Préparation de neurones primaires pour visualiser Neurites à l'état congelé-hydraté utilisant microscopie cryo-électronique

Afin de préserver les processus neuronaux pour l'analyse ultrastructurale, nous décrivons un protocole pour le placage de neurones primaires sur des grilles de microscopie électronique suivies par la congélation instantanée, ce qui donne des échantillons en suspension dans une couche de glace vitreuse. Ces échantillons peuvent être examinés avec un microscope cryo-électronique pour visualiser les structures à l'échelle nanométrique.

L’objectif global de cette procédure est de développer des neurones primaires de rat de manière à ce que leurs neurones soient adaptés à la visualisation par cryo-microscopie électronique. Ceci est accompli en préparant d’abord des plats avec des grilles EM pour plaquer les neurones primaires. La deuxième étape consiste à préparer et à plaquer les neurones primaires sur des grilles EM.

Ensuite, la vitrification des neurones sur les grilles EM est effectuée. La dernière étape consiste à collecter des images par cryo-microscopie électronique, suivie d’un post-traitement et d’une annotation. Enfin, la cryo-microscopie électronique et la tomographie sont utilisées pour montrer l’ultrastructure des neurites à l’état hydraté congelé

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’elle peut être utilisée pour la visualisation 3D de neurites hydratés congelés à une résolution nanométrique sans l’utilisation de fixateurs chimiques. Par conséquent, faciliter l’évaluation des caractéristiques morphologiques qui sont plus proches de l’état d’origine. Commencez cette procédure en examinant l’intégrité du carbone sacré sur les grilles EM d’or.

À l’aide d’un microscope optique à un grossissement d’au moins 25 fois, assurez-vous que les trous de carbone sont intacts à plus de 98 %. Pour le placage des neurones primaires, utilisez un bec Bunsen pour stériliser à la flamme les grilles EM et les rendre simultanément hydrophiles. Transférez immédiatement la grille avec le côté carbone vers le haut au centre du verre.

Plat inférieur, placez une grille EM par plat et utilisez uniquement des plats à fond en verre pré-stérilisés. Ensuite, utilisez un microscope optique pour vérifier l’intégrité de la grille tout en gardant la grille EM à l’intérieur de la boîte à fond en verre dans une hotte de culture tissulaire, appliquez 250 microlitres de la substance de revêtement appropriée sur la zone centrale du verre de la boîte de Pétri. Lentement et soigneusement, assurez-vous que la substance de revêtement appropriée couvre toute la grille E EM.

Ensuite, couvrez la boîte de Pétri avec son couvercle et incubez les échantillons pendant une heure à température ambiante. Ensuite, aspirez tout le mélange de polyol lysine des plats à l’aide d’une pointe de pipette stérile fixée au tube à vide dans la hotte. Évitez tout contact direct avec le réseau E EM.

Par la suite, à l’aide d’une pipette à déplacement d’air réglable, appliquez soigneusement 250 microlitres de PBS stérile pour couvrir entièrement la grille EM dans la zone centrale du verre de chaque boîte de Pétri. Aspirez ensuite le PBS de chaque plat. Répétez la procédure trois fois après cela.

Laissez sécher les plats avec des grilles EM dans la hotte de culture tissulaire pendant 15 minutes. Vérification au microscope optique. Assurez-vous qu’ils sont complètement secs et qu’il n’y a pas de bulles d’humidité dans la grille.

Sinon, aspirez soigneusement à côté de la grille EM pour éliminer cette humidité supplémentaire, la grille revêtue doit être utilisée immédiatement pour plaquer les neurones. Dans cette procédure, calculez le volume approprié de cellules pour chaque parabole afin d’obtenir une concentration de 50 000 cellules par millilitre et par parabole. La quantité maximale d’application doit être de 250 microlitres pour remplir uniquement la zone centrale du verre, et non l’ensemble du plat.

Ensuite, incubez les boîtes pendant 30 minutes dans un incubateur de CO2 à 37 degrés Celsius pour permettre aux cellules de récupérer et d’adhérer après 30 minutes, ajoutez lentement 1,5 millilitre de milieu cellulaire chauffé dans chaque boîte et évitez de toucher la grille EM pour les neurones de l’hippocampe. Changez de support le lendemain, puis changez la moitié du support tous les deux jours pendant 14 jours. Dans cette procédure, préparez l’équipement et tous les matériaux pour la congélation et le stockage des grilles EM d’or à température cryogénique, qui comprennent un dispositif de vitrification avec une chambre d’humidité, du papier filtre sans calcium, une paire de pinces à épiler à pointe plate longue, une paire de pinces spécialisées à pointe fine pour la machine de vitrification, un faiseur d’azote liquide, un réservoir de liquide de refroidissement et la boîte de stockage EM Grid.

Allumez ensuite l’appareil de vitrification. Réglez l’humidité à 100 % et la température à 32 degrés Celsius. Dans la section des options, réglez le temps de bloc sur zéro seconde.

Cela permet un tamponnage manuel à travers la fenêtre latérale de la chambre d’humidité. Empilez ensuite trois papiers-filtres sans calcium. Coupez la pile en bandes de 0,5 centimètre de large d’environ deux centimètres de long, pliez-les à un angle de 90 degrés de sorte qu’une section du papier mesure 0,5 centimètre sur 0,5 centimètre.

Cette section sera utilisée pour éponger l’échantillon. Retirez le papier du milieu et placez-le sur un autre papier filtre sans calcium jusqu’à utilisation. Ensuite, utilisez la vitrification spécialisée à la pince à épiler pour prélever soigneusement la grille EM de la parabole.

Notez le côté de la grille EM sur lequel les neurones se développent, car la position comptera pour l’étape suivante. Utilisez ensuite le verrou coulissant noir sur la pince à épiler pour verrouiller solidement la pince à épiler sur la grille EM. Insérez maintenant la pince à épiler dans la machine de vitrification de manière à ce que le côté de la grille EM sur lequel les neurones sont collés soit orienté vers la gauche et à l’opposé du trou d’ouverture circulaire sur le côté de la machine de vitrification.

Rétractez ensuite la pince à épiler qui maintient la grille EM dans la machine de vitrification. Ensuite, placez le récipient de refroidissement rempli de LN deux adéquats et d’éthane liquide dans le support approprié de la machine de vitrification à l’aide de la commande d’écran appropriée de la machine de vitrification. Soulevez la chambre de refroidissement vers le haut jusqu’à ce qu’elle soit rincée avec le fond de la chambre d’humidité avec la pince à épiler à pointe plate.

Saisissez un bord du papier filtre de manière à ce que le côté le plus court soit perpendiculaire à la pince à épiler. Cette face entrera en contact direct avec la grille EM pour le transfert. Maintenant, insérez soigneusement le papier filtre dans le trou latéral de la chambre d’humidité de manière stable Maintenez le papier contre la grille EM pendant 10 secondes, jetez le papier et plongez immédiatement.

Congelez l’échantillon dans l’éthane liquide à l’aide de l’automatisation de la machine de vitrification. Ensuite, transférez soigneusement la grille EM hydratée congelée dans l’un des emplacements de stockage de la grille. Il s’agit d’une image au microscope optique de la zone centrale d’une grille EM à un grossissement de 10 fois sur laquelle les neurones primaires du rat se développent depuis deux semaines.

Voici la vue zoomée de l’aqua box où l’on observe les neurones et leurs projections de neurites. Il s’agit d’une micrographie électronique d’un neurite projeté vers l’extérieur à partir du corps du neurone à un grossissement de 4K. La boîte bleue est vue de près ici, où les caractéristiques internes des neurites sont clairement visibles à un grossissement de 20 K.

Cette vidéo montre une pile reconstruite en 3D de micrographies d’un neurite à partir de la culture primaire de neurones de l’hippocampe de rat. Il est imagé à l’aide de la tomographie et suivi de l’annotation couleur 3D correspondante. Voici une autre vidéo montrant une pile reconstruite en 3D d’images d’un axone ganglionnaire de la racine dorsale du rat collecté à l’aide de la cryo-tomographie électronique suivie de l’annotation de couleur 3D correspondante et montrée ici est le montage de quatre images cryo-EM 2D d’un axone ganglionnaire de la racine dorsale du rat séparé pris à un grossissement de 20 K.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer les neurones primaires sur des grilles de microscopie électronique de manière à ce qu’elle soit adaptée à la visualisation de leurs neurones dans un état hydraté congelé à l’aide de la cryotomographie électronique.