Un procédé de précipitation modification pour isoler les exosomes urinaire

L’objectif global de cette procédure est de concevoir une méthode de précipitation d’exosomes modifiée qui offre une alternative rapide, évolutive et efficace pour l’isolement des exosomes de l’urine. Pour ce faire, il faut d’abord éliminer les grosses cellules mortes et les débris cellulaires de l’échantillon d’urine par centrifugation, puis le sangot contenant les exosomes urinaires est transféré dans un tube frais. Dans la deuxième étape, la pastille est dissoute dans une solution isolante contenant du DTT pour éliminer la protéine de chute de cheval TAM.

Ensuite, après une centrifugation supplémentaire, le surnageant exempt de TP est incubé avec le réactif exo quick TC pendant la nuit pour précipiter les exosomes le lendemain. Les échantillons traités au réactif exo quick TC sont centrifugés une dernière fois pour obtenir la pastille d’exosome. En fin de compte, des processus en aval tels que le Western blot et la QPCR en temps réel peuvent être effectués sur les exosomes pour identifier les biomarqueurs d’intérêt.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’ultra-centrification, la filtration et la précipitation est que la méthode du bras ne nécessite aucune étape d’ultra-certification, est facile à réaliser relativement rapidement, tout en offrant un rendement élevé et relativement pur d’exosomes pour une analyse moléculaire ultérieure avant la collecte d’urine. À 3,125 millilitres d’un cocktail d’inhibiteur de protéase fraîchement préparé dans un récipient stérile vide, puis recueillir environ 10 millilitres d’urine de première évacuation dans le récipient. Transférez l’échantillon dans des tubes coniques de 15 millilitres.

Veuillez noter qu’un échantillon d’urine prélevé sur 24 heures peut également être utilisé pour l’isolement des exosomes en les stockant à quatre degrés Celsius. Faites tourner les tubes pendant 10 minutes à 17 000 GS et 37 degrés Celsius pour éliminer ou séparer les débris cellulaires des exosomes urinaires. Ensuite, en prenant soin de ne pas déranger la pastille, transférez le surnageant dans un tube frais et remettez la pastille en suspension dans 500 microlitres de solution d’isolement.

Incuber le granulé avec du DTT à une concentration finale de 200 milligrammes par millilitre à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Vortex de l’échantillon toutes les deux minutes. Ensuite, lorsque la pastille est complètement dissoute, ajoutez 500 microlitres de solution d’isolement à l’échantillon et faites immédiatement tourner la suspension résultante.

Mettez en commun le surnageant avec le surnageant précédemment collecté et remettez en suspension le nouveau granulé dans 50 microlitres de solution d’isolement. Pour une analyse de la page SDS afin d’isoler les exosomes, incubez d’abord 11 millilitres du surnageant mélangé avec 3,3 millilitres de réactif exo rapide TC à quatre degrés Celsius pendant au moins 12 heures. Après l’incubation, centrifugez l’échantillon, puis transférez le surnageant dans un tube frais pour l’analyse de la page SDS et la pastille contenant les exosomes urinaires est utilisée pour extraire D-N-A-R-N-A ou protéine, ou stockée à moins 80 degrés Celsius.

Utilisez un spectrophotomètre NanoDrop pour déterminer les concentrations d’ADN et d’ARN de chaque extraction en mesurant l’absorbence à 260 et 280 nanomètres avec deux microlitres d’échantillon ici. Une reproduction modifiée d’une analyse de page SDS et d’une détection de biomarqueurs à l’aide d’une analyse de sang occidentale est mise en évidence dans les couloirs avec de l’urine non traitée et les premières interdictions de protéines de granules urinaires correspondant à 90 à 100 kilodaltons ont été observées, indiquant la présence et l’élimination de la protéine de chute de cheval TAM respectivement dans les voies finales de surnageant et d’exosome. La bande protéique TAM horse fall n’a pas été observée, ce qui indique une élimination de la protéine TAM horse fall dans les premières étapes, ce qui a entraîné une augmentation du rendement en pastilles d’exosomes.

Dans cette expérience, les biomarqueurs Alex et TSG 1 0 1 ont été détectés même lorsque de faibles quantités d’échantillon ont été utilisées, indiquant une pastille d’exosome très pure pour l’analyse des biomarqueurs et une absence de protéines solubles abondantes, y compris la protéine de chute de cheval TAM après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’insuffisance rénale chronique pour utiliser des exosomes isolés dans l’urine pour la détection précoce et le diagnostic de la néphropathie diabétique.