Microscopie de localisation photoactivée couplée à la fluorescence bimoléculaire

Dans sa forme active, le monomère Ras associé à la membrane plasmique – une protéine de liaison aux nucléotides de guanine – recrute Raf, une protéine kinase inactive qui se lie à Ras via son domaine de liaison Ras.

Cette liaison aboutit à un complexe Ras-Raf fonctionnel qui déclenche le processus de signalisation en aval.

Pour visualiser l’interaction intracellulaire Ras-Raf, commencez par une suspension de cellules génétiquement modifiées dans une lame bien chambrée. Ces cellules expriment deux protéines de fusion non fluorescentes : l’une comprend Ras lié à la moitié d’un fluorophore photoactivable via son N-terminal, et l’autre est Raf fusionné à l’autre moitié du même fluorophore au niveau de son C-terminal.

À l’intérieur des cellules, les protéines de fusion contenant Ras s’arriment à la membrane plasmique et interagissent avec les protéines de fusion contenant Raf, reconstituant les fragments de la protéine fluorescente en un fluorophore photoactivable complet. L’absence de liaison Ras et Raf maintient les deux moitiés de fluorophore séparées.

Ajoutez un réactif fixateur à la lame. Les molécules fixatrices forment des liaisons croisées avec les protéines et stabilisent les complexes protéiques.

Retirez le réactif fixateur et ajoutez un tampon d’imagerie. Placez la lame sous un microscope à fluorescence pour la microscopie de localisation photoactivée, PALM. Illuminez les cellules avec un laser de haute intensité, activant un petit sous-ensemble de molécules fluorescentes.

Imagez la fluorescence d’origine aléatoire produite par chaque complexe Ras-Raf de taille nanométrique, marqué d’un fluorophore, visible sous forme de points de fluorescence à haute résolution.

Pour préparer un échantillon pour l’imagerie, plaquez environ 5,5 x 10⁴ cellules d’expression stables par puits d’une lame de chambre à fond de verre à 8 puits, dans 350 microlitres de DMEM sans rouge de phénol. Utilisez du paraformaldéhyde frais avec du glutaraldéhyde pour fixer les cellules, et après avoir remplacé le fixateur par du PBS ou un tampon d’imagerie, vortex de particules d’or de 100 nanomètres, et ajoutez 35 microlitres par puits pour suivre la dérive de l’étage pendant l’imagerie.

Approchez-vous du microscope et allumez les lasers de 405 et 561 nanomètres. En gardant les volets fermés à ce stade, assurez-vous que le miroir dichroïque de 561 nanomètres et le filtre coupe-bande sont en place. Ouvrez le logiciel d’acquisition d’images.

Allumez la caméra EMCCD et laissez-la refroidir, puis réglez le temps d’exposition sur 100 millisecondes et le gain EMCCD sur une valeur appropriée. Ajoutez de l’huile d’immersion dans l’objectif et fixez l’échantillon sur la platine du microscope. Ensuite, avec le laser à fond clair ou à 561 nanomètres, faites la mise au point sur l’échantillon.

Pour l’imagerie de Ras et d’autres protéines membranaires, utilisez un objectif apochromatique TIRF 60X avec une ouverture numérique de 1,49, et mettez le microscope en configuration TIRF.

Ajustez le laser d’excitation de manière à ce qu’il soit décentré lors de l’atteinte de l’ouverture arrière de l’objectif TIRF, ce qui provoquera la déviation du laser lorsqu’il atteindra l’interface tampon de lamelle. Continuez à ajuster la position d’incident du laser jusqu’à ce que l’angle critique soit atteint et que le laser soit réfléchi.

Recherchez une cellule à imager avec plusieurs particules d’or en vue. Ensuite, définissez une région d’intérêt qui entoure la cellule ou une région de celle-ci et les particules d’or.

Si une activation suffisante se produit déjà en raison de niveaux d’expression élevés, commencez l’acquisition avec le laser de 405 nanomètres éteint et le laser 561 activé. Sinon, allumez le laser de 405 nanomètres à la puissance d’usine la plus basse et augmentez-le progressivement jusqu’à ce qu’il y ait des dizaines de molécules par image ou que les molécules uniques soient bien séparées.

Au fur et à mesure que l’acquisition de données se poursuit, augmentez progressivement la puissance laser de 405 nanomètres pour maintenir la densité du spot à peu près constante. Poursuivez l’acquisition d’images jusqu’à ce qu’une puissance élevée de 405 ne déclenche plus d’événements d’activation.