Microscopie de localisation photoactivée couplée à la fluorescence bimoléculaire

Dans sa forme active, le monomère Ras associé à la membrane plasmique – une protéine de liaison aux nucléotides de guanine – recrute Raf, une protéine kinase inactive qui se lie à Ras via son domaine de liaison Ras.

Cette liaison aboutit à un complexe Ras-Raf fonctionnel qui déclenche le processus de signalisation en aval.

Pour visualiser l’interaction intracellulaire Ras-Raf, commencez par une suspension de cellules génétiquement modifiées dans une lame bien chambrée. Ces cellules expriment deux protéines de fusion non fluorescentes : l’une comprend Ras lié à la moitié d’un fluorophore photoactivable via son N-terminal, et l’autre est Raf fusionné à l’autre moitié du même fluorophore au niveau de son C-terminal.

À l’intérieur des cellules, les protéines de fusion contenant Ras s’arriment à la membrane plasmique et interagissent avec les protéines de fusion contenant Raf, reconstituant les fragments de la protéine fluorescente en un fluorophore photoactivable complet. L’absence de liaison Ras et Raf maintient les deux moitiés de fluorophore séparées.

Ajoutez un réactif fixateur à la lame. Les molécules fixatrices forment des liaisons croisées avec les protéines et stabilisent les c