3.6: Entretien de Caenorhabditis elegans

L'entretien et les soins appropriés des Caenorhabditis elegans sont essentiels pour des expériences réussies.

Ils ont besoin de très peu d'espace, ne coûtent pas cher d’élevage, ont une bonne fécondité, et sont faciles à manipuler. Mais le fait qu'ils soient faciles à entretenir ne signifie pas une science au rabais. En effet, Sydney Brenner a fameusement appelé C. elegans "Un cadeau de la nature pour la science», et depuis son introduction en 1974, le nématode a été exhibé dans un certain nombre d’expériences récompensées du prix Nobel.

Dans cette vidéo, nous allons démontrer les méthodes de base pour la maintenance de C. elegans en laboratoire. Notamment: le logement, l'alimentation, la manutention, ainsi que la congélation et la décongélation des vers.

Dans la nature, les C. elegans se trouvent dans le sol et se nourrissent de matière végétale en décomposition. En laboratoire, il est important de garder les nématodes aussi heureux que possible. Ainsi, nous les logeons et nourrissons en utilisant des méthodes très spécifiques.

Les C. elegans peuvent être cultivés à 16, 20, ou 25°C selon les exigences de l'étude, et peuvent être cultivées sur des milieux solides ou liquides. Dans les deux cas, ils sont nourris d’OP50, une souche standardisée de E. coli utilisé spécifiquement pour la culture de nématodes dans tous les laboratoire du monde.

Lorsque cultivé à 25°C, le C. elegans complète son cycle de vie 2.1 fois plus rapidement que lorsqu'il est cultivé à 16°C. Un cycle de vie rapide implique une maturité plus rapide, la ponte d’œufs plus généreuse et une plus grande consommation de nourriture. Si les vers sont abandonnés à mourir de faim ou deviennent trop peuplés, ils entrent dans un stade larvaire appelé le stade de dauer. Les larves dans le stade de Dauer sont résistantes au stress et ne vieillissent pas.

Lorsque maintenu sur un support solide, le C. elegans est cultivé sur des plaques d’agar préparées avec du milieu de croissance pour nématodes appelé NGM, pour l’acronyme anglais «nematode growth media». La journée précédant la fabrication des plaques, il faut ensemencer du milieu LB liquide avec une seule colonie de E. coli OP50. Ensuite, incuber le milieu à 37°C sous agitation pendant une nuit.

Pour réaliser du milieu solide, il faut mesurer et combiner les quantités appropriées de ces ingrédients avec de l'eau déminéralisée dans un Erlenmeyer.

Après autoclavage pendant au moins 15 minutes, laisser refroidir l’agar dans un bain d'eau jusqu’à 55°C. Une fois le support refroidi à 55°C, vous devriez être en mesure de tenir confortablement le récipient en verre avec vos mains. A ce moment et en utilisant une technique aseptique appropriée, des additifs tels que des médicaments ou des antibiotiques peuvent être ajoutés. Agiter pour mélanger. Ensuite, prélever le NGM fondu et déposer dans des boîtes de Pétri jusqu'à ce qu'elles soient pleines au 2/3. Laisser sécher les nouvelles plaques sur la paillasse pour la nuit.

Le lendemain matin, il faut centrifuger le milieu LB contenant l’OP50 à 3500 g pendant 10 minutes. Ensuite il faut re-suspendre les bactéries dans un milieu LB 10 fois plus concentré. Maintenant, appliquer une couche de milieu bactérien sur la partie centrale de chaque plaque. Éviter de toucher la pointe de la pipette à la surface du NGM et prendre soin de ne pas toucher les parois de la plaque avec la culture. Laisser les plaques à sécher sur la paillasse toute la nuit. Une fois sèches, exposer les plaques à la lumière UV pour les stériliser. Ils sont alors prêts à être utilisés lors de la mise en culture des vers.

Les C. elegans sont manipulés individuellement à l'aide d'une microspatule. La microspatule de calibre 30 est généralement faite de 90% de platine et de 10% d'iridium, bien que certains chercheurs préfèrent des compositions métalliques légèrement différentes. Pour faire une microspatule, commencer par briser la pointe d'une pipette Pasteur à la longueur desirée.

Couper environ 3 à 4 cm de fil et placer 0,5 cm à l'intérieur de la pointe de la pipette. Sceller le verre sur le fil avec un bruleur Bunsen. La longueur du fil dépassant du verre est d'environ 3 à 3,5 cm, mais peut varier en fonction des préférences individuelles.

Aplatir la fin du fil en utilisant un rebord dur. Puis plier la partie aplatie vers le haut pour former une cuillère. Finalement, sabler les bords de la microspatule pour éviter d'endommager le ver ou l’agar.

Pour prendre un ver, stériliser la microspatule sur une flamme. Ensuite, recouvrir l'extrémité d'épaisses couches de E. coli OP50 très collantes provenant d'une plaque NGM. Prendre soin de ne pas percer ou briser la surface de l’agar.

Tout en regardant dans le microscope à dissection, gentiment soulever le ver en utilisant la partie aplatie de la microspatule collante jusqu'à ce que le ver colle à la microspatule.

Une fois que le ver est sur la microspatule, immédiatement transférer en tenant gentiment la pointe au-dessus de la surface d'une nouvelle plaque et glisser sur la couche bactérienne. Le ver devrait ramper pour descendre de la microspatule. Le ver ne doit pas rester sur la microspatule trop longtemps au risque de se dessécher.

Une des raisons pour lesquelles le C. elegans est un modèle populaire pour la recherche reside dans le fait que les cultures peuvent être conservées pendant de longues périodes de temps sans aucun effet indésirable.

D'abord, laver les larves récemment à jeun en utilisant 0.5 ml de tampon M9, agiter doucement pour dénouer toutes les larves et les animaux adultes, puis transférer dans un tube ou cryotube. Ensuite, ajouter une quantité égale de glycérol 30% préparé /dans le tampon M9. Enfin, deposer le tube dans une boîte isotherme et entreposer à -80°C.

Pour récupérer les vers, retirer le tube d'un congélateur à -80°C et laisser décongeler à température ambiante jusqu'à ce que le contenu soit complètement fondu. Transférer le liquide à la pipette sur une plaque NGM fraiche recouverte d’une couche d’OP50 et incuber à 20ºC. Après 2-3 jours, transférer 10-15 animaux sur une nouvelle plaque et laisser les se reproduire pour une génération. Recueillir la descendance et compter le nombre de phénotypes corrects.

Maintenant que nous avons vu comment le C. elegans est maintenu en culture en laboratoire, nous allons nous interesser à la façon dont l'alimentation, le logement et les manipulations sont modifiés pour certaines expériences.

La découverte sur l'interférence par ARN, recompensee d’un prix Nobel, a permis aux chercheurs de supprimer n'importe quel gène de C. elegans afin d’en déterminer sa fonction.

Nous pouvons induire l'interférence par ARN chez les C. elegans, en préparant d'abord les plaques de E. coli qui expriment des gènes cibles sous forme d’ARN double brin, que les vers vont manger.

Ensuite, des vers du quatrième stade larvaire sont transférés aux plaques d'ARNi et livrés à pondre des œufs. Au stade de développement souhaité, la descendance est collectée et comptée pour phénotype. Puisque nous partageons environ la moitié de notre génome avec le ver, un bon nombre de connaissances acquises sont applicables à la maladie humaine.

En raison de son cycle de vie rapide, C. elegans est particulièrement bien adapté comme modèle du vieillissement.

Tout d'abord, une population synchronisée de C. elegans est générée, en permettant aux adultes hermaphrodites de pondre des œufs sur des plaques NGM. Les vers pondent des œufs pour 6-8 heures, puis sont enlevés.

Lorsque les vers sont au stade désiré, ils sont transférés sur de nouvelles plaques NGM contenant de l'ampicilline pour empêcher la contamination bactérienne et de la fluorodésoxyuridine pour prévenir la reproduction.

A partir de ce point, les vers adultes sont observés tous les 2-3 jours jusqu'à ce que tous les vers soient morts. Les vers morts sont retirés de la plaque et le nombre de vers vivants et morts sont enregistrés.

Analyser la durée de vie dans le contexte d'insultes génétiques ou environnementales peut révéler des connaissances importantes sur le processus de vieillissement.

En utilisant des lasers, il est possible d'effectuer des axotomies (ou la coupe d’axones individuels), chez le C. elegans vivant pour étudier comment les cellules nerveuses se régénèrent.

Cependant, etant donne que les vers ne tiennent jamais en place, ils sont placés sur des gels d'agarose de 10% dans une solution de microbilles. Une lamelle est placée au dessus. Les microbilles augmentent le coefficient de frottement entre le gel et la lamelle, ce qui immobilise efficacement les vers.

La lame est maintenant prête pour effectuer les axotomies. Les neurones sont amenés en vue, et centrés sur le microscope. Le laser est ensuite activé à l'aide d’une pédale. La puissance optimale du laser coupera le neurone sans porter préjudice aux structures adjacentes. Autant d’axones que possible sont coupées par animal.

Le gel d’agarose est ensuite soigneusement retiré de la lame, et les vers sont autorisés à récupérer sur une plaque NGM à 20ºC. Entre 8-48 heures après les axotomies, les neurones sont prêts à être observés pour leur régénération. A la partie distale de la coupe, le neurone forme un moignon. Toutefois, à la partie proximale du neurone, il se régénère formant des neurites allongées.

Vous venez de regarder la demonstration de JoVe sur l’entretien de base des Ceanorhabditis elegans. Dans cette vidéo, nous avons examiné: le logement et l’alimentation des C. elegans, les manipulations, la congélation et la récupération des nématodes.

Nous avons également fait une brève revue de quelques applications qui font de C. elegans un puissant outil de recherche. Bien que le C. elegans soit différent des mammifères à bien des égards, leur constitution génétique similaire, ainsi que leur facilité d'entretien et de manipulation, en font un modèle important dans la quête d’une meilleure compréhension de la biologie des mammifères et de la maladie. Merci de votre attention!