Name: In vitro Essai de coculture pour évaluer la migration transépithéliale des neutrophiles induite par l’agent pathogène (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-06T15:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Apprenez un essai de coculture in vitro pour évaluer la migration transépithéliale des neutrophiles induite par des agents pathogènes bactériens. Cette méthode quantifie la migration cellulaire à l'aide d'essais de myéloperoxydase.

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Ces travaux ont été soutenus financièrement par les NIH (1 R01 AI095338-01A1).

<ol><li>Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+structural+features+that+influence+neutrophil+emigration+into+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung.</a> Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).</li>
<li>Hurley, B. P., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+defense+systems+protect+against+bacterial+threats%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gastroenterol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats.</a> Curr. Gastroenterol. Rep. 6, 355-361 (2004).</li>
<li>McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial-induced+hepoxilin+A3+secretion+as+a+pro-inflammatory+mediator%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Bacterial-induced hepoxilin A3 secretion as a pro-inflammatory mediator.</a> FEBS J. 274, 3513-3518 (2007).</li>
<li>Mumy, K. L., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neutrophils+in+the+event+of+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The role of neutrophils in the event of intestinal inflammation.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 697-701 (2009).</li>
<li>Chin, A. C., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathobiology+of+neutrophil+transepithelial+migration%3A+implications+in+mediating+epithelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury.</a> Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).</li>
<li>Segel, G. B., Halterman, M. W., Lichtman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+paradox+of+the+neutrophil%27s+role+in+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">The paradox of the neutrophil's role in tissue injury.</a> J. Leukoc. Biol. 89, 359-372 (2011).</li>
<li>Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+destruction+by+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue destruction by neutrophils.</a> N. Engl. J. Med. 320, 365-376 (1989).</li>
<li>Hurley, B. P., Thorpe, C. M., Acheson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shiga+toxin+translocation+across+intestinal+epithelial+cells+is+enhanced+by+neutrophil+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration.</a> Infect. Immun. 69, 6148-6155 (2001).</li>
<li>Kohler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+regulates+intercellular+junction+proteins+and+facilitates+transepithelial+neutrophil+and+bacterial+passage%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).</li>
<li>Gane, J., Stockley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neutrophil+transmigration+across+the+vascular+endothelium+in+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD.</a> Thorax. 67, 553-561 (2012).</li>
<li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neutrophils+to+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Contribution of neutrophils to acute lung injury.</a> Mol. Med. 17, 293-307 (2011).</li>
<li>Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophilic+inflammation+in+severe+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Arch.+Allergy+Immunol.%22%5BJournal%5D)">Neutrophilic inflammation in severe asthma.</a> Int. Arch. Allergy Immunol.. 158 Suppl 1, 96-102 (2012).</li>
<li>Choi, E. Y., Santoso, S., Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neutrophil+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neutrophil transendothelial migration.</a> Front. Biosci. 14, 1596-1605 (2009).</li>
<li>Louis, N. A., Campbell, E., Colgan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+to+investigate+neutrophil+adhesion+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Model systems to investigate neutrophil adhesion and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 412, 257-270 (2007).</li>
<li>Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+to+the+lungs+during+bacterial+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia.</a> Infect. Immun. 77, 568-575 (2009).</li>
<li>Hurley, B. P., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+tissue+culture+results+into+animal+models%3A+the+case+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium.</a> Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).</li>
<li>Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro neutrophil transepithelial migration.</a> Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).</li>
<li>Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphonuclear+cell+transmigration+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+requires+the+eicosanoid+hepoxilin+A3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3.</a> J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).</li>
<li>McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+attachment+to+human+intestinal+epithelial+monolayers%3A+transcellular+signalling+to+subepithelial+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils.</a> J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).</li>
<li>McCormick, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+attachment+of+Salmonella+typhimurium+to+intestinal+epithelia+imprints+the+subepithelial+matrix+with+gradients+chemotactic+for+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils.</a> J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).</li>
<li>Mrsny, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hepoxilin+A3+in+inflammatory+events%3A+a+required+role+in+neutrophil+migration+across+intestinal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).</li>
<li>Tamang, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepoxilin+A%283%29+facilitates+neutrophilic+breach+of+lipoxygenase-expressing+airway+epithelial+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers.</a> J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).</li>
<li>McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+secretion+of+a+pathogen-elicited+epithelial+chemoattractant+activity+in+response+to+surface+colonization+of+intestinal+epithelia+by+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium.</a> J. Immunol. 160, 455-466 (1998).</li>
<li>Boll, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroaggregative+Escherichia+coli+promotes+transepithelial+migration+of+neutrophils+through+a+conserved+12-lipoxygenase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway.</a> Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).</li>
<li>Hurley, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two-component+sensor+response+regulator+RoxS%2FRoxR+plays+a+role+in+Pseudomonas+aeruginosa+interactions+with+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells.</a> Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).</li>
<li>Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+phospholipase+A2+in+Pseudomonas+aeruginosa-mediated+PMN+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).</li>
<li>McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+the+Shigella+flexneri+virulence+plasmid+in+the+ability+to+induce+trafficking+of+neutrophils+across+polarized+monolayers+of+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium.</a> Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).</li>
<li>Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+a+noninvasive+enteric+pathogen%2C+enteropathogenic+Escherichia+coli%2C+to+cultured+human+intestinal+epithelial+monolayers+induces+transmigration+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils.</a> Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).</li>
<li>Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ERM+protein%2C+ezrin%2C+regulates+neutrophil+transmigration+by+modulating+the+apical+localization+of+MRP2+in+response+to+the+SipA+effector+protein+during+Salmonella+typhimurium+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection.</a> Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).</li>
<li>Pazos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+resistance-associated+transporter+2+regulates+mucosal+inflammation+by+facilitating+the+synthesis+of+hepoxilin+A3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3.</a> J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).</li>
<li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li>
<li>Bhowmick, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Disease+during+Streptococcus+pneumoniae+Acute+Lung+Infection+Requires+12-Lipoxygenase-Dependent+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation.</a> J. Immunol. , (2013).</li>
<li>Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+eicosanoid-generating+capacity+of+cytoplasmic+phospholipase+A2+in+Pseudomonas+aeruginosa-infected+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).</li>
<li>Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+molecules+involved+in+hepoxilin+A3-mediated+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration.</a> Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).</li>
<li>Frank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+Topic+on+Pseudomonas+aeruginosa%2C+Biology%2C+Genetics%2C+and+Host-Pathogen+Interactions.%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions.</a> Front. Microbiol. 3, 20 (2012).</li>
<li>Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+infections+associated+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Lung infections associated with cystic fibrosis.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).</li>
<li>Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa-mediated+damage+requires+distinct+receptors+at+the+apical+and+basolateral+surfaces+of+the+polarized+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium.</a> Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).</li>
<li>Kierbel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exploits+a+PIP3-dependent+pathway+to+transform+apical+into+basolateral+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane.</a> J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).</li>
<li>Lee, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+Salmonella+protein+induces+a+proinflammatory+response+in+epithelial+cells%2C+which+promotes+neutrophil+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).</li>
<li>Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+flexneri+type+III+secretion+system+effectors+OspB+and+OspF+target+the+nucleus+to+downregulate+the+host+inflammatory+response+via+interactions+with+retinoblastoma+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein.</a> Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).</li>
<li>Brazil, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+across+intestinal+epithelium%3A+evidence+for+a+role+of+CD44+in+regulating+detachment+of+migrating+cells+from+the+luminal+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface.</a> J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).</li>
<li>Lawrence, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiadhesive+role+of+apical+decay-accelerating+factor+%28CD55%29+in+human+neutrophil+transmigration+across+mucosal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia.</a> J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).</li>
<li>Hodges, K., Hecht, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+communication+in+the+gut%2C+from+bacterial+delivery+to+host-cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response.</a> J. Physiol. 590, 433-440 (2012).</li>
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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La migration des neutrophiles à travers les surfaces épithéliales muqueuses est une caractéristique commune dans la pathologie de la maladie après une infection par des agents pathogènes bactériens3. La méthodologie décrite ici offre une approche rapide et simple pour isoler expérimentalement cet événement discret en utilisant un système d’analyse de coculture in vitro dérivé de cellules humaines qui modélise une caractéristique du processus inflammatoire déclenché par des infections bactériennes. Ce ...

Les surfaces muqueuses servent de barrières physiques et immunologiques offrant une protection contre les menaces externes omniprésentes dans l’environnement1,2. Cette barrière épithéliale protectrice peut être compromise lorsque des organismes pathogènes envahissent2. Dans le cas d’un agent pathogène bactérien, cette rencontre provoque souvent un processus inflammatoire en activant le système immunitaire inné et en déclenchant une mobilisation rapide des granulocytes premiers répondants appelés neutrophiles2-4. Les agents chimiotactiques facilitant le recrutement des neutrophiles sont produits en partie par les cellules épithéliales muqueuses cherchant à débarrasser l’hôte de l’agent pathogène incriminé2-4. Infiltration excessive ou non résolue de neutrophiles de la surface épithéliale muqueuse peut provoquer une pathologie importante1,5. Il s’agit d’une conséquence des lésions tissulaires non spécifiques causées par l’arsenal neutrophile antibactérien5-7. Dans de tels cas, la capacité bactérienne de clairance des neutrophiles est éclipsée par la destruction du tissu de centre serveur pendant une insulte infectieuse.  La perturbation de la fonction protectrice de la barrière épithéliale peut entraîner une exposition accrue des tissus sous-jacents à des micro-organismes et/ou à des toxines, exacerbant davantage la pathologie de la maladie8,9. Ces conséquences peuvent être observées dans plusieurs systèmes d’organes, y compris le poumon et le tube digestif1,5. En outre, les conditions inflammatoires non infectieuses telles que les épisodes sévères d’asthme, la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) et la maladie inflammatoire de l’intestin (MII) sont marquées par la rupture pathologique de la barrière épithéliale muqueuse par une réponse neutrophile excessive4,5,10-12.
Le processus complexe de recrutement des neutrophiles suivant une infection muqueuse implique plusieurs étapes compartimentées1,5,13,14. Tout d’abord, les neutrophiles doivent s’écarter de la circulation via une série d’interactions de cellule à cellule qui facilitent la migration trans-endothéliale1,13. Les neutrophiles naviguent ensuite dans l’espace interstitiel existant contenant la matrice extracellulaire1,14. Pour atteindre la lumière de la muqueuse infectée, les neutrophiles doivent alors migrer à travers la barrière épithéliale1,4,5. Ce phénomène complexe en plusieurs étapes est souvent étudié dans son ensemble à l’aide de modèles animaux in vivo d’infection15. De tels modèles sont utiles pour établir la nécessité de facteurs spécifiques, tels que les chimiokines, les molécules d’adhésion ou les voies de signalisation qui participent au processus global, mais sont largement inadéquats pour résoudre les contributions moléculaires critiques pour chaque étape compartimentée distincte16. Les systèmes in vitro coculturels modélisant la migration trans-endothéliale, trans-matricielle ou trans-épithéliale des neutrophiles ont été particulièrement utiles à cet égard1,14,16,17.
Un système robuste de dosage de coculture a été développé dans le but de déchiffrer les mécanismes responsables de la migration transépithéliale des neutrophiles en réponse à l’infection pathogène18-22. Ce modèle consiste à infecter la surface apicale des couches de cellules épithéliales humaines polarisées avec un agent pathogène bactérien suivie de l’application de neutrophiles humains fraîchement isolés sur la surface basolatérale18-22. Les neutrophiles migrent à travers la barrière épithéliale en réponse aux produits chimiotactiques épithéliaux-dérivés sécrétés après l’infection pathogène18,21-23. Ce système modèle a été utilisé en utilisant des cultures épithéliales intestinales et pulmonaires exposées à des agents pathogènes bactériens spécifiques aux tissus appropriés et a dévoilé de nouveaux mécanismes moléculaires probablement importants pour le processus de recrutement des neutrophiles lors de l’infection muqueuse3,8,19,24-28. La force de ce modèle de coculture in vitro est qu’une approche réductionniste permet au chercheur de manipuler expérimentalement l’agent pathogène, la barrière épithéliale et/ou le neutrophile dans un système bien contrôlé, hautement reproductible et assez peu coûteux. Les informations recueillies à partir de cette approche peuvent être efficacement exploitées pour effectuer une analyse ciblée des événements compartimentés lors du recrutement des neutrophiles à l’aide de modèles d’infection in vivo 22,29,30.
Cet article démontre les étapes multiples nécessaires pour que l’établissement réussi de ce modèle reproductible explore la migration trans-épithéliale induite par neutrophile par microbe pathogène. Des barrières épithéliales de poumon infectées avec l’agent pathogène Pseudomonas aeruginosa sont présentées dans cet article ; cependant, d’autres épithéliums tissulaires et agents pathogènes peuvent être substitués avec des modifications mineures. L’ensemencement et la culture des couches polarisées de cellules épithéliales de poumon sur les filtres perméables enrobés de collagène inversés sont détaillés ci-dessous, de même que la croissance de l’aeruginosa pathogène de P. et l’isolement des neutrophiles du sang total. Comment ces composants sont combinés pour observer la migration trans-épithéliale induite par le microbe pathogène de neutrophile est présentée avec les contrôles positifs et négatifs appropriés pour établir une analyse reproductible. La polyvalence de cette approche pour examiner de divers aspects de la migration trans-épithéliale induite par neutrophile par microbe pathogène est discutée concernant des études spécifiques dans la littérature.

<table><tbody><tr><td>NCl-H292 cellules</td><td>ATCC</td><td>CRL-1848</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 moyenne</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa PAO1</td><td>ATCC#</td><td>47085</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli MC1000</td><td>ATCC#</td><td>39531</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1x) liquide</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td>sans calcium ni magnésium</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>10 % ajouté au milieu de culture</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>100x : 10 000 unités de pénicilline et 10 000 &micro ; g de streptomycine par ml.</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05 %)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td>50 ml les aliquotes sont conservées congelées à -20 °C. L’aliquote en cours d’utilisation peut être stockée à 4 &ordm ; C à court terme. &nbsp ;</td></tr><tr><td>Hank’s Balanced Salt Solution - HBSS(-)</td><td>Invitrogen</td><td>14175-079</td><td>Stérile, sans calcium et magnésium</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061.</td><td>Stock = 0,4 %</td></tr><tr><td>Collagène, queue de rat</td><td>Invitrogen</td><td>A10483-01</td><td>Peut également être isolé en laboratoire directement à partir de la queue de rats à l’aide de protocoles standard</td></tr><tr><td>Acide citrique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909-500G</td><td>Composant du tampon de citrate 1 M et de la solution de citrate acide dextrose (ACD)</td></tr><tr><td>Citrate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641-500G</td><td>Composant du tampon de citrate 1 M</td></tr><tr><td>Dextrose anhydre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8066-250G</td><td>Composant de la solution de citrate acide de dextrose (ACD)</td></tr><tr><td>Chlorure d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213330-500G</td><td>Composant du tampon de lyse des globules rouges (GR)</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-500G</td><td>Composant du tampon de lyse des globules rouges (GR)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED-100G</td><td>Composant du tampon de lyse des globules rouges (GR)</td></tr><tr><td>HBSS(+) poudre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1387-10L</td><td>Composant clé de HBSS+</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td>Composant de HBSS+</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><td>Suivez les instructions du fournisseur pour revêtir les pointes de pipette en verre</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) sel diammonique (ABTS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9941-50TAB</td><td>Composant clé de la solution de substrat ABTS Solution de</td></tr><tr><td>peroxyde d’hydrogène à 30 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><td>Composant de la solution de substrat ABTS</td></tr><tr><td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP ou fMLF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-3506</td><td>Une solution mère de 10 mM dans du DMSO doit être préparée et les aliquotes stockées à -20 &ordm ;C.</td></tr><tr><td>Gélatine de type B</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-12026</td><td></td></tr><tr><td>Gélose d’isolement de Pseudomonas&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0927-17-1</td><td>Suivre le fabricant' s instructions pour la fabrication des plaques PIA</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-749</td><td>En option, peut améliorer la pureté des neutrophiles</td></tr><tr><td>Plaque de migration à 24 puits</td><td>Corning Incorporated</td><td>#3524</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de lavage à 24 puits</td><td>Falcon</td><td>35-1147</td><td>Peut être réutilisée si elle est trempée dans de l’éthanol à 70 % et soigneusement lavée avant de réutiliser</td></tr><tr><td>Plaque à 96 puits</td><td>Fisher Scientific</td><td>#12565501</td><td></td></tr><tr><td>Supports perméables Transwell&nbsp ;</td><td>Corning Incorporated</td><td>#3415</td><td>Polycarbonate ; Diamètre : 6,5 mm ; Surface végétative : 0,33 cm2 ; Style de plat : assiette à 24 puits ; Taille des pores : 3,0 & micro ; m</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Falcon</td><td>35-1013</td><td>Chaque boîte de Pétri contient 24 transwells inversés de 0,33 cm2. &nbsp ;</td></tr><tr><td>500 ml 0,2 &mu ; m filtre / fiole</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-25A</td><td>Pour stériliser une solution de citrate de dextrose acide (ACD)</td></tr><tr><td>5-3/4 en verre Pipette Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>Enduire les pointes de Sigmacote avant utilisation</td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-14</td><td></td></tr><tr><td>Microscope invertoskop</td> incurvé et dentelé <td>Zeiss</td><td>#342222</td><td></td></tr><tr><td>Versa-Max Dispositifs moléculaires de lecteur de microplaques</td><td></td><td>#432789</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro essai de coculture pour évaluer la migration transépithéliale des neutrophiles induite par l’agent pathogène

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Les surfaces muqueuses servent de barrières protectrices contre les organismes pathogènes. Les réponses immunitaires innées sont activées lors de la détection de l’agent pathogène conduisant à l’infiltration de tissus avec des cellules inflammatoires migratrices, principalement des neutrophiles. Ce processus a le potentiel d’être destructeur pour les tissus s’il est excessif ou maintenu dans un état non résolu.  Des modèles in vitro cocultured peuvent être utilisés pour étudier les mécanismes moléculaires uniques impliqués dans la migration trans-épithéliale induite par l’agent pathogène de neutrophile. Ce type de modèle offre une polyvalence dans la conception expérimentale avec possibilité de manipulation contrôlée de l’agent pathogène, de la barrière épithéliale ou des neutrophiles. L’infection pathogène de la surface apicale des monocouches épithéliales polarisées cultivées sur des filtres perméables de transwell incite basolateral physiologiquement approprié à la migration trans-épithéliale apicale des neutrophiles appliquées à la surface basolateral. Le modèle in vitro décrit ici démontre les étapes multiples nécessaires pour démontrer la migration de neutrophile à travers une monocouche épithéliale polarisée de poumon qui a été infectée par le pathogène P. aeruginosa (PAO1). L’ensemencement et la culture des transwells perméables avec les cellules épithéliales dérivées humaines de poumon est décrit, avec l’isolement des neutrophiles du sang humain total et la culture de PAO1 et de K12 E. coli non pathogène (MC1000).  Le processus émigrationnel et l’analyse quantitative des neutrophiles migrés avec succès qui ont été mobilisés en réponse à l’infection pathogène sont montrés avec des données représentatives, y compris des contrôles positifs et négatifs. Ce système de modèle in vitro peut être manipulé et appliqué à d’autres surfaces muqueuses. Les réponses inflammatoires qui impliquent l’infiltration excessive de neutrophile peuvent être destructives aux tissus de centre serveur et peuvent se produire en l’absence des infections pathogènes. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires qui favorisent la migration transépithéliale des neutrophiles par la manipulation expérimentale du système d’analyse de coculture in vitro décrit ici a un potentiel significatif d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour une gamme de maladies infectieuses et inflammatoires muqueuses.

Plusieurs études ont démontré que les couches épithéliales infectées par des agents pathogènes facilitent la migration transépithéliale des neutrophiles3,8,19,24-28,31,32. Ceci se produit par l’intermédiaire d’une induction pathogène-spécifique d’un gradient chimiotactique cellule-dérivé de cellules épithéliales de neutrophile3,23. Par exemple, P. aeruginosa pathogène interagissant avec la surface apicale des cellules épithéliales pulmonaires provoque la migration d’un nombre important de n...

La migration trans-épithéliale de neutrophile en réponse à l’infection bactérienne muqueuse contribue aux dommages épithéliaux et à la maladie clinique. Un modèle in vitro a été développé qui combine l’agent pathogène, les neutrophiles humains, et les couches humaines polarisées de cellules épithéliales cultivées sur des filtres de transwell pour faciliter des investigations vers démêler les mécanismes moléculaires orchestrant ce phénomène.

In vitro Essai de coculture pour évaluer la migration transépithéliale des neutrophiles induite par l’agent pathogène

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

L’objectif global de l’expérience suivante est de déterminer le nombre de neutrophiles qui ont traversé une monocouche de cellules épithéliales en réponse à une infection. Ceci est réalisé en codant le collagène des transwells avant de cultiver soigneusement les monocouches de cellules épithéliales à l’aide de la manœuvre de filtre transwell inversé. Dans un deuxième temps, un pathogène bactérien est cultivé afin d’infecter la surface apicale de la monocouche épithéliale cultivée sur les filtres transwell, ce qui amène les cellules épithéliales à produire des attractifs de chimiothérapie neutrophiles endogènes.Ensuite, des neutrophiles isolés du sang total sont ajoutés à la face basolatérale des monocouches épithéliales infectées cultivées sur des filtres transpuits pour mesurer la migration des neutrophiles de la face basolatérale à la face apicale. On obtient des résultats qui montrent une augmentation significative du nombre de neutrophiles trans-épithéliales migrateurs observés en réponse à des monocouches épithéliales infectées sur la base de la quantification de la myélo peroxydase à partir de neutrophiles migrés. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la manœuvre du filtre transpuits inversé pour développer et infecter les barrières épithéliales n’est pas conventionnelle et peut donc être moins accessible pour des groupes de recherche inconnus à établir dans leur laboratoire.Les implications de cette technique s’étendent au traitement des maladies inflammatoires des voies respiratoires impliquant des infections telles que la pneumonie ou la mucoviscidose, car de nouveaux traitements peuvent être développés et testés pour réduire la quantité de migration transépithéliale des neutrophiles, ce qui peut atténuer les effets délétères d’une rupture trop zélée des barrières muqueuses neutrophiles. En plus de Mark, qui est boursier clinique dans mon laboratoire, la démonstration de la procédure sera faite par le technicien principal Wahi Preza et le boursier postdoctoral Michael Pesos. Pour commencer, retirez de l’emballage des Transwells d’une taille de pores de 0,33 centimètre carré et placez la plaque à 24 puits contenant 12 transwells à l’envers à l’intérieur du capot.Soulevez la plaque inférieure et mettez-la de côté. Transwells sera maintenant à l’envers. Reposant sur le couvercle de la flamme de la plaque à 24 puits, un hémostat pour la stérilité et laisser refroidir.À l’aide de l’hémostat stérile, transférez les transwells dans une boîte de Pétri de 150 x 25 millimètres, en les maintenant en position inversée, pipetez 70 microlitres d’une solution de collagène préparée de 30 microgrammes par millilitre dans de l’éthanol sur la membrane filtrante de chaque surface de transwell inversée. Veillez à ce que la solution de collagène ne coule pas sur le côté du transwell et évitez de déplacer les transwells pendant la procédure d’enrobage. Laissez le couvercle de la boîte de Pétri éteint pendant au moins quatre heures pour permettre à l’éthanol de s’évaporer afin de maintenir la stérilité pendant ce processus.Gardez le ventilateur de la hotte et la lumière ultraviolette allumés après l’emballage des cellules épithéliales comme décrit dans le protocole de texte. Ajoutez 70 microlitres de la solution de cellules suspendues Resus à partir d’un tube de 15 millilitres à chaque transwell enduit de collagène inversé. Mélangez la suspension cellulaire en inversant doucement le tube périodiquement pour éviter que les cellules ne se déposent au fond du tube de 15 millilitres pendant l’ensemencement des puits de transbordement.Une fois que tous les transwells inversés ont été ensemencés avec des cellules épithéliales, replacez le couvercle de la boîte de Pétri et placez soigneusement les cellules dans l’incubateur de culture tissulaire le lendemain. Ajoutez un millilitre de milieu dans chaque puits de la plaque stérile d’origine à 24 puits et utilisez un hémostat stérilisé pour retourner chaque puits trans inversé dans chaque puits contenant un millilitre de milieu. Ajoutez 0,2 millilitre de milieu dans la chambre supérieure de chaque puits trans et retournez dans l’incubateur de culture tissulaire.Retirez de l’incubateur la plaque de 24 puits supportant les couches épithéliales qui ont été cultivées sur la face inférieure des membranes filtrantes Transwell pendant au moins huit jours. Saisissez le bord de chaque puits trans avec un hémostat et retirez-le de la plaque à 24 puits. Retournez le transpuits au-dessus d’un seau à déchets pour jeter le milieu de culture de la chambre intérieure du transwell.Trempez chaque transwell dans un gobelet contenant la solution saline équilibrée de Hank’s avec du calcium et du magnésium ou Hank’s Plus pour remplir la chambre intérieure du Transwell. Ensuite, jetez le liquide de la chambre intérieure dans un seau à déchets. Répétez cette étape pendant une seconde.Lavez dans Hank’s plus après deux lavages. Placez les Transwells dans une nouvelle plaque de 24 puits contenant un millilitre de Hank’s Plus. Dans chaque puits, observez la chambre supérieure de chaque transpuits pour évaluer l’intégrité de la couche de cellules épithéliales.Hank’s Plus ne doit pas s’infiltrer et remplir la chambre supérieure du Transwell lorsqu’il est placé dans le puits d’une plaque de 24 puits contenant un millilitre de Hank’s Plus. Après avoir soigneusement observé chaque puits de transfusion, ajoutez 0,2 millilitre de Hanks Plus dans la chambre supérieure. Placez la plaque dans l’incubateur pendant 30 à 60 minutes pour équilibrer les couches de cellules épithéliales afin d’effectuer le test de migration trans-épithéliale des neutrophiles.Saisissez chaque puits avec un hémostat de la plaque de 24 puits de Wash Transwells équilibrée dans Hank’s Plus et jetez le liquide du puits supérieur dans un seau à déchets. Placez chaque transpuits à l’envers dans une boîte de Pétri de 150 x 25 millimètres pour six des transpuits inversés. Ajoutez 25 microlitres de Hanks plus à trois des puits inversés.Infectez les cellules avec 25 microlitres de Pseudomonas, arosa ou Pao un dilué dans Hanks plus préparé comme décrit dans le protocole de texte aux trois derniers Transwells inversés infectez les cellules avec 25 microlitres de e Coli, K 12 ou mc 1000 dilué dans Hanks Plus également préparé comme décrit dans le protocole de texte après incubation à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans une chambre humidifiée pendant 60 minutes. Lavez les puits en les saisissant avec un hémostat et en les retournant dans une plaque de lavage à 24 puits contenant un millilitre de Hank’s plus. Dans les chambres inférieures.Ajoutez 0,2 millilitre de Hank’s plus dans les chambres supérieures. Saisissez le Transwell à l’aide d’un hémostat et retirez-le de la première plaque de lavage. Jetez le liquide de la chambre supérieure dans un seau à déchets.Avant de placer les Transwells dans une deuxième plaque de lavage à 24 puits contenant un millilitre de Hanks plus, ajoutez 0,2 millilitre de Hanks plus dans la chambre supérieure. Répétez cette étape une fois de plus pour un total de trois lavages. Après le troisième lavage, jetez le liquide des chambres supérieures des puits trans dans un seau à déchets à l’aide d’un appareil placé trois des puits trans non infectés dans trois puits de la plaque de migration de 24 puits contenant un millilitre de Hanks Plus, qui représente la pipette de contrôle négatif de 10 microlitres d’une solution de 10 micromolaires de FMLP dans chacun des trois puits de la plaque de migration de 24 puits contenant un millilitre de Hanks et placer trois des puits trans non infectés dans trois puits de la plaque de migration de 24 puits contenant 100 FMLP nanomolaires, ce qui représente un contrôle positif de la capacité des neutrophiles isolés à migrer.Ensuite, placez les trois puits trans infectés par le PAO un et les trois puits trans infectés par le mc 1000 dans les trois puits correspondants de la plaque de migration de 24 puits contenant un millilitre d’écheveaux et ajoutez 0,1 millilitre d’écheveaux plus dans la chambre supérieure de chaque puits trans au-dessus des ébourgeons de 0,1 millilitre plus dans chaque trans. Eh bien, ajoutez soigneusement 20 microlitres de la suspension de neutrophiles préparée comme décrit dans le protocole de texte. Incuber pendant deux heures pour permettre la migration trans épithéliale des neutrophiles.Après deux heures de migration, soulevez les puits en les saisissant à l’aide d’un hémostat et en tapotant doucement contre les parois intérieures de la plaque de migration à 24 puits. Avant de jeter les puits trans, évaluez grossièrement la migration des neutrophiles dans les puits en observant les puits de la plaque de migration de 24 puits sous un microscope inversé à l’aide de l’objectif 10 x. Ajoutez ensuite 50 microlitres de 10 % Triton X 100 à chaque puits utilisé dans la plaque de migration de 24 puits, chaque étalon et l’ébauche.Faites pivoter les étalons de la plaque de migration de 24 puits et blanchissez à basse vitesse pendant 20 minutes. À quatre degrés Celsius. Ajouter 50 microlitres de tampon de citrate.Deux bien utilisés dans la plaque de migration de 24 puits pour chaque étalon et pour l’ébauche à fond. Mélangez bien le contenu de chaque échantillon en pipetant la solution de haut en bas au moins cinq fois. Transférez ensuite 100 microlitres de chaque puits d’échantillon en double sur une plaque de transfert à 96 puits, 100 microlitres de chaque étalon et l’ébauche sur la plaque à 96 puits.Après le mélange, ajoutez 50 microlitres de peroxyde d’hydrogène à 30 % à la solution A BTS et vortex. Ajoutez ensuite 100 microlitres de solution de substrat A BTS à chaque échantillon. Sur la plaque à 96 puits, laissez la plaque se développer pendant cinq à 10 minutes dans l’obscurité.Observez l’évolution de la couleur verte dans les puits de la plaque contenant les neutrophiles de lyse avant de lire à une longueur d’onde de 405 nanomètres. À l’aide d’un lecteur de microplaques pour évaluer la migration trans-épithéliale des neutrophiles, les neutrophiles qui ont complètement migré à travers la couche épithéliale jusqu’à la chambre apicale peuvent être visualisés dans le puits inférieur de la plaque de migration à 24 puits, comme visualisé ici à l’aide d’un microscope à lumière inversée. On a observé que très peu de neutrophiles migrent à travers une couche épithéliale non infectée sans gradient chimiotactique imposé et représentent les niveaux de fond dans l’essai.En revanche, une abondance de neutrophiles transmi était apparente lorsqu’un gradient FMLP était fourni. L’infection de l’épithélium par e coli mc 1000 non pathogène a entraîné un faible nombre de neutrophiles transmigrés visibles, alors que de nombreux neutrophiles transmigrés étaient observables lorsque les couches épithéliales étaient infectées par l’aérogène pathogène pulmonaire pseudomonas aerogen. Les neutrophiles qui ont migré dans l’expérience sont quantifiés en mesurant leur activité myélo peroxydase.Le nombre de neutrophiles est positivement corrélé avec la quantité d’activité de la peroxydase mesurée après la lyse des neutrophiles, les valeurs présentant une relation linéaire dans la plage du nombre de neutrophiles sélectionnée pour la courbe standard. Un nombre important de neutrophiles migrent à travers les couches épithéliales en réponse à un gradient FMLP fourni par A, ou en réponse à une couche épithéliale infectée par une couche PAO. Le nombre de neutrophiles qui migrent en l’absence de stimuli ou à la suite d’une infection épithéliale apicale par e coli mc 1000 non pathogène est inférieur à la limite de détection pour le dosage.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq heures pour l’enrobage de collagène et l’ensemencement des cellules épithéliales sur les filtres transwell, suivies d’au moins une semaine pour permettre aux cellules épithéliales de se développer. Une fois que les monocouches épithéliales sont prêtes. Le test de migration peut être réalisé en cinq heures, y compris l’isolement des neutrophiles et la préparation des bactéries s’il est effectué correctement.Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de préparer les filtres transwell dans des conditions stériles pour éviter toute contamination. Cette procédure peut être adaptée afin de répondre à des questions supplémentaires liées à ce processus inflammatoire. L’analyse des cellules migrées, de l’épithélium, du décubitus dorsal ou encore de l’agent pathogène peut être effectuée.

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