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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

Entretien de Caenorhabditis elegans

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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

C. elegans Maintenance

3.3: An Introduction to Caenorhabditis elegans

3.13: Yeast Transformation and Cloning

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10:54 min

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April 30, 2023

Overview

Ceanorhabditis elegans a été, et est toujours, utilisé avec grand succès comme un organisme modèle pour étudier une variété de phénomènes développementaux, génétiques, moléculaires et même physiques. Pour utiliser C. elegans à son plein potentiel, les soins et l’attention à l’entretien de base de cet organisme puissant sont indispensable. Dans cette vidéo, vous apprendrez les exigences de base en matière de logement et d’alimentation de C. elegans, comment gérer correctement et manipuler les vers avec une microspatule et la façon de congeler et récupérer les importantes souches de vers. A la fin de la vidéo, nous allons contempler quelques applications impliquant de modifier le logement, l’alimentation et la manipulation de ces animaux importants.

Procedure

L’entretien et les soins appropriés des Caenorhabditis elegans sont essentiels pour des expériences réussies.

Ils ont besoin de très peu d’espace, ne coûtent pas cher d’élevage, ont une bonne fécondité, et sont faciles à manipuler. Mais le fait qu’ils soient faciles à entretenir ne signifie pas une science au rabais. En effet, Sydney Brenner a fameusement appelé C. elegans “Un cadeau de la nature pour la science», et depuis son introduction en 1974, le nématode a été exhibé dans un certain nombre d’expériences récompensées du prix Nobel.

Dans cette vidéo, nous allons démontrer les méthodes de base pour la maintenance de C. elegans en laboratoire. Notamment: le logement, l’alimentation, la manutention, ainsi que la congélation et la décongélation des vers.

Dans la nature, les C. elegans se trouvent dans le sol et se nourrissent de matière végétale en décomposition. En laboratoire, il est important de garder les nématodes aussi heureux que possible. Ainsi, nous les logeons et nourrissons en utilisant des méthodes très spécifiques.

Les C. elegans peuvent être cultivés à 16, 20, ou 25°C selon les exigences de l’étude, et peuvent être cultivées sur des milieux solides ou liquides. Dans les deux cas, ils sont nourris d’OP50, une souche standardisée de E. coli utilisé spécifiquement pour la culture de nématodes dans tous les laboratoire du monde.

Lorsque cultivé à 25°C, le C. elegans complète son cycle de vie 2.1 fois plus rapidement que lorsqu’il est cultivé à 16°C. Un cycle de vie rapide implique une maturité plus rapide, la ponte d’œufs plus généreuse et une plus grande consommation de nourriture. Si les vers sont abandonnés à mourir de faim ou deviennent trop peuplés, ils entrent dans un stade larvaire appelé le stade de dauer. Les larves dans le stade de Dauer sont résistantes au stress et ne vieillissent pas.

Lorsque maintenu sur un support solide, le C. elegans est cultivé sur des plaques d’agar préparées avec du milieu de croissance pour nématodes appelé NGM, pour l’acronyme anglais «nematode growth media». La journée précédant la fabrication des plaques, il faut ensemencer du milieu LB liquide avec une seule colonie de E. coli OP50. Ensuite, incuber le milieu à 37°C sous agitation pendant une nuit.

Pour réaliser du milieu solide, il faut mesurer et combiner les quantités appropriées de ces ingrédients avec de l’eau déminéralisée dans un Erlenmeyer.

Après autoclavage pendant au moins 15 minutes, laisser refroidir l’agar dans un bain d’eau jusqu’à 55°C. Une fois le support refroidi à 55°C, vous devriez être en mesure de tenir confortablement le récipient en verre avec vos mains. A ce moment et en utilisant une technique aseptique appropriée, des additifs tels que des médicaments ou des antibiotiques peuvent être ajoutés. Agiter pour mélanger. Ensuite, prélever le NGM fondu et déposer dans des boîtes de Pétri jusqu’à ce qu’elles soient pleines au 2/3. Laisser sécher les nouvelles plaques sur la paillasse pour la nuit.

Le lendemain matin, il faut centrifuger le milieu LB contenant l’OP50 à 3500 g pendant 10 minutes. Ensuite il faut re-suspendre les bactéries dans un milieu LB 10 fois plus concentré. Maintenant, appliquer une couche de milieu bactérien sur la partie centrale de chaque plaque. Éviter de toucher la pointe de la pipette à la surface du NGM et prendre soin de ne pas toucher les parois de la plaque avec la culture. Laisser les plaques à sécher sur la paillasse toute la nuit. Une fois sèches, exposer les plaques à la lumière UV pour les stériliser. Ils sont alors prêts à être utilisés lors de la mise en culture des vers.

Les C. elegans sont manipulés individuellement à l’aide d’une microspatule. La microspatule de calibre 30 est généralement faite de 90% de platine et de 10% d’iridium, bien que certains chercheurs préfèrent des compositions métalliques légèrement différentes. Pour faire une microspatule, commencer par briser la pointe d’une pipette Pasteur à la longueur desirée.

Couper environ 3 à 4 cm de fil et placer 0,5 cm à l’intérieur de la pointe de la pipette. Sceller le verre sur le fil avec un bruleur Bunsen. La longueur du fil dépassant du verre est d’environ 3 à 3,5 cm, mais peut varier en fonction des préférences individuelles.

Aplatir la fin du fil en utilisant un rebord dur. Puis plier la partie aplatie vers le haut pour former une cuillère. Finalement, sabler les bords de la microspatule pour éviter d’endommager le ver ou l’agar.

Pour prendre un ver, stériliser la microspatule sur une flamme. Ensuite, recouvrir l’extrémité d’épaisses couches de E. coli OP50 très collantes provenant d’une plaque NGM. Prendre soin de ne pas percer ou briser la surface de l’agar.

Tout en regardant dans le microscope à dissection, gentiment soulever le ver en utilisant la partie aplatie de la microspatule collante jusqu’à ce que le ver colle à la microspatule.

Une fois que le ver est sur la microspatule, immédiatement transférer en tenant gentiment la pointe au-dessus de la surface d’une nouvelle plaque et glisser sur la couche bactérienne. Le ver devrait ramper pour descendre de la microspatule. Le ver ne doit pas rester sur la microspatule trop longtemps au risque de se dessécher.

Une des raisons pour lesquelles le C. elegans est un modèle populaire pour la recherche reside dans le fait que les cultures peuvent être conservées pendant de longues périodes de temps sans aucun effet indésirable.

D’abord, laver les larves récemment à jeun en utilisant 0.5 ml de tampon M9, agiter doucement pour dénouer toutes les larves et les animaux adultes, puis transférer dans un tube ou cryotube. Ensuite, ajouter une quantité égale de glycérol 30% préparé /dans le tampon M9. Enfin, deposer le tube dans une boîte isotherme et entreposer à -80°C.

Pour récupérer les vers, retirer le tube d’un congélateur à -80°C et laisser décongeler à température ambiante jusqu’à ce que le contenu soit complètement fondu. Transférer le liquide à la pipette sur une plaque NGM fraiche recouverte d’une couche d’OP50 et incuber à 20ºC. Après 2-3 jours, transférer 10-15 animaux sur une nouvelle plaque et laisser les se reproduire pour une génération. Recueillir la descendance et compter le nombre de phénotypes corrects.

Maintenant que nous avons vu comment le C. elegans est maintenu en culture en laboratoire, nous allons nous interesser à la façon dont l’alimentation, le logement et les manipulations sont modifiés pour certaines expériences.

La découverte sur l’interférence par ARN, recompensee d’un prix Nobel, a permis aux chercheurs de supprimer n’importe quel gène de C. elegans afin d’en déterminer sa fonction.

Nous pouvons induire l’interférence par ARN chez les C. elegans, en préparant d’abord les plaques de E. coli qui expriment des gènes cibles sous forme d’ARN double brin, que les vers vont manger.

Ensuite, des vers du quatrième stade larvaire sont transférés aux plaques d’ARNi et livrés à pondre des œufs. Au stade de développement souhaité, la descendance est collectée et comptée pour phénotype. Puisque nous partageons environ la moitié de notre génome avec le ver, un bon nombre de connaissances acquises sont applicables à la maladie humaine.

En raison de son cycle de vie rapide, C. elegans est particulièrement bien adapté comme modèle du vieillissement.

Tout d’abord, une population synchronisée de C. elegans est générée, en permettant aux adultes hermaphrodites de pondre des œufs sur des plaques NGM. Les vers pondent des œufs pour 6-8 heures, puis sont enlevés.

Lorsque les vers sont au stade désiré, ils sont transférés sur de nouvelles plaques NGM contenant de l’ampicilline pour empêcher la contamination bactérienne et de la fluorodésoxyuridine pour prévenir la reproduction.

A partir de ce point, les vers adultes sont observés tous les 2-3 jours jusqu’à ce que tous les vers soient morts. Les vers morts sont retirés de la plaque et le nombre de vers vivants et morts sont enregistrés.

Analyser la durée de vie dans le contexte d’insultes génétiques ou environnementales peut révéler des connaissances importantes sur le processus de vieillissement.

En utilisant des lasers, il est possible d’effectuer des axotomies (ou la coupe d’axones individuels), chez le C. elegans vivant pour étudier comment les cellules nerveuses se régénèrent.

Cependant, etant donne que les vers ne tiennent jamais en place, ils sont placés sur des gels d’agarose de 10% dans une solution de microbilles. Une lamelle est placée au dessus. Les microbilles augmentent le coefficient de frottement entre le gel et la lamelle, ce qui immobilise efficacement les vers.

La lame est maintenant prête pour effectuer les axotomies. Les neurones sont amenés en vue, et centrés sur le microscope. Le laser est ensuite activé à l’aide d’une pédale. La puissance optimale du laser coupera le neurone sans porter préjudice aux structures adjacentes. Autant d’axones que possible sont coupées par animal.

Le gel d’agarose est ensuite soigneusement retiré de la lame, et les vers sont autorisés à récupérer sur une plaque NGM à 20ºC. Entre 8-48 heures après les axotomies, les neurones sont prêts à être observés pour leur régénération. A la partie distale de la coupe, le neurone forme un moignon. Toutefois, à la partie proximale du neurone, il se régénère formant des neurites allongées.

Vous venez de regarder la demonstration de JoVe sur l’entretien de base des Ceanorhabditis elegans. Dans cette vidéo, nous avons examiné: le logement et l’alimentation des C. elegans, les manipulations, la congélation et la récupération des nématodes.

Nous avons également fait une brève revue de quelques applications qui font de C. elegans un puissant outil de recherche. Bien que le C. elegans soit différent des mammifères à bien des égards, leur constitution génétique similaire, ainsi que leur facilité d’entretien et de manipulation, en font un modèle important dans la quête d’une meilleure compréhension de la biologie des mammifères et de la maladie. Merci de votre attention!

Transcript

Correct care and maintenance of Caenorhabditis elegans is essential for successful experiments.

They require very little space, are cheap to house, have high fecundity, and are easy to manipulate. But just because they are simple to keep around does not mean wimpy science. In fact, Sydney Brenner famously called C. elegans “Nature’s gift to science,” and since its introduction in 1974 the worm has been featured in a number of Nobel prize winning experiments.

In this video we will demonstrate basic methods for maintaining C. elegans in the lab, including: housing and feeding, handling, as well as freezing and thawing of worms.

In the wild, C. elegans are found in the soil and feed upon decomposing plant matter. In the lab, it’s important to keep nematodes as happy as possible, and so we house and feed them using very specific methods.

C. elegans can be grown at 16, 20, or 25 °C depending upon the requirements of the experiment, and can either be grown on solid or in liquid media. In both cases they are fed OP50, a standardized strain of E. coli used specifically for nematode culture in every worm lab around the world.

When grown at 25 °C, C. elegans complete their life cycle 2.1 times faster than when grown at 16 °C. A faster life cycle means the worms mature faster, lay more eggs and consume more food. If worms are allowed to starve or become too crowded they enter a larval stage called the dauer stage. Dauer larvae are stress resistant and do not age.

When maintained on solid media, C. elegans are grown on agar plates prepared with nematode growth media or NGM media. The day before making plates, inoculate liquid LB media with a single colony of OP50 E. coli. Incubate the media at 37 °C overnight with shaking.

To make solid media, measure and combine the appropriate amounts of these ingredients with deionized water in an Erlenmeyer flask.

After autoclaving for at least 15 minutes, let the agar cool to 55 °C in a water bath. Once the media has cooled to 55 °C you should be able to comfortably hold the glass container with bare hands. Using proper aseptic technique, additives like drugs or antibiotics can be added at this time. Swirl to mix. Then, pipette molten NGM into Petri plates until they are 2/3 full. Let the newly made plates dry on the bench overnight.

The next morning pellet the OP50 at 3500 x g for 10 minutes and then resuspend the bacteria in LB media to a 10X concentration. Now, pipette a central lawn onto each plate. Avoid touching the pipet tip to the surface of the NGM and take care not to allow the culture to touch the plate walls. Leave plates to dry on the bench overnight. Once dry, expose plates to UV light to sterilize them. They are now ready to be used when culturing worms.

C. elegans are individually manipulated using a tool known as the worm pick. The pick is typically is made from 30 gauge 90% platinum and 10% iridium wire, though some researchers may prefer slightly different metal compositions. To make a pick, start by breaking the tip of a Pasteur pipet to the preferred length.

Cut about 3 to 4 cm of wire and place 0.5 cm of it inside the tip of the pipet. Seal the wire to the glass over a Bunsen burner. The length of the wire protruding from the glass is about 3 to 3.5 cm but can vary according to individual preferences.

Flatten the end of the wire using a hard edge. Then bend the flattened portion upward to form a scoop. Finally, sand the edges of the pick to prevent damaging the worm or the agar.

To pick worms sterilize the wire of the pick on a flame. Then coat the tip with thick, sticky OP50 E. coli from an NGM plate. Use care to not puncture or scar the agar surface.

While looking through a dissection scope, lightly scoop the worm onto the flattened, sticky pick until the worm sticks to the pick.

Once the worm is on the pick, immediately transfer by lightly holding the tip to the new surface of a new plate and sliding it across the bacterial lawn. The worm should crawl off the pick. The worm should not stay on the pick for too long or it might dry out.

One of the reasons why C. elegans is a popular model for research is because cultures can be stored for long periods of time without any adverse effect.

First, wash freshly starved larvae using 0.5 ml M9 Buffer, gently swirl to loosen all larva and adult animals, and then transfer to a microcentrifuge or cryotube. Then, add equal amount 30% glycerol in M9 Buffer. Finally, pack the vial into an insulated box and store at -80 °C.

To recover worms, remove the tube from a -80 freezer and let thaw at room temperature until the contents fully melt. Pipette the liquid onto a fresh NGM plate with OP50 lawn and incubate at 20 °C. After 2-3 days, transfer 10-15 animals to a new plate and allow them to reproduce for one generation. Collect the progeny and score for correct phenotypes.

Now that we’ve seen how C. elegans is maintained in the lab, let’s have a look at how feeding, housing, and handling conditions are modified for experiments.

The Nobel winning discovery of RNA interference allowed researchers to silence any C. elegans gene in order to determine its function.

We can induce RNAi in C. elegans by first preparing plates with E. coli that express target gene dsRNA, which the worms will eat.

Then 4th larval stage worms are transferred to the RNAi plates and allowed to lay eggs. At the desired stage of development the progeny are collected and scored for phenotypes. Since we share about half of our genome with the worm many of the insights gleaned are applicable to human disease.

Because of its quick life-cycle, C. elegans is particularly well suited as a model of aging.

First, a time-synchronized population of C. elegans is generated, by allowing adult hermaphrodites to lay eggs on NGM plates. The worms lay eggs for 6-8 hr and then are removed.

When worms are at the desired stage they are transferred to new NGM plates containing ampicillin to prevent bacterial contamination and FUDR to prevent reproduction.

From this point forward adult worms are observed every 2-3 days until all worms have died. Dead worms are removed from the plate and the number of live and dead worms are recorded.

Analyzing life span in the context of genetic or environmental insults can yield significant insights into the aging process.

Using lasers it is possible to perform axotomies or the cutting of individual axons, in live C. elegans to study how nerve cells regenerate.

But, because worms never keep still, they are placed on 10% agarose pads in solution of microbeads. A cover slip is placed on top. The microbeads increase the coefficient of friction of the pad-coverslip interaction, effectively freezing the worm in place.

The slide is now prepared for performing axotomies. The neurons are brought into view and centered on the microscope. The laser is then fired using the foot pedal. Optimum laser power will sever the neuron without harming adjacent structures. As many axons as possible are cut per animal.

The agarose pad is then carefully removed from the slide, and worms are allowed to recover on a seeded NGM plate at 20 °C. Between 8-48 hr after the axotomy, the neurons can be prepared to score for regeneration. At the distal part of the cut, the neuron forms a stump. However, at the proximal portion the neuron regenerates forming elongated neurites.

You’ve just watched JoVE’s take on basic Ceanorhabditis elegans maintenance. In this video we reviewed: housing and feedings of C. elegans, handling them, and freezing and recovery of nematodes.

We also took a brief tour through some applications that make C. elegans such a powerful research tool. Although C. elegans are dissimilar to mammals in many ways, their similar genetic makeup, ease of maintenance, and simple manipulation make them an important model in the quest for understanding mammalian biology and disease. Thanks for watching!