fois supplémentaires avec de l’eau UE.

Ensuite, remplacer l'eau UE par de l'acétone et placer les lames dans un bain à ultrasons avec de l'acétone pendant 20 minutes ou plus, jeter l'acétone et rincer les lames avec de l'eau Milli Q pour éliminer tout résidu d'acétone. Ensuite, remplacer l'eau par une solution d'hydroxyde de potassium à un molaire et placer les lames dans un bain à ultrasons pendant 20 minutes ou plus. Un gravage excessif améliorera la qualité de la surface, mais introduira des rayures pouvant interférer avec l'imagerie en fluorescence.

Rincez les lames trois fois avec de l'eau Milli Q pour éliminer les traces d'hydroxyde de potassium avant de procéder à la gravure au piranha. Transférez les lames dans un porte-lames Duran ou un porte-lames en téflon sur mesure, puis placez-les dans un bécher d'un litre placé sous une hotte chimique. Remplissez le bécher avec 450 millilitres d'acide sulfurique.

Ensuite, ajoutez 150 millilitres de peroxyde d'hydrogène pour obtenir un rapport de trois pour un entre l'acide sulfurique et le peroxyde d'hydrogène. Agitez la solution pour un mélange adéquat et laissez le bécher au repos pendant 20 minutes. Retirez les lames de la solution piranha et placez-les dans un porte-lames contenant de l'eau millieu.

Entre-temps, jetez la solution de piranha dans un flacon de déchets désigné. Une fois qu'elle a atteint la température ambiante, rincez les lames trois fois avec de l'eau UE après le nettoyage des lamelles. Remplacez l'eau UE dans les boîtes de coloration par du méthanol. Conservez les lames et les lamelles dans du méthanol.

Entre-temps, préparez la solution d'aminosilanisation en versant 100 millilitres de méthanol dans le flacon. Ajoutez ensuite cinq millilitres d'acide acétique et trois millilitres de triméthoxy-(3-aminopropyle)silane, puis mélangez délicatement par agitation. Remplacez le méthanol dans les boîtes de coloration contenant les lames et les lamelles par le mélange réactionnel d'aminosilanisation.

Incuber de 20 à 30 minutes ; pendant l'incubation, soniquer une fois pendant une minute. Ensuite, remplacer la réaction d'aminosilylation par du méthanol. Puis jeter le méthanol et ajouter une solution fraîche de méthanol.

Répétez cette procédure trois fois pour le premier cycle de fonctionnalisation de surface. Utilisez d'abord le polymère, puis séchez les lames et les lamelles à l'aide de gaz azote. Ensuite, placez-les dans des boîtes pour pipettes propres partiellement remplies d'eau milli Q de manière à ce que la face devant être pegylée soit orientée vers le haut. Ajoutez ensuite 64 microlitres de tampon de réaction fraîchement préparé à une solution de peg préparée.

Pipetez le mélange plusieurs fois afin de le dissoudre complètement. Ensuite, centrifugez à 16 100 G pendant une minute. Pour éliminer les bulles d'air, déposez 70 microlitres du mélange de polyéthylènoglycolisation sur une lame de quartz sèche.

Placer délicatement une lame couvre-objet sèche sur la solution, puis incuber les lames dans un environnement sombre et humide de deux heures à toute la nuit afin de conserver les lames et les lames couvre-objets greffées au PEG. Démonter soigneusement la lame et la lame couvre-objet en faisant glisser la lame couvre-objet sur le côté, puis les rincer avec de l’eau UE avant de les sécher à l’aide de gaz azote. Placer une paire composée d’une lame et d’une lame couvre-objet dans un tube de 50 millilitres de telle sorte que les surfaces greffées au PEG soient orientées l’une loin de l’autre.

Fermer partiellement le tube et le soumettre au vide avant de le remplir de gaz d'azote et de visser le couvercle hermétiquement. Le conserver à moins 20 degrés Celsius. Ces étapes permettent de préserver la surface greffée au polyéthylène glycol pendant une longue période.

Effectuez une deuxième série de pégylation comme décrit dans le protocole textuel immédiatement avant d'utiliser la lame pour assembler une chambre microfluidique. Placez une lame de quartz sur une surface plane, côté pégylé vers le haut. Formez un canal en diagonale sur la surface pégylée en posant du ruban adhésif double face sur la lame.

Veillez à ce que les trous soient positionnés au centre du canal. Ensuite, placez délicatement une lamelle recouverte de PEG sur le dessus pour compléter la chambre, côté PEG vers le bas.

Sceller la chambre en appuyant la lame couvre-objet sur les zones où le ruban adhésif double face est placé. Procéder délicatement mais soigneusement afin que la chambre soit hermétiquement scellée. Enfin, fermer les bords de la chambre avec de la colle époxy.

Procédez à l'immobilisation de la streptavidine ou de la neutravine et ajoutez des biomolécules biotinylées pour l'imagerie de molécules uniques, comme décrit dans le protocole textuel. Si l'immobilisation sur la surface a été réalisée avec succès, on observe moins de 10 protéines absorbées non spécifiquement par zone d'imagerie. Lorsqu'une protéine marquée par un fluorophore à une concentration de un à 10 nanomolaire est ajoutée dans la chambre, si l'une des étapes de nettoyage ou de réaction n'a pas été correctement effectuée, le nombre de protéines absorbées non spécifiquement augmente considérablement. Par exemple, si l'étape de gravure au piranha est omise, on observe une absorption non spécifique 100 fois plus importante.

La supériorité de la double pégylation est clairement mise en évidence ici. Les signaux de fond provenant des molécules fluorescentes et de la solution ont été observés comme étant beaucoup plus faibles lorsqu'une double pégylation était utilisée, comme indiqué dans le panneau de gauche. Cela indique que les protéines sont repoussées plus efficacement par la couche doublement pégylée.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est effectuée correctement. N'oubliez pas que le travail avec l'AYA peut être extrêmement dangereux ; des précautions telles que le port de gants appropriés, de lunettes de protection et d'un tablier doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.