Name: Issu lévolution temporelle du glutamate Dégagement avec une analyse de déconvolution des courants de Transporteur ASTROCYTIQUES (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse par déconvolution pour estimer la durée de vie du glutamate au niveau des membranes astrocytaires dans l'hippocampe de souris. Cette technique électrophysiologique permet d'étudier la clairance synaptique avec une haute résolution temporelle.

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Ce travail a été financé par l&#39;Institut national des troubles neurologiques et du programme de recherche intra-muros Course (NS002986). AS a écrit le manuscrit et mis en œuvre l&#39;analyse de déconvolution. JSD développé la version initiale de l&#39;analyse de déconvolution et commenté le texte.

<ol><li>Ventura, R., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+relationships+between+hippocampal+synapses+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes.</a> J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).</li>
<li>Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+perisynaptic+astroglia+during+synaptogenesis+in+the+mature+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hippocampus.</a> Glia. 55, 13-23 (2007).</li>
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<li>Herman, M. A., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+glutamate+concentration+in+hippocampal+slice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice.</a> J. Neurosci. 27, 9736-9741 (2007).</li>
<li>Arnth-Jensen, N., Jabaudon, D., Scanziani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+independent+hippocampal+synapses+is+controlled+by+glutamate+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake.</a> Nat. Neurosci. 5, 325-331 (2002).</li>
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<li>Rusakov, D. A., Kullmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrasynaptic+glutamate+diffusion+in+the+hippocampus%3A+ultrastructural+constraints%2C+uptake%2C+and+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extrasynaptic glutamate diffusion in the hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation.</a> J. Neurosci. 18, 3158-3170 (1998).</li>
<li>Zerangue, N., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flux+coupling+in+a+neuronal+glutamate+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Flux coupling in a neuronal glutamate transporter.</a> Nature. 383, 634-637 (1038).</li>
<li>Eliasof, S., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+glial+cell+glutamate+transporter+is+coupled+to+an+anionic+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Retinal glial cell glutamate transporter is coupled to an anionic conductance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4153-4158 (1996).</li>
<li>Wadiche, J. I., Amara, S. G., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+fluxes+associated+with+excitatory+amino+acid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport.</a> Neuron. 15, 721-728 (1995).</li>
<li>Wadiche, J. I., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+and+microscopic+properties+of+a+cloned+glutamate+transporter%2Fchloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macroscopic and microscopic properties of a cloned glutamate transporter/chloride channel.</a> J. Neurosci. 18, 7650-7661 (1998).</li>
<li>Bergles, D. E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activation+of+glutamate+transporters+in+hippocampal+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes.</a> Neuron. 19, 1297-1308 (1997).</li>
<li>Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+the+glutamate+clearance+time+course+from+transporter+currents+in+CA1+hippocampal+astrocytes%3A+transmitter+uptake+gets+faster+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development.</a> J. Neurosci. 25, 2906-2916 (2005).</li>
<li>Scimemi, A., Tian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+transporters+regulate+glutamate+clearance%2C+NMDA+receptor+activation%2C+and+synaptic+plasticity+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal transporters regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus.</a> J. Neurosci. 29, 14581-14595 (2009).</li>
<li>Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+enhances+glutamate+uptake+via+glutamate+transporters+in+rat+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells.</a> Neuroreport. 12, 1077-1080 (2001).</li>
<li>Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrogenic+uptake+of+glutamate+and+aspartate+into+glial+cells+isolated+from+the+salamander+%28Ambystoma%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina.</a> J. Physiol. 436, 169-193 (1991).</li>
<li>Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+coupled+and+uncoupled+currents+during+glutamate+uptake+by+GLT-1+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters.</a> J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).</li>
<li>Diamond, J. S., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+glutamate+does+not+overwhelm+transporters+on+hippocampal+astrocytes+during+high-frequency+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation.</a> J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).</li>
<li>Benediktsson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+glutamate+transporter+dynamics+in+developing+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes.</a> Glia. 60, 175-188 (2012).</li>
<li>Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+synaptic+glutamate+spillover+and+reuptake+by+linker+optimized+glutamate-sensitive+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).</li>
<li>Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid%CE%B21-42+slows+clearance+of+synaptically-released+glutamate+by+mislocalizing+astrocytic+GLT-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloidβ1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1.</a> J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent aucun conflit d&#39;intérêt.

Nous décrivons ici une approche expérimentale pour obtenir des enregistrements électrophysiologiques des astrocytes, un protocole d&#39;analyse pour isoler les courants de transporteur du glutamate dans les astrocytes et une méthode mathématique pour calculer le cours du temps de jeu glutamate à partir des courants de transporteurs astrocytaires. Le succès de l&#39;analyse repose sur la capacité à obtenir des enregistrements de patch clamp haute qualité à partir des astrocytes et de la préci...

Les astrocytes sont l&#39;un des types cellulaires les plus abondants dans le cerveau avec une morphologie en forme d&#39;étoile et des protubérances membranaires fines qui s&#39;étendent tout au long de la neuropile et atteignent voisins contacts synaptiques 1,2. La membrane de la cellule Les astrocytes de forte densité est emballé avec des molécules d&#39;transporteur du glutamate 3. Dans les conditions physiologiques, transporteurs du glutamate se lient rapidement glutamate sur le côté extracellulaire de la membrane et le transférer dans le cytoplasme de la cellule. Ce faisant, les transporteurs maintiennent bas la concentration basale de glutamate dans l&#39;espace extracellulaire 4. Transporteurs du glutamate dans les processus astrocytaires fins adjacents à excitateurs synapses sont idéalement positionnés pour lier glutamate libéré lors d&#39;événements synaptiques comme il diffuse loin de la fente synaptique. Ce faisant, les transporteurs limitent également les retombées glutamate vers et péri-régions extra-synaptiques et sur synapses voisines, ce qui réduit la dispersion spatiale du signal d&#39;excitations dans le cerveau de 5 à 7. Transport du glutamate est un processus électrogénique stoechiométrique couplé au mouvement de 3 Na + et H + 1 le long de leur gradient électrochimique et à la contre-transport de K + 1 8. Transport du glutamate est associée (mais pas stœchiométriquement couplé à) une conductance anionique perméable à la SCN - (thiocyanate)&gt; NO 3 - (nitrate) ≈ ClO 4 - (perchlorate)&gt; I -&gt; Br -&gt; Cl -&gt; F -, pas de CH 3 SO 3 - (méthane sulfonate) et C 6 H 11 O 7 - (gluconate) 9-11. Les deux courants (stoechiométrique ou non stoechiométrique) peuvent être enregistrées par l&#39;obtention d&#39;enregistrements de patch-clamp de cellules entières de astrocytes, identifiés visuellement sous un éclairage Dodt ou infra-rouge contraste d&#39;interférence différentiel (IR-DIC) dans acute tranches de cerveau 12. La composante stoechiométrique du courant associé au transport du glutamate à travers la membrane peut être isolé en utilisant CH 3 SO 3 -, ou 11 C 6 H o 7 - solutions intracellulaires base et peut être provoquée par le glutamate flash-uncaging sur les astrocytes 13,14, ou en activant la libération de glutamate à partir de synapses voisines, soit électriquement ou 12 avec une commande de optogenetic ciblée. L&#39;évolution temporelle de la composante stoechiométrique du courant transporteur est façonnée par la vie du profil de concentration du glutamate au niveau des membranes astrocytaires (c.-garde au glutamate), la cinétique de transporteurs du glutamate, les propriétés des membranes passives des astrocytes, et au cours de stimulations synaptiques, par le synchronicité de la libération de glutamate dans les synapses activées 13. Nous décrivons ici en détail: (1) une appr expérimentaleOach d&#39;isoler la composante stoechiométrique des courants de transporteur du glutamate à partir d&#39;enregistrements de patch-clamp de cellules entières de astrocytes en utilisant la souris coupes d&#39;hippocampe aigus comme exemple la préparation expérimentale, (2) une approche analytique pour dériver le cours du temps de jeu glutamate à partir de ces enregistrements 13, 14. Ces méthodes peuvent être utilisées pour enregistrer et analyser les courants de transporteur du glutamate de astrocytes dans n&#39;importe quelle région du système nerveux central.

<table><tbody><tr><td>CGP52432</td><td>Tocris</td><td>1246</td><td></td></tr><tr><td>(R,S)-CPP</td><td>Tocris</td><td>173</td><td></td></tr><tr><td>DPCPX</td><td>Tocris</td><td>439</td><td></td></tr><tr><td>LY341495 sel disodique</td><td>Tocris</td><td>4062</td><td></td></tr><tr><td>MSOP</td><td>Tocris</td><td>803</td><td></td></tr><tr><td>NBQX sel disodique</td><td>Tocris</td><td>1044</td><td></td></tr><tr><td>D,L-TBOA</td><td>Tocis</td><td>1223</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxine</td><td>Sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>MNI-L-glutamate</td><td>Tocris</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594</td><td>Life Technologies</td><td>A10438</td><td></td></tr><tr><td>Électrodes matricielles</td> en option <td>Frederick Haer Company</td><td>MX21AES(JD3)</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté</td><td>World Precision Instruments</td><td>PG10165-4</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micro-pipettes en verre à deux étages</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 404 adhésif instantané</td><td>Ted Pella</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>Lampe Xe</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>FlashMic</td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro 6</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

issu l&#39;évolution temporelle du glutamate dégagement avec une analyse de déconvolution des courants de transporteur astrocytiques

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

La plus forte densité de transporteurs du glutamate dans le cerveau se trouve dans les astrocytes. Le glutamate en couple de transporteurs le mouvement du glutamate à travers la membrane avec le co-transport de Na + et 3 1 H + et le contre-transport de K + 1. Le courant stoechiométrique généré par le processus de transport peut être contrôlée au moyen d&#39;enregistrements de patch-clamp de cellules entières provenant astrocytes. L&#39;évolution dans le temps du courant enregistré est façonné par l&#39;évolution temporelle du profil de concentration de glutamate qui astrocytes sont exposées, la cinétique de transporteurs du glutamate, et les propriétés des membranes passives électrotoniques astrocytiques. Nous décrivons ici les méthodes expérimentales et analytiques qui peuvent être utilisés pour enregistrer les courants de transporteur du glutamate dans les astrocytes et isoler le cours du temps de jeu glutamate de tous les autres facteurs qui façonnent la forme d&#39;onde des courants de transporteurs astrocytaires. Les méthodes décrites ici peuvent être utilisées pour estimer la durée de vie of flash-Uncaged et synaptiquement-glutamate libéré à membranes astrocytaires dans n&#39;importe quelle région du système nerveux central pendant la santé et la maladie.

Le succès de l&#39;approche analytique décrite ici dépend de façon critique sur l&#39;obtention des enregistrements électrophysiologiques haute qualité des courants de transporteur de astrocytes dans n&#39;importe quelle région du système nerveux central. Dans des coupes d&#39;hippocampe de souris aiguës, les astrocytes peuvent être facilement identifiés sous Dodt éclairage ou IR-DIC en raison de leur corps à petites cellules (Ø = 10 um) et le noyau de premier plan (Figure 1). Leur morphologie en forme ...

Nous décrivons une méthode analytique pour estimer la durée de vie de glutamate au niveau des membranes astrocytes à partir d&#39;enregistrements électrophysiologiques des courants de transporteur du glutamate dans les astrocytes.

Issu l&#39;évolution temporelle du glutamate Dégagement avec une analyse de déconvolution des courants de Transporteur ASTROCYTIQUES

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

L'objectif général de l'expérience est d'estimer le cours temporel de l'élimination du glutamate à partir des membranes astrocytaires après sa libération par les synapses excitatrices. La première étape de ce processus consiste à enregistrer l'activation synaptique du transport du glutamate provenant des astrocytes dans des tranches cérébrales aiguës, en l'absence et en présence d'une concentration sous-saturante d'un antagoniste large spectre des transporteurs du glutamate, le TBOA. La deuxième étape consiste à analyser les enregistrements afin d'isoler les courants synaptiquement activés des transporteurs du glutamate de toutes les autres composantes de la réponse évoquée.Ensuite, le cours temporel du filtre est estimé en analysant les courants du transporteur enregistrés en présence de TBOA, en déconvoluant le filtre à partir de l'événement de transport enregistré dans des conditions contrôlées. Le cours temporel de l'élimination du glutamate à partir des membranes astrocytaires est obtenu. Les résultats montrent que, dans l'hippocampe de la souris, les astrocytes n'ont besoin que de quelques millisecondes pour éliminer le glutamate libéré synaptiquement de l'espace extracellula

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Deux enregistrements électrophysiologiques des synapses-réponses évoquées astrogliales et neuronales aiguës dans des coupes d&#39;hippocampe

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Ce protocole fournit une méthode intégrée incluant la délivrance virale, l’implantation d’optrodes, l’induction photothrombotique, l’enregistrement simultané de l’activité des astrocytes et des neurones, ainsi que la stimulation optogénétique des astrocytes. Cette méthode intégrée vise à fournir une étude simultanée de la relation astrocyte-neurone à travers les stades aigus à chroniques de l’AVC ischémique.

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