Visualisation de l’Interaction entre les protéines marquées Qdot et ADN λ modifiée relativement à l’échelle de la molécule unique

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de l’imagerie d’une molécule unique des interactions entre les protéines de l’ADN, telles que la réplication de l’ADN, la réparation des gènes et le maintien de la structure des chromosomes. Le principal avantage de cette technique est que l’on peut obtenir de l’ADN lambda modifié à haute teneur en collagène, puis guérir rapidement les protéines marquées. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes d’assemblage des cellules d’écoulement sont difficiles à apprendre.

Pour nettoyer les lamelles, placez 20 lamelles dans quatre bocaux de coloration, versez-y de l’éthanol et sionicez pendant 30 minutes dans de l’éthanol. Rincez ensuite trois fois les lamelles à l’eau ultra-pure. Ensuite, sonicez les lamelles avec une molaire d’hydroxyde de potassium pendant 30 minutes et rincez les lamelles avec de l’eau ultrapure trois fois.

Répétez ensuite une fois la sonication à l’éthanol et à l’hydroxyde de potassium. Sonicez les lamelles avec de l’acétone pendant 30 minutes, puis rincez abondamment à l’eau ultra-pure. Placez maintenant les lamelles dans la solution Piranha et incubez à 95 degrés Celsius pendant une heure.

Après l’incubation, rincez cinq fois les lamelles à l’eau ultra-pure. Ensuite, lavez abondamment chaque lamelle avec de l’eau ultra-pure. Utilisez du papier pour sécher la lamelle de son bord et placez-la dans un bocal de coloration.

Séchez soigneusement la lamelle dans un four à 110 degrés Celsius. Rincez maintenant la lamelle avec du méthanol, puis remettez le pot de coloration dans le four à 110 degrés Celsius pour sécher la lamelle. Pour effectuer la fonctionnalisation de la lamelle, ajoutez 70 millilitres de solution de silane dans chaque bocal, vissez le bouchon et laissez le bocal à température ambiante pendant la nuit.

Lavez les lamelles à l’aide de trois béchers remplis d’eau ultra-pure. Séchez soigneusement les lamelles à l’aide d’azote gazeux. Dissoudre 150 milligrammes de méthoxy-PEG et six milligrammes de biotine-PEG dans un millilitre de bicarbonate de sodium 0,1 molaire fraîchement préparé.

Centrifuger à 17 000 fois g pendant une minute pour éliminer les PEG insolubles. Maintenant, pipetez 100 microlitres de solution PEG au centre de la lamelle silanisée et placez une autre lamelle silanisée sur le dessus. Incuber les lamelles avec une solution PEG pendant au moins trois heures dans l’obscurité.

Séparez les paires de lamelles et maintenez la surface fonctionnalisée vers le haut. Rincez abondamment les lamelles à l’eau ultra-pure et séchez-les avec de l’azote gazeux. Marquez maintenant le côté fonctionnalisé des lamelles sur l’un des coins à l’aide d’un marqueur.

Placez une lamelle dans un tube de 50 millilitres percé d’un trou sur son capuchon. Placez le tube dans un sac en plastique, scellez-le à l’aide d’une scelleuse sous vide et conservez-le à moins 20 degrés Celsius. Pour assembler la cellule d’écoulement, découpez un canal au centre d’un morceau de ruban adhésif double face à l’aide d’un perforateur.

Décollez le côté papier du ruban adhésif double face et collez-le sur un côté en verre à deux trous. Il est plus facile d’éliminer les bulles d’air en décollant le côté papier que le côté plastique du ruban adhésif double face. Appuyez sur le ruban adhésif pour éliminer les bulles d’air.

Ensuite, coupez une lamelle fonctionnalisée en quatre morceaux à l’aide d’un scribe en verre à pointe de diamant et retirez les débris à l’aide d’azote gazeux en gardant le côté fonctionnalisé vers le haut. Décollez le côté plastique du ruban adhésif double face et collez la diapositive sur la lamelle fonctionnalisée. Appuyez doucement pour éliminer les bulles d’air entre la lamelle et le ruban.

L’élimination complète des bulles d’air peut protéger la cellule d’écoulement contre les fuites pendant que des tampons y sont pompés. Insérez maintenant le tube d’entrée dans le petit trou et insérez le tube de sortie dans le grand trou. Fixez le tube à l’aide d’époxy.

Pompez manuellement 20 microlitres de streptavidine de 0,2 milligramme par millilitre dans la cellule d’écoulement à l’aide d’une seringue et incubez à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, pompez le tampon de blocage dans la cellule d’écoulement pour remplacer la streptavidine et maintenez-la à température ambiante. Obtenez l’alignement focal du rouge et du rouge lointain avec A5 sur la lame de test numéro un du microscope à fluorescence par excitation simultanée à l’aide d’un laser de 532 nanomètres et d’un laser de 640 nanomètres.

Produisez des images à double longueur d’onde avec des optiques de division. Placez la cellule d’écoulement sur le microscope et connectez son tube de sortie à un tube plus long relié à un ressort de 10 millilitres installé sur une pompe programmable de prélèvement de perfusion automatisée. Éliminez les bulles d’air dans la cellule d’écoulement en injectant un tampon de blocage et en retournant le tube de sortie.

Ajoutez 0,5 microlitre d’ADN lambda-ARS317 biotinylé dans 80 microlitres de tampon de blocage. Pompez le mélange préparé dans la cellule d’écoulement à 25 microlitres par minute pendant deux minutes. Ensuite, rincez l’ADN lambda-ARS317 à l’aide de 200 microlitres de tampon de blocage à une vitesse de 50 microlitres par minute.

Pompez maintenant 200 microlitres de tampon de liaison à un débit de 50 microlitres par minute pour éliminer le tampon de blocage dans la cellule d’écoulement. Ensuite, ajoutez deux microlitres d’ORC-Qdot705, un microlitre de DTT et un microlitre d’ATP dans 96 microlitres de tampon de liaison. La concentration finale de l’ORC-Qdot705 est de 0,2 nanomolaire.

Après avoir pompé le tampon de liaison comme indiqué dans le protocole de texte, pompez 20 microlitres de la solution ORC-Qdot705 préparée à un débit de 10 microlitres par minute dans la cellule d’écoulement. Rincez l’excès d’ORC-Qdot705 à l’aide de 200 microlitres de tampon de liaison à raison de 100 microlitres par minute. Ensuite, pompez le tampon de liaison avec 30 nanomolaires de SYTOX Orange dans la cellule d’écoulement pour colorer les substrats d’ADN à une vitesse de 100 microlitres par minute.

Enfin, excitez le signal ORC-Qdot705 à l’aide d’un laser de 405 nanomètres et excitez le signal d’ADN coloré en orange SYTOX à l’aide d’un laser de 532 nanomètres. Observez les signaux simultanément avec un débit de 100 microlitres par minute à l’aide d’un filtre passe-bande quadribande. Enregistrez les images par EMCCD avec 100 millisecondes par image.

L’illustration du substrat d’ADN lambda-ARS317 est présentée ici. L’ORC marqué par Qdot705 a été excité par un laser de 405 nanomètres. L’ADN coloré à l’orange SYTOX a été excité par un laser de 532 nanomètres.

Le résultat fusionné suggère que l’ORC étiqueté Qdot705 se lie à ARS317. Le résultat de la distribution de liaison à l’ORC sur l’ADN lambda-ARS317 montre que l’ORC se lie à l’ARS317 avec une grande abondance. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le FRET à molécule unique peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant les interactions protéine-protéine et la dynamique des protéines.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’imagerie fluorescente à molécule unique pour explorer les interactions entre les protéines de l’ADN dans les systèmes reconstitués de réplication de l’ADN et de réparation de l’ADN in vitro. N’oubliez pas que travailler avec la solution Piranha peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de masques de protection doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.