Le poisson zèbre rapide et efficace génotypage utilisant la PCR avec haute résolution Melt analyse

L’objectif global de cette procédure est de dépister rapidement différents génotypes, mutations ou transgènes chez le poisson zèbre. Pour ce faire, on extrait d’abord l’ADN de clips minces, puis on amplifie l’ADN par PCR. L’étape suivante consiste à dénaturer les amplicons PCR tout en enregistrant les courbes de fusion, qui sont analysées par un logiciel.

En fin de compte, les résultats montrent des courbes de fusion distinctes pour différents génotypes. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la PCR de volume d’électrophorèse sur gel, est qu’elle est sensible aux changements de nucléotides uniques, aux petites insertions, à toutes les délétions et que cette technique est rapide et fiable. Bien que cette technique puisse être utilisée pour génotyper rapidement et efficacement le poisson zèbre, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes et organismes modèles, y compris les lignées cellulaires, les souris et d’autres animaux.

Le jour de la préparation de l’ADN, ajoutez la protéinase K fraîche au tampon de lyse à une concentration d’un milligramme par millilitre. Les tissus peuvent être prélevés sur un poisson adulte à l’aide d’une pince mince ou sur un poisson embryonnaire. Anesthésie d’abord le poisson dans la solution Trica.

Attendez que les mouvements des branchies ralentissent. Ensuite, placez le poisson sur une pile de mouchoirs et avec une lame de rasoir stérile, coupez un petit morceau de la nageoire caudale d’environ deux à trois millimètres de long. Placez rapidement le poisson dans un réservoir étiqueté avec de l’eau douce pour la récupération.

Prenez l’attache à ailettes avec une pointe de pipette stérile et transférez-la dans un tube rempli de 100 microlitres de tampon de lyse d’ADN. Assurez-vous d’étiqueter à la fois le réservoir de l’animal et le tube, incubez tous les tissus collectés pendant au moins quatre heures et jusqu’à la nuit à 55 degrés Celsius après l’incubation. Inactivez la protéine ACE K en chauffant les tubes à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Ces échantillons doivent être utilisés immédiatement pour la PCR, mais peuvent également être conservés à moins 20 degrés Celsius jusqu’à trois mois. Effectuez la PCR dans une plaque de 96 ou 384 puits pour chaque réaction. Ne combinez pas plus d’un microlitre d’ADN adulte avec quatre microlitres de scanner de lumière.

Master mix contenant la sonde fluorescente et les amorces à une concentration finale de cinq pico molaires chacune. Si l’ADN provient d’un embryon, utilisez jusqu’à trois microlitres. Couvrez les réactions avec 30 microlitres d’huile minérale, puis fermez-les.

Ensuite, recouvrez la plaque PCR chargée d’un joint adhésif optiquement transparent. Optimisez maintenant les conditions de cycle PCR. Un ensemble de conditions typique commence par cinq minutes de temps de fusion.

S’ensuit 30 cycles de PCR avec des fusions de dix secondes, 25 secondes de temps d’agenouillement et 30 secondes d’allongement. La réaction doit se terminer par un ajout de 32e point fondu, puis refroidir à 15 degrés Celsius. Analysez la plaque PCR en la plaçant dans un système d’analyse de fusion dans le logiciel.

Configurez la température et créez un nouveau fichier de stockage de données. Configurez un sous-ensemble. Sélectionnez les puits contenant des échantillons dans la partie inférieure gauche de l’écran.

Sélectionnez l’onglet normalisé pour éliminer les variantes fluorescentes. Positionnez manuellement la double ligne parallèle dans les régions prem, melt et post-melt et normalisez les signaux fluorescents premel et post-fusion de tous les échantillons à un et zéro respectivement. Ensuite, distinguez les génotypes en fonction de leur température de fusion en sélectionnant d’abord le regroupement.

Sélectionnez ensuite groupe automatique dans la liste de sélection standard. Dans la section de regroupement, sélectionnez normal ou élevé pour les profils de fusion avec des transitions simples ou plusieurs transitions respectivement. Ils se trouvent dans la liste de sélection de sensibilité sous la section de regroupement.

Sélectionnez maintenant les groupes de calcul dans la section de regroupement, puis allez dans le menu Fichier et cliquez sur Enregistrer pour enregistrer les résultats. Le protocole peut être réalisé au cours d’une seule journée ou séparé en étapes sur plusieurs jours. Lors de la PCR, les températures de fusion de l’amplicon dépendent de la taille et de la teneur en GC, mais généralement des températures de début et de fin de 60 degrés Celsius et 95 degrés Celsius sont appropriées une fois la fusion effectuée.

L’analyse des courbes de fusion fluorescentes nécessite généralement une normalisation de la variation des différentes courbes d’échantillon en utilisant des régions pré et post-fusion comme normes. Cela améliore la comparaison des résultats de différents échantillons dans lesquels la variation de fluorescence est liée à des variations expérimentales mineures. Chaque paire de lignes de température pour la normalisation doit être placée à environ un degré Celsius l’une de l’autre.

Les données peuvent être représentées de deux manières par un graphique qui montre les fichiers de profils de courbe de fusion, ou par un graphique qui montre un graphique de différence soustractive par rapport à un échantillon de référence après analyse HRMA, des mutations ou des transgènes peuvent être détectés. Deux mutations différentes dans le gène EIF, deux B cinq, sont notées par les courbes rouge et bleue. Ces échantillons mutants sont identifiés par leur différence significative dans leur courbe de fusion, leurs formes ou leur changement de fluorescence par rapport aux courbes standard de type sauvage.

Cet exemple de quatre génotypes différents dans une seule collection d’embryons illustre la puissance et la sensibilité de la méthode. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de huit heures. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une HRMA pour un dépistage efficace à grande échelle des génotypes du poisson zèbre.