Name: Issu lévolution temporelle du glutamate Dégagement avec une analyse de déconvolution des courants de Transporteur ASTROCYTIQUES (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse par déconvolution pour estimer la durée de vie du glutamate au niveau des membranes astrocytaires dans l'hippocampe de souris. Cette technique électrophysiologique permet d'étudier la clairance synaptique avec une haute résolution temporelle.

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Ce travail a été financé par l&#39;Institut national des troubles neurologiques et du programme de recherche intra-muros Course (NS002986). AS a écrit le manuscrit et mis en œuvre l&#39;analyse de déconvolution. JSD développé la version initiale de l&#39;analyse de déconvolution et commenté le texte.

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<li>Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrogenic+uptake+of+glutamate+and+aspartate+into+glial+cells+isolated+from+the+salamander+%28Ambystoma%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina.</a> J. Physiol. 436, 169-193 (1991).</li>
<li>Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+coupled+and+uncoupled+currents+during+glutamate+uptake+by+GLT-1+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters.</a> J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).</li>
<li>Diamond, J. S., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+glutamate+does+not+overwhelm+transporters+on+hippocampal+astrocytes+during+high-frequency+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation.</a> J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).</li>
<li>Benediktsson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+glutamate+transporter+dynamics+in+developing+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes.</a> Glia. 60, 175-188 (2012).</li>
<li>Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+synaptic+glutamate+spillover+and+reuptake+by+linker+optimized+glutamate-sensitive+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).</li>
<li>Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid%CE%B21-42+slows+clearance+of+synaptically-released+glutamate+by+mislocalizing+astrocytic+GLT-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloidβ1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1.</a> J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent aucun conflit d&#39;intérêt.

Nous décrivons ici une approche expérimentale pour obtenir des enregistrements électrophysiologiques des astrocytes, un protocole d&#39;analyse pour isoler les courants de transporteur du glutamate dans les astrocytes et une méthode mathématique pour calculer le cours du temps de jeu glutamate à partir des courants de transporteurs astrocytaires. Le succès de l&#39;analyse repose sur la capacité à obtenir des enregistrements de patch clamp haute qualité à partir des astrocytes et de la préci...

Les astrocytes sont l&#39;un des types cellulaires les plus abondants dans le cerveau avec une morphologie en forme d&#39;étoile et des protubérances membranaires fines qui s&#39;étendent tout au long de la neuropile et atteignent voisins contacts synaptiques 1,2. La membrane de la cellule Les astrocytes de forte densité est emballé avec des molécules d&#39;transporteur du glutamate 3. Dans les conditions physiologiques, transporteurs du glutamate se lient rapidement glutamate sur le côté extracellulaire de la membrane et le transférer dans le cytoplasme de la cellule. Ce faisant, les transporteurs maintiennent bas la concentration basale de glutamate dans l&#39;espace extracellulaire 4. Transporteurs du glutamate dans les processus astrocytaires fins adjacents à excitateurs synapses sont idéalement positionnés pour lier glutamate libéré lors d&#39;événements synaptiques comme il diffuse loin de la fente synaptique. Ce faisant, les transporteurs limitent également les retombées glutamate vers et péri-régions extra-synaptiques et sur synapses voisines, ce qui réduit la dispersion spatiale du signal d&#39;excitations dans le cerveau de 5 à 7. Transport du glutamate est un processus électrogénique stoechiométrique couplé au mouvement de 3 Na + et H + 1 le long de leur gradient électrochimique et à la contre-transport de K + 1 8. Transport du glutamate est associée (mais pas stœchiométriquement couplé à) une conductance anionique perméable à la SCN - (thiocyanate)&gt; NO 3 - (nitrate) ≈ ClO 4 - (perchlorate)&gt; I -&gt; Br -&gt; Cl -&gt; F -, pas de CH 3 SO 3 - (méthane sulfonate) et C 6 H 11 O 7 - (gluconate) 9-11. Les deux courants (stoechiométrique ou non stoechiométrique) peuvent être enregistrées par l&#39;obtention d&#39;enregistrements de patch-clamp de cellules entières de astrocytes, identifiés visuellement sous un éclairage Dodt ou infra-rouge contraste d&#39;interférence différentiel (IR-DIC) dans acute tranches de cerveau 12. La composante stoechiométrique du courant associé au transport du glutamate à travers la membrane peut être isolé en utilisant CH 3 SO 3 -, ou 11 C 6 H o 7 - solutions intracellulaires base et peut être provoquée par le glutamate flash-uncaging sur les astrocytes 13,14, ou en activant la libération de glutamate à partir de synapses voisines, soit électriquement ou 12 avec une commande de optogenetic ciblée. L&#39;évolution temporelle de la composante stoechiométrique du courant transporteur est façonnée par la vie du profil de concentration du glutamate au niveau des membranes astrocytaires (c.-garde au glutamate), la cinétique de transporteurs du glutamate, les propriétés des membranes passives des astrocytes, et au cours de stimulations synaptiques, par le synchronicité de la libération de glutamate dans les synapses activées 13. Nous décrivons ici en détail: (1) une appr expérimentaleOach d&#39;isoler la composante stoechiométrique des courants de transporteur du glutamate à partir d&#39;enregistrements de patch-clamp de cellules entières de astrocytes en utilisant la souris coupes d&#39;hippocampe aigus comme exemple la préparation expérimentale, (2) une approche analytique pour dériver le cours du temps de jeu glutamate à partir de ces enregistrements 13, 14. Ces méthodes peuvent être utilisées pour enregistrer et analyser les courants de transporteur du glutamate de astrocytes dans n&#39;importe quelle région du système nerveux central.

<table><tbody><tr><td>CGP52432</td><td>Tocris</td><td>1246</td><td></td></tr><tr><td>(R,S)-CPP</td><td>Tocris</td><td>173</td><td></td></tr><tr><td>DPCPX</td><td>Tocris</td><td>439</td><td></td></tr><tr><td>LY341495 sel disodique</td><td>Tocris</td><td>4062</td><td></td></tr><tr><td>MSOP</td><td>Tocris</td><td>803</td><td></td></tr><tr><td>NBQX sel disodique</td><td>Tocris</td><td>1044</td><td></td></tr><tr><td>D,L-TBOA</td><td>Tocis</td><td>1223</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxine</td><td>Sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>MNI-L-glutamate</td><td>Tocris</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594</td><td>Life Technologies</td><td>A10438</td><td></td></tr><tr><td>Électrodes matricielles</td> en option <td>Frederick Haer Company</td><td>MX21AES(JD3)</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté</td><td>World Precision Instruments</td><td>PG10165-4</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micro-pipettes en verre à deux étages</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 404 adhésif instantané</td><td>Ted Pella</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>Lampe Xe</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>FlashMic</td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro 6</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

issu l&#39;évolution temporelle du glutamate dégagement avec une analyse de déconvolution des courants de transporteur astrocytiques

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

La plus forte densité de transporteurs du glutamate dans le cerveau se trouve dans les astrocytes. Le glutamate en couple de transporteurs le mouvement du glutamate à travers la membrane avec le co-transport de Na + et 3 1 H + et le contre-transport de K + 1. Le courant stoechiométrique généré par le processus de transport peut être contrôlée au moyen d&#39;enregistrements de patch-clamp de cellules entières provenant astrocytes. L&#39;évolution dans le temps du courant enregistré est façonné par l&#39;évolution temporelle du profil de concentration de glutamate qui astrocytes sont exposées, la cinétique de transporteurs du glutamate, et les propriétés des membranes passives électrotoniques astrocytiques. Nous décrivons ici les méthodes expérimentales et analytiques qui peuvent être utilisés pour enregistrer les courants de transporteur du glutamate dans les astrocytes et isoler le cours du temps de jeu glutamate de tous les autres facteurs qui façonnent la forme d&#39;onde des courants de transporteurs astrocytaires. Les méthodes décrites ici peuvent être utilisées pour estimer la durée de vie of flash-Uncaged et synaptiquement-glutamate libéré à membranes astrocytaires dans n&#39;importe quelle région du système nerveux central pendant la santé et la maladie.

Le succès de l&#39;approche analytique décrite ici dépend de façon critique sur l&#39;obtention des enregistrements électrophysiologiques haute qualité des courants de transporteur de astrocytes dans n&#39;importe quelle région du système nerveux central. Dans des coupes d&#39;hippocampe de souris aiguës, les astrocytes peuvent être facilement identifiés sous Dodt éclairage ou IR-DIC en raison de leur corps à petites cellules (Ø = 10 um) et le noyau de premier plan (Figure 1). Leur morphologie en forme ...

Nous décrivons une méthode analytique pour estimer la durée de vie de glutamate au niveau des membranes astrocytes à partir d&#39;enregistrements électrophysiologiques des courants de transporteur du glutamate dans les astrocytes.

Issu l&#39;évolution temporelle du glutamate Dégagement avec une analyse de déconvolution des courants de Transporteur ASTROCYTIQUES

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

L'objectif général de l'expérience est d'estimer le cours temporel de l'élimination du glutamate à partir des membranes astrocytaires après sa libération par les synapses excitatrices. La première étape de ce processus consiste à enregistrer l'activation synaptique du transport du glutamate provenant des astrocytes dans des tranches cérébrales aiguës, en l'absence et en présence d'une concentration sous-saturante d'un antagoniste large spectre des transporteurs du glutamate, le TBOA. La deuxième étape consiste à analyser les enregistrements afin d'isoler les courants synaptiquement activés des transporteurs du glutamate de toutes les autres composantes de la réponse évoquée.Ensuite, le cours temporel du filtre est estimé en analysant les courants du transporteur enregistrés en présence de TBOA, en déconvoluant le filtre à partir de l'événement de transport enregistré dans des conditions contrôlées. Le cours temporel de l'élimination du glutamate à partir des membranes astrocytaires est obtenu. Les résultats montrent que, dans l'hippocampe de la souris, les astrocytes n'ont besoin que de quelques millisecondes pour éliminer le glutamate libéré synaptiquement de l'espace extracellulaire.Cette approche fournit un outil sensible pour détecter les modifications de la capacité de captation des astrocytes dans différentes régions cérébrales au cours de conditions physiologiques et pathologiques. Le principal avantage de cette méthode par rapport à d'autres approches, par exemple celles fondées sur l'analyse du déplacement d'antagonistes des récepteurs du glutamate à dissociation rapide sur des indicateurs fluorescents du glutamate ou sur des simulations informatiques de réaction-diffusion, réside dans sa haute résolution temporelle et dans le fait qu'elle fournit une mesure expérimentale directe de l'élimination du glutamate par les astrocytes. Cette méthode nous permet de comprendre la dynamique spatiotemporelle de la transmission synaptique dans le cerveau.Il peut nous aider à interpréter les changements physiopathologiques du glutamate, de la diffusion et de la captation qui peuvent survenir dans certaines affections neurologiques telles que la maladie d'Alzheimer. Commencez cette procédure en effectuant cinq incisions sur un cerveau de souris disséqué à l’aide d’un scalpel. Retirez d’abord les bulbes olfactifs et le cortex frontal.Deuxièmement, retirez le cervelet. Ensuite, retirez les lobes temporaux gauche et droit. Puis séparez les deux hémisphères cérébraux par une coupe sagittale médiane.Ensuite, collez la surface latérale de chaque section cérébrale sur la plaque de base froide du vibromètre. Le côté dorsal du cerveau doit être orienté vers la lame du vibromètre, tandis que le côté ventral du cerveau doit être en contact avec le bloc d'agar, à l'opposé de la lame du vibromètre. Fixez ensuite la plaque de base du vibromètre à la chambre de dissection.Régler l'épaisseur de coupe à 250 micromètres et ajuster la largeur de la lame avant la découpe. Une fois que la lame a traversé le cortex et l'hippocampe, utiliser un scalpel pour séparer le cortex hippocampique du mésencéphale. Ensuite, placer une tranche dans la chambre d'immersion à 34 degrés Celsius après avoir maintenu les tranches à 34 degrés Celsius pendant 30 minutes.Les laisser refroidir à température ambiante pendant 30 minutes avant de les utiliser pour les enregistrements d'électrophysiologie dans cette procédure, transférer une tranche dans la chambre d'enregistrement. Examiner visuellement la tranche sous l'éclairage ponctuel ou I-R-D-I-C. Les astrocytes peuvent être identifiés par leur petit corps cellulaire et leur noyau marqué lors de la stimulation synaptique.Placer une électrode bipolaire en acier inoxydable à environ 100 micromètres de l'astrocyte que vous prévoyez de piquer. Piquer l'astrocyte et établir la configuration en cellule entière en appliquant une aspiration très légère. Ensuite, alterner des stimulations simples et appariées toutes les 10 à 20 secondes afin d'isoler les portions facilitées de l'occurrence du transport activé synaptiquement.Tout d'abord, moyennez au moins 20 balayages obtenus avec des stimulations jumelées dans des conditions contrôlées et en présence de 10 micromolaire d’un antagoniste large spectre des transporteurs du glutamate. TBOA, puis moyennez un nombre identique de balayages obtenus avec des stimulations simples en conditions de contrôle et en présence de 10 micromolaire de TBOA. Soustrayez le tracé moyen obtenu avec les stimulations simples du tracé moyen obtenu avec les stimulations jumelées. Cette étape permet d’isoler le courant géométrique STO et le courant soutenu de potassium induit par le second stimulus.Lors du décalage suivant, soustraire de la réponse moyenne au deuxième stimulus obtenue précédemment la trace moyenne obtenue avec des stimulations simples, décalée dans le temps, en utilisant un intervalle temporel correspondant à l'intervalle PUL utilisé pour délivrer des impulsions appariées. Cette étape permet d'isoler une composante facilitée du courant transporteur induit par le deuxième stimulus. Dans la plupart des cas, cette étape élimine entièrement le courant potassium soutenu.Si tel est le cas, l'isolement du FSTC est complet et vous pouvez procéder à l'analyse de déconvolution afin d'obtenir le tracé cinétique du retrait du glutamate par les astrocytes. Dans certains cas, toutefois, un faible courant potassique persistant est encore présent et une analyse supplémentaire est nécessaire. Mesurez l'amplitude du courant potassique persistant restant après la réalisation.L'analyse décrite précédemment ajuste l'amplitude de la fonction mono-exponentielle à l'amplitude du courant résiduel de potassium en plateau en fixant l'amplitude du courant de potassium en plateau mesuré comme étant « a » dans cette équation. Toutefois, la constante de temps de montée représente la valeur moyenne de la montée estimée dans des expériences distinctes au cours desquelles un courant de potassium en plateau est isolé. Pharmacologiquement, en utilisant une concentration saturante élevée de TBOA, puis soustraire la fonction mono-exponentielle résultante de la FSTC et du courant de potassium en plateau.Pour terminer l'isolement du FSTC. Pour isoler l'occurrence du transport activé par flash. Enregistrer en moyenne au moins 20 balayages obtenus avec le trajet lumineux ouvert dans les conditions de contrôle et en présence de 10 micromolaire de TBOA, puis faire la moyenne du même nombre de balayages obtenus avec le trajet lumineux fermé dans les conditions de contrôle et en présence de 10 micromolaire de TBOA. Soustraire la trace moyenne obtenue avec le trajet lumineux bloqué de la trace moyenne obtenue avec le trajet lumineux ouvert.Cette étape permet d'éliminer l'artéfact de stimulation et d'isoler les FTC ; dans cette étape, ajustez le courant de transport, soit le FSTC soit le FTC enregistré dans des conditions de contrôle et en présence de 10 micromolaire de TBOA, à l'aide d'une fonction multi-exponentielle. Créez ensuite une fonction à montée instantanée qui décroît de manière mono-exponentielle selon cette fonction et qui décrit au mieux la phase de décroissance du courant du transporteur enregistré en présence de 10 micromolaire de TBOA. Ensuite, déconvoluez la fonction mono-exponentielle à partir de l'ajustement du courant du transporteur enregistré en présence de 10 micromolaire de TBOA afin d'obtenir le filtre. Puis, déconvoluez ce filtre à partir de l'ajustement du courant du transporteur en conditions de contrôle.Pour obtenir une estimation quantitative du cours temporel global de l'élimination du glutamate, calculez l'OID de la forme d'onde lors de la réalisation de cette procédure. Il est important de vérifier que les événements de transport sont enregistrés dans des conditions expérimentales où le filtre fonctionne en régime linéaire et introduit uniquement des distorsions linéaires du transport. La forme du courant peut être vérifiée en examinant les manipulations qui modifient l'amplitude du courant de transport.Ne modifiez pas son cap. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser les enregistrements astrocytaires pour extraire des informations sur le glutamate, la diffusion et la capture dans le cerveau.

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Une méthode intégrée pour la modélisation photothrombotique de l’AVC et l’enregistrement in vivo des optrodes de l’activité neuronale et astrocytaire chez des souris en comportement

Cet article décrit en détail un protocole d'électroporation in utero du cortex cérébral et l'hippocampe à E14.5 chez la souris. Nous montrons aussi que cette méthode est précieuse pour étudier les dendrites et les épines dans ces deux régions cérébrales.

Visualisation et la manipulation génétique des dendrites et des épines dans le cortex cérébral et l&#39;hippocampe de souris à l&#39;aide<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation

Découvrez une méthode d'analyse par déconvolution pour estimer la durée de vie du glutamate au niveau des membranes astrocytaires dans l'hippocampe de souris. Cette technique électrophysiologique permet d'étudier la clairance synaptique avec une haute résolution temporelle.

Issu l'évolution temporelle du glutamate Dégagement avec une analyse de déconvolution des courants de Transporteur ASTROCYTIQUES

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