Issu l'évolution temporelle du glutamate Dégagement avec une analyse de déconvolution des courants de Transporteur ASTROCYTIQUES

L’objectif global de l’expérience est d’estimer l’évolution temporelle de l’élimination du glutamate des membranes astrocytaires après sa libération des synapses excitatrices. La première étape de ce processus consiste à enregistrer l’occurrence du transport du glutamate activé synaptiquement à partir des astrocytes dans des coupes cérébrales aiguës en l’absence et en présence d’une concentration sous-saturante de l’antagoniste du transporteur du glutamate à large spectre, TBOA. La deuxième étape consiste à analyser les enregistrements pour isoler les courants de transport de glutamate activés synaptiquement de tous les autres composants de la réponse évoquée.

Ensuite, la course temporelle du filtre est estimée en analysant les courants de transport enregistrés en présence de TBOA en impliquant le filtre de l’occurrence de transport enregistrée dans des conditions contrôlées. L’évolution temporelle de la clairance du glutamate des membranes astrocytaires est obtenue. Les résultats montrent que chez l’hippocampe de souris, les astrocytes n’ont besoin que de quelques millisecondes pour éliminer le glutamate libéré synaptiquement de la base de l’espace extracellulaire.

Cette approche fournit un outil sensible pour détecter les changements dans la capacité d’absorption des astrocytes dans différentes régions du cerveau dans des conditions physiologiques et pathologiques. Le principal avantage de cette approche par rapport à d’autres méthodes basées, par exemple, sur l’analyse de déplacement d’antagonistes des récepteurs du glutamate se dissociant rapidement sur des indicateurs fluorescents de glutamate ou sur des simulations informatiques de réaction de diffusion, est qu’elle fournit une lecture expérimentale directe à haute résolution temporelle de la clairance du glutamate des astrocytes. Cette méthode nous permet de comprendre la dynamique spatiale et temporelle de la transmission synaptique dans le cerveau.

Il peut nous aider à interpréter les changements physiopathologiques du glutamate, de la diffusion et de l’absorption qui peuvent survenir dans certains troubles neurologiques tels que la maladie d’Alzheimer. Commencez cette procédure en faisant cinq incisions sur un cerveau de souris disséqué à l’aide d’un scalpel. Tout d’abord, retirez les bulbes olfactifs et le cortex frontal.

Deuxièmement, retirez le cervelet. Ensuite, retirez les lobes temporaux gauche et droit. Séparez ensuite les deux hémisphères cérébraux avec une coupe sagittale.

Ensuite, collez la surface latérale de chaque section de cerveau sur la plaque de base froide du vibram. La face dorsale du cerveau doit faire face à la lame Vibram et la face ventrale du cerveau doit être en contact avec le bloc de gélose loin de la lame de vibrato. Fixez ensuite la plaque de base du vibrato à la chambre de dissection.

Réglez l’épaisseur de la tranche à 250 micromètres et ajustez la largeur de la lame avant de trancher. Une fois que la lame a traversé le cortex et l’hippocampe, utilisez un scalpel pour couper l’hippocampe du cortex du mésencéphale. Ensuite, placez une tranche dans la chambre d’immersion à 34 degrés Celsius après avoir maintenu les tranches à 34 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Laissez-les refroidir à température ambiante pendant 30 minutes avant de les utiliser pour les enregistrements électrophysiologiques Dans cette procédure, transférez une tranche dans la chambre d’enregistrement. Inspectez visuellement la tranche sous l’éclairage du point ou I-R-D-I-C. Les astrocytes peuvent être identifiés par leur petit corps cellulaire et leur noyau proéminent pour la stimulation synaptique.

Placez une électrode bipolaire en acier inoxydable à environ 100 micromètres de l’astrocyte que vous prévoyez de patcher. Patchez l’astrocyte et cassez toute la configuration cellulaire en appliquant une aspiration très douce. Ensuite, alternez les stimuli simples et appariés toutes les 10 à 20 secondes pour isoler les parties facilitées de l’occurrence de transport activée synaptiquement.

Tout d’abord, en moyenne d’au moins 20 balayages obtenus avec des stimulations appariées dans des conditions contrôlées, et en présence de 10 antagonistes micromolaires du transporteur du glutamate à large spectre. TBOA fait ensuite la moyenne d’un nombre identique de balayages obtenus avec des stimulations uniques dans des conditions de contrôle et dans 10 micromolaires TBOA soustrait la trace moyenne obtenue avec des stimulations uniques de la trace moyenne obtenue avec des stimulations appariées. Cette étape permet d’isoler la géométrie STO et le courant potassique soutenu évoqué par le deuxième stimulus.

Décalage suivant, la trace moyenne obtenue avec des stimulations uniques par un intervalle de temps qui correspond à l’intervalle PUL utilisé pour délivrer des impulsions appariées soustrait la réponse moyenne décalée dans le temps obtenue avec des stimulations uniques de la réponse moyenne au deuxième stimulus obtenu précédemment. Cette étape isole une partie facilitée du courant de transport évoqué par le deuxième stimulus. Dans la plupart des cas, cette étape élimine entièrement le courant de potassium soutenu.

Si tel est le cas, l’isolement du FSTC est complet et vous pouvez procéder à l’analyse de déconvolution et arriver à l’évolution temporelle de l’élimination du glutamate des astrocytes. Dans certains cas, cependant, un petit courant potassique soutenu est toujours présent et une analyse plus approfondie est nécessaire. Mesurez l’amplitude du courant potassique soutenu restant après la performance.

L’analyse décrite précédemment met à l’échelle l’amplitude de la fonction exponentielle mono à l’amplitude du courant potassique soutenu résiduel en fixant l’amplitude du courant potassique soutenu mesuré comme a dans cette équation. Mais la constante de temps de montée représente la valeur moyenne de la montée estimée dans des expériences distinctes dans lesquelles un courant potassique soutenu est isolé. Pharmacologiquement, en utilisant une concentration saturante élevée de TBOA, soustrayez ensuite la fonction monoexponentielle résultante du FSTC et du courant potassique soutenu.

Pour compléter l’isolement du FSTC. Pour isoler l’occurrence de transport activée par flash. Faites la moyenne d’au moins 20 balayages obtenus avec le trajet lumineux ouvert dans des conditions de contrôle et dans 10 TBOA micromolaires, puis faites la moyenne du même nombre de balayages obtenus avec le trajet lumineux fermé dans des conditions de contrôle, et dans 10 TBOA micromolaires, soustrayez la trace moyenne obtenue avec le trajet lumineux bloqué de la trace moyenne obtenue avec le trajet lumineux ouvert.

Cette étape permet d’éliminer l’artefact de stimulus et d’isoler les FTC dans cette étape, d’ajuster le courant de transport soit FSTC ou FTC enregistré dans des conditions de contrôle et dans 10 micromolaires TBOA et de les ajuster avec une fonction multi exponentielle, de créer une fonction instantanément croissante qui décroît mono exponentiellement selon cette fonction et qui décrit le mieux la phase de décroissance du transporteur Courant enregistré à 10 micromolaires TBOA. Ensuite, déléguez la fonction exponentielle mono à partir de l’ajustement du courant de transport enregistré dans 10 micromolaires TBOA pour dériver le filtre. Ensuite, déléguez le filtre de l’ajustement du courant du transporteur dans des conditions contrôlées.

Pour obtenir une estimation quantitative de l’évolution temporelle globale de la clairance du glutamate, calculez l’OID de la forme d’onde en essayant cette procédure. Il est important de confirmer que les occurrences de transport sont enregistrées dans des conditions expérimentales où le filtre fonctionne en régime linéaire et n’introduit que des distorsions linéaires du transport. L’onde de courant de ceux-ci peut être effectuée en vérifiant les manipulations qui modifient la taille du courant de transport.

Ne changez pas sa trajectoire de tampon. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser les enregistrements astrocytaires pour extraire des informations sur le glutamate, la diffusion et l’absorption dans le cerveau.