Une nouvelle approche pour l'analyse comparative des complexes multiprotéiques Basé sur

L'objectif général de cette procédure est d'analyser de manière comparative la composition des complexes MultiPro dans les membranes de thal cord dans différentes conditions. Cela est réalisé en isolant d'abord les membranes de thal à partir de cellules lamona exposées à des conditions anaérobies. Ensuite, les membranes de th cord sont solubilisées et fractionnées sur un gradient de densité de saccharose.

Ensuite, des volumes égaux des fractions souhaitées sont mélangés et séparés par électrophorèse SDS-PAGE. Enfin, les bandes colorées par le colorant kumasi sont digérées avec de la trypsine. En définitive, les échantillons sont analysés par spectrométrie de masse quantitative afin d'observer les variations de l'abondance des protéines entre les fractions étudiées.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les études protéomiques quantitatives comparant une quantité définie de protéines, est que dans notre approche, des volumes égaux d'échantillons fractionnés sont combinés et analysés. Cela permet d'étudier le comportement de migration des protéines au sein du gradient, et en outre, d'analyser la composition de différents complexes non protéiques dans la membrane du troisième groupe. Concernant les souches utilisées, après culture des souches de Chlamydomonas reinhardtii, selon le protocole indiqué, utilisez des solutions mères de saccharose à deux molaire, de β-DM à 10 % dans l'eau, et de tris à 0,5 molaire, pH 8,0.

Pour préparer les solutions suivantes pour des gradients de densité de saccharose afin de mettre en place les gradients en utilisant des tubes de centrifugation de 14 sur 89 millimètres, commencez par verser lentement un millilitre de solution 1,3 molaire, suivi d’un millilitre de solution 1,0 molaire. Ensuite, versez deux millilitres de chacune des solutions 0,85, 0,7, 0,65, et enfin, 0,4 molaire. Conservez les gradients toute la nuit dans la chambre froide afin d'induire des conditions anaérobies.

Dans les cultures de chlamydomonas, insérez une pipette en verre dans les flacons de culture et barbotez de l'argon pendant quatre heures avec agitation continue et illumination pour isoler les membranes du thylacoïde. Après l'incubation, commencez par centrifuger les cellules cinq minutes à 2 500 ×g et à 4 °C. Resuspendez ensuite les culots cellulaires dans 30 millilitres de tampon H1.

Répétez la centrifugation et, à nouveau, resuspendez. Suspendez les cellules dans le tampon H1 pour lyser les cellules, puis faites-les passer à travers un nébuliseur avec une pression d'azote de 1 500 pascals. Assurez-vous que la distance entre la bille en céramique et le métal est suffisamment petite pour que les cellules se brisent.

Ensuite, centrifuger les cellules pendant sept minutes à 2 500 ×g et à 4 °C. Le surnageant doit être de couleur vert pâle. Si la lyse cellulaire a réussi, resuspendre les cellules dans 50 millilitres de tampon H₂O et former un culot par centrifugation pendant 10 minutes à 32 800 ×g et à 4 °C.

Ensuite, après avoir resuspendu les cellules dans 10 millilitres de tampon H trois, utilisez un homogénéisateur Potter pour homogénéiser la pastille resuspendue. Préparez ensuite des gradients de densité au saccharose pour la corde thal. Commencez avec 12 millilitres de cellules dans du tampon H trois.

Ensuite, versez lentement une couche de 12 millilitres de tampon H quatre et terminez par 12 millilitres de tampon H cinq. Utilisez le tampon H cinq pour équilibrer le rotor et centrifugez les gradients pendant une heure à 70 700 ×g. Retirez les bandes TH des gradients et diluez-les avec un volume approprié de tampon H six.

Faire centrifuger les cellules à 37 900 ×g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Si le culot n’est pas compact, ajouter plus de tampon H6 à l’étape de centrifugation. Ensuite, resuspendre.

Suspendez les cordons thallaires dans un petit volume de tampon H six pour charger un gradient de densité de saccharose d'un système photo. Calculez d'abord les quantités de cordons thallaires, de Bêta DM et de tampon H six nécessaires pour chaque gradient. Selon ces directives, chaque gradient contiendra 0,8 milligramme par millilitre de chlorophylle dans 0,9 % de Bêta DM et le tampon H six portera le volume final à 700 microlitres.

Pour solubiliser les thylakoïdes, préparez séparément des solutions d'Eloqua contenant des thylakoïdes, du β-DM et du tampon H6 pour chaque gradient. Incubez les échantillons sur de la glace pendant 20 minutes et retournez-les toutes les quelques minutes pour bien mélanger. Après centrifugation des échantillons à 14 000 ×g pendant 10 minutes à 4 °C.

Le culot doit être petit et de couleur blanchâtre, et le surnageant sera vert foncé. Charger le surnageant sur les gradients équilibrés avec le tampon H six et effectuer une ultracentrifugation à 134 470 × g pendant 14 heures à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, prendre des photos des gradients, puis fractionner.

Utilisez une aiguille pour percer un trou au fond du tube et recueillir les fractions dans des tubes de 500 microlitres. Ou utilisez un procédé avec une plaque de 96 puits. Les échantillons pour la migration SDS-PAGE, la digestion en gel et la spectrométrie de masse sont préparés selon le protocole décrit dans le texte, en utilisant les résultats de la fraction six de l'analyse immunologique du sang de type sauvage et de la fraction 13 du mutant delta PS un.

Les fractions correspondant aux pics de A et de R un ont été choisies pour l'analyse des composants du supercomplexe du flux cyclique d'électrons dans cette figure. Les rapports protéiques relatifs, représentés sous la forme type sauvage sur delta PS un, 14 N sur 15 N, pour plusieurs protéines centrales et de captage lumineux de PS un, ainsi que pour les protéines attribuées au supercomplexe du flux cyclique d'électrons, sont indiqués. Les différences d'abondance de NR un et de CAS dans les fractions six et treize des souches type sauvage et delta PS un suggèrent qu'elles constituent de nouveaux composants de ce complexe. Sont présentés ici les résultats de la comparaison quantitative de ce supercomplexe du flux cyclique d'électrons entre le type sauvage et une souche déficiente pour PG L un. De manière intéressante, HCF 1 36, le cytochrome B six, la sous-unité quatre du cytochrome B six F et PET C semblent être enrichis dans le type sauvage, tandis que FTSH deux, le cytochrome F et PET O semblent être enrichis dans PG L un.

Après avoir visionné cette vidéo, vous aurez une bonne compréhension de la manière de comparer la composition des complexes MultiPro dans des membranes liquides di sous différentes conditions. Gardez à l'esprit que pour la préparation réussie des membranes liquides th et l'isolement du flux d'électrons cyclique, la rupture des cellules super complexes, le passage des cellules au potter et l'homogénéisation des membranes liquides th constituent les étapes critiques. En outre, les gradients de densité de saccharose doivent être centrifugés pendant au moins 12 heures afin d'obtenir une séparation complète des complexes photosynthétiques.