In vitro Essai de coculture pour évaluer la migration transépithéliale des neutrophiles induite par l’agent pathogène

L’objectif global de l’expérience suivante est de déterminer le nombre de neutrophiles qui ont traversé une monocouche de cellules épithéliales en réponse à une infection. Ceci est réalisé en codant le collagène des transwells avant de cultiver soigneusement les monocouches de cellules épithéliales à l’aide de la manœuvre de filtre transwell inversé. Dans un deuxième temps, un pathogène bactérien est cultivé afin d’infecter la surface apicale de la monocouche épithéliale cultivée sur les filtres transwell, ce qui amène les cellules épithéliales à produire des attractifs de chimiothérapie neutrophiles endogènes.

Ensuite, des neutrophiles isolés du sang total sont ajoutés à la face basolatérale des monocouches épithéliales infectées cultivées sur des filtres transpuits pour mesurer la migration des neutrophiles de la face basolatérale à la face apicale. On obtient des résultats qui montrent une augmentation significative du nombre de neutrophiles trans-épithéliales migrateurs observés en réponse à des monocouches épithéliales infectées sur la base de la quantification de la myélo peroxydase à partir de neutrophiles migrés. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la manœuvre du filtre transpuits inversé pour développer et infecter les barrières épithéliales n’est pas conventionnelle et peut donc être moins accessible pour des groupes de recherche inconnus à établir dans leur laboratoire.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement des maladies inflammatoires des voies respiratoires impliquant des infections telles que la pneumonie ou la mucoviscidose, car de nouveaux traitements peuvent être développés et testés pour réduire la quantité de migration transépithéliale des neutrophiles, ce qui peut atténuer les effets délétères d’une rupture trop zélée des barrières muqueuses neutrophiles. En plus de Mark, qui est boursier clinique dans mon laboratoire, la démonstration de la procédure sera faite par le technicien principal Wahi Preza et le boursier postdoctoral Michael Pesos. Pour commencer, retirez de l’emballage des Transwells d’une taille de pores de 0,33 centimètre carré et placez la plaque à 24 puits contenant 12 transwells à l’envers à l’intérieur du capot.

Soulevez la plaque inférieure et mettez-la de côté. Transwells sera maintenant à l’envers. Reposant sur le couvercle de la flamme de la plaque à 24 puits, un hémostat pour la stérilité et laisser refroidir.

À l’aide de l’hémostat stérile, transférez les transwells dans une boîte de Pétri de 150 x 25 millimètres, en les maintenant en position inversée, pipetez 70 microlitres d’une solution de collagène préparée de 30 microgrammes par millilitre dans de l’éthanol sur la membrane filtrante de chaque surface de transwell inversée. Veillez à ce que la solution de collagène ne coule pas sur le côté du transwell et évitez de déplacer les transwells pendant la procédure d’enrobage. Laissez le couvercle de la boîte de Pétri éteint pendant au moins quatre heures pour permettre à l’éthanol de s’évaporer afin de maintenir la stérilité pendant ce processus.

Gardez le ventilateur de la hotte et la lumière ultraviolette allumés après l’emballage des cellules épithéliales comme décrit dans le protocole de texte. Ajoutez 70 microlitres de la solution de cellules suspendues Resus à partir d’un tube de 15 millilitres à chaque transwell enduit de collagène inversé. Mélangez la suspension cellulaire en inversant doucement le tube périodiquement pour éviter que les cellules ne se déposent au fond du tube de 15 millilitres pendant l’ensemencement des puits de transbordement.

Une fois que tous les transwells inversés ont été ensemencés avec des cellules épithéliales, replacez le couvercle de la boîte de Pétri et placez soigneusement les cellules dans l’incubateur de culture tissulaire le lendemain. Ajoutez un millilitre de milieu dans chaque puits de la plaque stérile d’origine à 24 puits et utilisez un hémostat stérilisé pour retourner chaque puits trans inversé dans chaque puits contenant un millilitre de milieu. Ajoutez 0,2 millilitre de milieu dans la chambre supérieure de chaque puits trans et retournez dans l’incubateur de culture tissulaire.

Retirez de l’incubateur la plaque de 24 puits supportant les couches épithéliales qui ont été cultivées sur la face inférieure des membranes filtrantes Transwell pendant au moins huit jours. Saisissez le bord de chaque puits trans avec un hémostat et retirez-le de la plaque à 24 puits. Retournez le transpuits au-dessus d’un seau à déchets pour jeter le milieu de culture de la chambre intérieure du transwell.

Trempez chaque transwell dans un gobelet contenant la solution saline équilibrée de Hank’s avec du calcium et du magnésium ou Hank’s Plus pour remplir la chambre intérieure du Transwell. Ensuite, jetez le liquide de la chambre intérieure dans un seau à déchets. Répétez cette étape pendant une seconde.

Lavez dans Hank’s plus après deux lavages. Placez les Transwells dans une nouvelle plaque de 24 puits contenant un millilitre de Hank’s Plus. Dans chaque puits, observez la chambre supérieure de chaque transpuits pour évaluer l’intégrité de la couche de cellules épithéliales.

Hank’s Plus ne doit pas s’infiltrer et remplir la chambre supérieure du Transwell lorsqu’il est placé dans le puits d’une plaque de 24 puits contenant un millilitre de Hank’s Plus. Après avoir soigneusement observé chaque puits de transfusion, ajoutez 0,2 millilitre de Hanks Plus dans la chambre supérieure. Placez la plaque dans l’incubateur pendant 30 à 60 minutes pour équilibrer les couches de cellules épithéliales afin d’effectuer le test de migration trans-épithéliale des neutrophiles.

Saisissez chaque puits avec un hémostat de la plaque de 24 puits de Wash Transwells équilibrée dans Hank’s Plus et jetez le liquide du puits supérieur dans un seau à déchets. Placez chaque transpuits à l’envers dans une boîte de Pétri de 150 x 25 millimètres pour six des transpuits inversés. Ajoutez 25 microlitres de Hanks plus à trois des puits inversés.

Infectez les cellules avec 25 microlitres de Pseudomonas, arosa ou Pao un dilué dans Hanks plus préparé comme décrit dans le protocole de texte aux trois derniers Transwells inversés infectez les cellules avec 25 microlitres de e Coli, K 12 ou mc 1000 dilué dans Hanks Plus également préparé comme décrit dans le protocole de texte après incubation à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans une chambre humidifiée pendant 60 minutes. Lavez les puits en les saisissant avec un hémostat et en les retournant dans une plaque de lavage à 24 puits contenant un millilitre de Hank’s plus. Dans les chambres inférieures.

Ajoutez 0,2 millilitre de Hank’s plus dans les chambres supérieures. Saisissez le Transwell à l’aide d’un hémostat et retirez-le de la première plaque de lavage. Jetez le liquide de la chambre supérieure dans un seau à déchets.

Avant de placer les Transwells dans une deuxième plaque de lavage à 24 puits contenant un millilitre de Hanks plus, ajoutez 0,2 millilitre de Hanks plus dans la chambre supérieure. Répétez cette étape une fois de plus pour un total de trois lavages. Après le troisième lavage, jetez le liquide des chambres supérieures des puits trans dans un seau à déchets à l’aide d’un appareil placé trois des puits trans non infectés dans trois puits de la plaque de migration de 24 puits contenant un millilitre de Hanks Plus, qui représente la pipette de contrôle négatif de 10 microlitres d’une solution de 10 micromolaires de FMLP dans chacun des trois puits de la plaque de migration de 24 puits contenant un millilitre de Hanks et placer trois des puits trans non infectés dans trois puits de la plaque de migration de 24 puits contenant 100 FMLP nanomolaires, ce qui représente un contrôle positif de la capacité des neutrophiles isolés à migrer.

Ensuite, placez les trois puits trans infectés par le PAO un et les trois puits trans infectés par le mc 1000 dans les trois puits correspondants de la plaque de migration de 24 puits contenant un millilitre d’écheveaux et ajoutez 0,1 millilitre d’écheveaux plus dans la chambre supérieure de chaque puits trans au-dessus des ébourgeons de 0,1 millilitre plus dans chaque trans. Eh bien, ajoutez soigneusement 20 microlitres de la suspension de neutrophiles préparée comme décrit dans le protocole de texte. Incuber pendant deux heures pour permettre la migration trans épithéliale des neutrophiles.

Après deux heures de migration, soulevez les puits en les saisissant à l’aide d’un hémostat et en tapotant doucement contre les parois intérieures de la plaque de migration à 24 puits. Avant de jeter les puits trans, évaluez grossièrement la migration des neutrophiles dans les puits en observant les puits de la plaque de migration de 24 puits sous un microscope inversé à l’aide de l’objectif 10 x. Ajoutez ensuite 50 microlitres de 10 % Triton X 100 à chaque puits utilisé dans la plaque de migration de 24 puits, chaque étalon et l’ébauche.

Faites pivoter les étalons de la plaque de migration de 24 puits et blanchissez à basse vitesse pendant 20 minutes. À quatre degrés Celsius. Ajouter 50 microlitres de tampon de citrate.

Deux bien utilisés dans la plaque de migration de 24 puits pour chaque étalon et pour l’ébauche à fond. Mélangez bien le contenu de chaque échantillon en pipetant la solution de haut en bas au moins cinq fois. Transférez ensuite 100 microlitres de chaque puits d’échantillon en double sur une plaque de transfert à 96 puits, 100 microlitres de chaque étalon et l’ébauche sur la plaque à 96 puits.

Après le mélange, ajoutez 50 microlitres de peroxyde d’hydrogène à 30 % à la solution A BTS et vortex. Ajoutez ensuite 100 microlitres de solution de substrat A BTS à chaque échantillon. Sur la plaque à 96 puits, laissez la plaque se développer pendant cinq à 10 minutes dans l’obscurité.

Observez l’évolution de la couleur verte dans les puits de la plaque contenant les neutrophiles de lyse avant de lire à une longueur d’onde de 405 nanomètres. À l’aide d’un lecteur de microplaques pour évaluer la migration trans-épithéliale des neutrophiles, les neutrophiles qui ont complètement migré à travers la couche épithéliale jusqu’à la chambre apicale peuvent être visualisés dans le puits inférieur de la plaque de migration à 24 puits, comme visualisé ici à l’aide d’un microscope à lumière inversée. On a observé que très peu de neutrophiles migrent à travers une couche épithéliale non infectée sans gradient chimiotactique imposé et représentent les niveaux de fond dans l’essai.

En revanche, une abondance de neutrophiles transmi était apparente lorsqu’un gradient FMLP était fourni. L’infection de l’épithélium par e coli mc 1000 non pathogène a entraîné un faible nombre de neutrophiles transmigrés visibles, alors que de nombreux neutrophiles transmigrés étaient observables lorsque les couches épithéliales étaient infectées par l’aérogène pathogène pulmonaire pseudomonas aerogen. Les neutrophiles qui ont migré dans l’expérience sont quantifiés en mesurant leur activité myélo peroxydase.

Le nombre de neutrophiles est positivement corrélé avec la quantité d’activité de la peroxydase mesurée après la lyse des neutrophiles, les valeurs présentant une relation linéaire dans la plage du nombre de neutrophiles sélectionnée pour la courbe standard. Un nombre important de neutrophiles migrent à travers les couches épithéliales en réponse à un gradient FMLP fourni par A, ou en réponse à une couche épithéliale infectée par une couche PAO. Le nombre de neutrophiles qui migrent en l’absence de stimuli ou à la suite d’une infection épithéliale apicale par e coli mc 1000 non pathogène est inférieur à la limite de détection pour le dosage.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq heures pour l’enrobage de collagène et l’ensemencement des cellules épithéliales sur les filtres transwell, suivies d’au moins une semaine pour permettre aux cellules épithéliales de se développer. Une fois que les monocouches épithéliales sont prêtes. Le test de migration peut être réalisé en cinq heures, y compris l’isolement des neutrophiles et la préparation des bactéries s’il est effectué correctement.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de préparer les filtres transwell dans des conditions stériles pour éviter toute contamination. Cette procédure peut être adaptée afin de répondre à des questions supplémentaires liées à ce processus inflammatoire. L’analyse des cellules migrées, de l’épithélium, du décubitus dorsal ou encore de l’agent pathogène peut être effectuée.