Issu l'évolution temporelle du glutamate Dégagement avec une analyse de déconvolution des courants de Transporteur ASTROCYTIQUES

L'objectif général de l'expérience est d'estimer le cours temporel de l'élimination du glutamate à partir des membranes astrocytaires après sa libération par les synapses excitatrices. La première étape de ce processus consiste à enregistrer l'activation synaptique du transport du glutamate provenant des astrocytes dans des tranches cérébrales aiguës, en l'absence et en présence d'une concentration sous-saturante d'un antagoniste large spectre des transporteurs du glutamate, le TBOA. La deuxième étape consiste à analyser les enregistrements afin d'isoler les courants synaptiquement activés des transporteurs du glutamate de toutes les autres composantes de la réponse évoquée.

Ensuite, le cours temporel du filtre est estimé en analysant les courants du transporteur enregistrés en présence de TBOA, en déconvoluant le filtre à partir de l'événement de transport enregistré dans des conditions contrôlées. Le cours temporel de l'élimination du glutamate à partir des membranes astrocytaires est obtenu. Les résultats montrent que, dans l'hippocampe de la souris, les astrocytes n'ont besoin que de quelques millisecondes pour éliminer le glutamate libéré synaptiquement de l'espace extracellulaire.

Cette approche fournit un outil sensible pour détecter les modifications de la capacité de captation des astrocytes dans différentes régions cérébrales au cours de conditions physiologiques et pathologiques. Le principal avantage de cette méthode par rapport à d'autres approches, par exemple celles fondées sur l'analyse du déplacement d'antagonistes des récepteurs du glutamate à dissociation rapide sur des indicateurs fluorescents du glutamate ou sur des simulations informatiques de réaction-diffusion, réside dans sa haute résolution temporelle et dans le fait qu'elle fournit une mesure expérimentale directe de l'élimination du glutamate par les astrocytes. Cette méthode nous permet de comprendre la dynamique spatiotemporelle de la transmission synaptique dans le cerveau.

Il peut nous aider à interpréter les changements physiopathologiques du glutamate, de la diffusion et de la captation qui peuvent survenir dans certaines affections neurologiques telles que la maladie d'Alzheimer. Commencez cette procédure en effectuant cinq incisions sur un cerveau de souris disséqué à l’aide d’un scalpel. Retirez d’abord les bulbes olfactifs et le cortex frontal.

Deuxièmement, retirez le cervelet. Ensuite, retirez les lobes temporaux gauche et droit. Puis séparez les deux hémisphères cérébraux par une coupe sagittale médiane.

Ensuite, collez la surface latérale de chaque section cérébrale sur la plaque de base froide du vibromètre. Le côté dorsal du cerveau doit être orienté vers la lame du vibromètre, tandis que le côté ventral du cerveau doit être en contact avec le bloc d'agar, à l'opposé de la lame du vibromètre. Fixez ensuite la plaque de base du vibromètre à la chambre de dissection.

Régler l'épaisseur de coupe à 250 micromètres et ajuster la largeur de la lame avant la découpe. Une fois que la lame a traversé le cortex et l'hippocampe, utiliser un scalpel pour séparer le cortex hippocampique du mésencéphale. Ensuite, placer une tranche dans la chambre d'immersion à 34 degrés Celsius après avoir maintenu les tranches à 34 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Les laisser refroidir à température ambiante pendant 30 minutes avant de les utiliser pour les enregistrements d'électrophysiologie dans cette procédure, transférer une tranche dans la chambre d'enregistrement. Examiner visuellement la tranche sous l'éclairage ponctuel ou I-R-D-I-C. Les astrocytes peuvent être identifiés par leur petit corps cellulaire et leur noyau marqué lors de la stimulation synaptique.

Placer une électrode bipolaire en acier inoxydable à environ 100 micromètres de l'astrocyte que vous prévoyez de piquer. Piquer l'astrocyte et établir la configuration en cellule entière en appliquant une aspiration très légère. Ensuite, alterner des stimulations simples et appariées toutes les 10 à 20 secondes afin d'isoler les portions facilitées de l'occurrence du transport activé synaptiquement.

Tout d'abord, moyennez au moins 20 balayages obtenus avec des stimulations jumelées dans des conditions contrôlées et en présence de 10 micromolaire d’un antagoniste large spectre des transporteurs du glutamate. TBOA, puis moyennez un nombre identique de balayages obtenus avec des stimulations simples en conditions de contrôle et en présence de 10 micromolaire de TBOA. Soustrayez le tracé moyen obtenu avec les stimulations simples du tracé moyen obtenu avec les stimulations jumelées. Cette étape permet d’isoler le courant géométrique STO et le courant soutenu de potassium induit par le second stimulus.

Lors du décalage suivant, soustraire de la réponse moyenne au deuxième stimulus obtenue précédemment la trace moyenne obtenue avec des stimulations simples, décalée dans le temps, en utilisant un intervalle temporel correspondant à l'intervalle PUL utilisé pour délivrer des impulsions appariées. Cette étape permet d'isoler une composante facilitée du courant transporteur induit par le deuxième stimulus. Dans la plupart des cas, cette étape élimine entièrement le courant potassium soutenu.

Si tel est le cas, l'isolement du FSTC est complet et vous pouvez procéder à l'analyse de déconvolution afin d'obtenir le tracé cinétique du retrait du glutamate par les astrocytes. Dans certains cas, toutefois, un faible courant potassique persistant est encore présent et une analyse supplémentaire est nécessaire. Mesurez l'amplitude du courant potassique persistant restant après la réalisation.

L'analyse décrite précédemment ajuste l'amplitude de la fonction mono-exponentielle à l'amplitude du courant résiduel de potassium en plateau en fixant l'amplitude du courant de potassium en plateau mesuré comme étant « a » dans cette équation. Toutefois, la constante de temps de montée représente la valeur moyenne de la montée estimée dans des expériences distinctes au cours desquelles un courant de potassium en plateau est isolé. Pharmacologiquement, en utilisant une concentration saturante élevée de TBOA, puis soustraire la fonction mono-exponentielle résultante de la FSTC et du courant de potassium en plateau.

Pour terminer l'isolement du FSTC. Pour isoler l'occurrence du transport activé par flash. Enregistrer en moyenne au moins 20 balayages obtenus avec le trajet lumineux ouvert dans les conditions de contrôle et en présence de 10 micromolaire de TBOA, puis faire la moyenne du même nombre de balayages obtenus avec le trajet lumineux fermé dans les conditions de contrôle et en présence de 10 micromolaire de TBOA. Soustraire la trace moyenne obtenue avec le trajet lumineux bloqué de la trace moyenne obtenue avec le trajet lumineux ouvert.

Cette étape permet d'éliminer l'artéfact de stimulation et d'isoler les FTC ; dans cette étape, ajustez le courant de transport, soit le FSTC soit le FTC enregistré dans des conditions de contrôle et en présence de 10 micromolaire de TBOA, à l'aide d'une fonction multi-exponentielle. Créez ensuite une fonction à montée instantanée qui décroît de manière mono-exponentielle selon cette fonction et qui décrit au mieux la phase de décroissance du courant du transporteur enregistré en présence de 10 micromolaire de TBOA. Ensuite, déconvoluez la fonction mono-exponentielle à partir de l'ajustement du courant du transporteur enregistré en présence de 10 micromolaire de TBOA afin d'obtenir le filtre. Puis, déconvoluez ce filtre à partir de l'ajustement du courant du transporteur en conditions de contrôle.

Pour obtenir une estimation quantitative du cours temporel global de l'élimination du glutamate, calculez l'OID de la forme d'onde lors de la réalisation de cette procédure. Il est important de vérifier que les événements de transport sont enregistrés dans des conditions expérimentales où le filtre fonctionne en régime linéaire et introduit uniquement des distorsions linéaires du transport. La forme du courant peut être vérifiée en examinant les manipulations qui modifient l'amplitude du courant de transport.

Ne modifiez pas son cap. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser les enregistrements astrocytaires pour extraire des informations sur le glutamate, la diffusion et la capture dans le cerveau.