Une nouvelle approche pour l'analyse comparative des complexes multiprotéiques Basé sur ¹⁵ N Marquage métabolique et spectrométrie de masse quantitative

L’objectif global de cette procédure est d’analyser de manière comparative la composition des complexes MultiPro dans les membranes de cordon thallique dans différentes conditions. Ceci est accompli en isolant d’abord les membranes thalles des cellules de lamona exposées à des conditions anaérobies. Ensuite, les membranes du thème cordon sont solubilisées et fractionnées sur un gradient de densité de saccharose.

Ensuite, des volumes égaux des fractions souhaitées sont mélangés et séparés sur la page FDS. Enfin, les bandes colorées au kumasi sont digérées avec de la trypsine. En fin de compte, les échantillons sont analysés par spectrométrie de masse quantitative pour observer les changements dans l’abondance des protéines entre les fractions étudiées.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les études protéomiques quantitatives comparant une quantité définie de protéines est que dans notre approche, des volumes égaux d’échantillons fractionnés sont combinés et analysés. Cela permet d’étudier le comportement de migration des protéines à l’intérieur du gradient, et de plus, d’analyser la composition de différents complexes non protéiques dans la membrane du troisième groupe. En ce qui concerne les souches appliquées Après l’élevage de souches résistantes à Chlamydomonas Reine, conformément au protocole textuel, utilisez des solutions mères de deux molaires de saccharose, de 10 % de bêta MS dans l’eau et de 0,5 molaire de trices pH 8,0.

Pour préparer les solutions suivantes pour les gradients de densité du saccharose, pour mettre en place les gradients à l’aide de tubes à centrifuger de 14 x 89 millimètres, commencez par verser lentement un millilitre de solution de 1,3 molaire, suivi d’un millilitre de solution de 1,0 molaire. Versez ensuite deux millilitres chacune des solutions 0,85, 0,7, 0,65 et enfin, 0,4 molaire. Stockez les gradients pendant la nuit dans la chambre froide pour induire des conditions anaérobies.

Dans les cultures de chlamydomonas, insérer une pipette en verre dans les flacons de culture et faire bouillir de l’argonne pendant quatre heures avec une agitation et un éclairage continus pour isoler les membranes du cordon thal. Après l’incubation, commencez par granuler les cellules pendant cinq minutes à 2 500 fois la gravité et quatre degrés Celsius. Ensuite, mettez en suspension les granules de cellules dans 30 millilitres de tampon H.

Répétez la centrifugation et à nouveau, réusez-la. Suspendez les cellules dans un tampon H one pour briser les cellules, en les faisant passer dans un nébuliseur avec une pression d’azote de 1 500 Pascals. Assurez-vous que la distance entre la bille en céramique et le métal est suffisamment petite pour que les cellules se brisent.

Ensuite, faites tourner les cellules pendant sept minutes à 2 500 fois la gravité et quatre degrés Celsius. Le surnageant doit être de couleur vert clair. Si la rupture de la cellule a réussi, suspendez les cellules dans 50 millilitres de tampon H deux et granulez-les pendant 10 minutes à 32, 800 fois la gravité et quatre degrés Celsius.

Ensuite, après avoir suspendu les cellules dans 10 millilitres de tampon H3, utilisez un potier pour homogénéiser le palais remis en suspension. Ensuite, pour préparer les gradients de densité du saccharose du cordon thal. Commencez avec 12 millilitres de cellules dans le tampon H trois.

Versez ensuite lentement une couche de 12 millilitres de tampon H 4 et terminez avec 12 millilitres de tampon H cinq. Utilisez H cinq pour équilibrer le rotor et centrifuger les gradients pendant une heure à 70, 700 fois la gravité. Retirez les bandes TH des dégradés et utilisez un volume approprié de tampon H six pour les diluer.

Faites tourner les cellules à 37, 900 fois la gravité pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Si le granulé n’est pas serré, ajoutez plus de tampon H six à l’étape de centrifugation. Puis réanimation.

Suspendez les cordons de thal dans un petit volume de tampon H six pour charger un gradient de densité de saccharose du système photo. Tout d’abord, calculez les quantités de cordons thal, de bêta DM et de tampon H six nécessaires pour chaque gradient. Conformément à ces directives, chaque gradient contiendra 0,8 milligramme par millilitre de chlorophylle dans 0,9 % de bêta MS et H six Buffer portera le volume final à 700 microlitres.

Pour solubiliser le thys, préparez séparément Eloqua avec les thylakoïdes bêta DM et le tampon H six pour chaque gradient. Incuber les échantillons sur de la glace pendant 20 minutes et retourner toutes les quelques minutes pour mélanger. Après centrifugation des échantillons à 14 000 fois la gravité pendant 10 minutes et quatre degrés Celsius.

La pastille doit être petite et blanchâtre, et le surnageant sera vert foncé. Chargez le surnageant sur la balance à gradients avec un tampon H six et une ultra-centrifugeuse à 134, 470 fois la gravité pendant 14 heures et quatre degrés Celsius. Après le spin, prenez des photos des dégradés puis fractionnez.

À l’aide d’une aiguille, percez un trou au fond du tube et collectez les fractions dans des tubes de 500 microlitres. Ou un processus de plaque à 96 puits. Les échantillons pour la page SDS en digestion sur gel et spectrométrie de masse selon le protocole de texte comme indiqué ici, en utilisant les résultats de l’analyse immuno-sanguine fraction six du type sauvage et fraction 13 de delta PS un.

Les fractions de pic de A et R un ont été choisies pour l’analyse des composants super-complexes du flux d’électrons cycliques dans cette figure. Les rapports protéiques relatifs, représentés comme de type sauvage sur delta PS un, 14 N sur 15 N pour plusieurs PS un noyau et les protéines de récupération de lumière de PS un, ainsi que pour les protéines affectées au super complexe de flux d’électrons cycliques, sont montrées, les différences d’abondance d’un NR un et de CAS dans les fractions six et 13 de type sauvage et delta PS un suggèrent qu’il s’agit de nouveaux composants de ce complexe voici les résultats de la comparaison quantitative de ce super complexe cyclique de flux d’électrons entre le type sauvage et une souche knock-out de PG L. Il est intéressant de noter que HCF 1 36, le cytochrome B six, le cytochrome B six F sous-unité quatre et le PET C semblent être enrichis dans le type sauvage tandis que le FTSH deux, le cytochrome F et le PET O semblent être enrichis dans le PG L un.

Après avoir regardé cette vidéo, vous aurez une bonne compréhension de la façon de comparer la composition des complexes MultiPro dans les membranes liquides dans différentes conditions. Gardez à l’esprit que pour la préparation réussie des membranes liquides et l’isolation du flux d’électrons cycliques, la perturbation cellulaire super complexe, le potage des cellules et l’isation des membranes liquides sont les étapes critiques. De plus, les gradients de densité du saccharose doivent être centrifugés pendant au moins 12 heures pour obtenir une séparation complète des complexes photosynthétiques.