Name: Le poisson zèbre rapide et efficace génotypage utilisant la PCR avec haute résolution Melt analyse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Découvrez le génotypage rapide du poisson zèbre par PCR et analyse de fusion haute résolution. Cette méthode sensible détecte les mutations et transgènes pour accélérer le criblage génétique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions les membres des Blaschke, Grunwald, et Wittwer laboratoires pour obtenir des conseils et une assistance technique. Ce travail est soutenu par la Fondation PCMC, NIH R01 MH092256 et DP2 MH100008, et le Mars de Dimes Foundation subvention de recherche n ° 1-AF13-425, à JLB.

Une. Préparation de l&#39;ADN <ol><li> Préparer le tampon de lyse de l&#39;ADN: 50 mM de KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% de Tween 20, 0,3% de NP40. Ajouter fraîche protéinase K à une concentration finale de 1 mg / ml le jour de l&#39;utilisation 12. </li><li> collecte des tissus: <ol><li> Pour adultes pince poisson nageoire: <ol><li> Anesthésier les poissons: Placer le poisson dans 0,004% MS-222 (tricaine) solution. Attendez jusqu&#39;à ce que le mouvement des branchies ralentit. </li><li> Mettez le poisson sur une pile de 5-10 Kimwipes et couper un petit morceau de la nageoire caudale, environ 2-3 mm, avec une lame de rasoir stérile. </li><li> Placer rapidement le poisson dans un réservoir de l&#39;étiquette à l&#39;eau douce pour la récupération; étiqueter soigneusement la fois le réservoir et le tube correspondant qui contiendra la nageoire. Changez l&#39;eau et nourrir les poissons tous les jours. </li><li> Ramassez la nageoire avec une pointe de pipette stérile et le transférer dans un tube rempli de 100 tampon de lyse ADN ul. </li><li> Jeter la pointe de la pipette, et jeter la lame de rasoir dans un récipient pour objets tranchants. </li></ol></li><li> Pour embryon queue clip: <ol><li> Placez embryons dans 0,004% MS-222 (tricaine) solution. Attendez 2 min. </li><li> Coupez un morceau de queue avec une pince sous un microscope à dissection. </li><li> Mettez la queue dans un tube étiqueté rempli de 30 tampon de lyse d&#39;ADN ul. </li><li> Mettre rapidement à l&#39;embryon dans un tube contenant 100 ul de paraformaldehyde à 4%. </li><li> Identifier les tubes avec des embryons et leurs tubes de queue correspondantes. </li><li> Stockez les tubes avec des embryons à 4 ° C pendant la nuit pour la fixation. </li><li> Nettoyez les pinces avec de l&#39;eau Milli-Q et Kimwipes entre chaque embryon pour minimiser la contamination. </li></ol></li><li> Pour les embryons entiers: <ol><li> Placez embryons dans 0,004% MS-222 (tricaine) solution. Attendez 2 min. </li><li> Mettez 1-5 embryons dans un tube rempli de 100 tampon de lyse ADN ul. Dechorionation n&#39;est pas nécessaire. </li></ol></li></ol></li><li> Digestion de l&#39;ADN Incuber les tubes avec le tissu (nageoires ou de la queue des clips ou des embryons) à 55 ° Cpendant 4 heures jusqu&#39;à la nuit 12. </li><li> Inactiver la protéinase K tubes à chaleur à 95 ° C pendant 15 min 12. ADN doit être utilisée pour la PCR immédiatement, ou conservée à -20 ° C pendant jusqu&#39;à 3 mois. </li></ol> 2. PCR <ol><li> Concevoir des amorces soit manuellement ou par logiciel de conception d&#39;amorce (par exemple Lightscanner Primer logiciel de conception-Biofire). Les produits de PCR pour HRMA sont généralement 50-200 pb; produits de PCR pour la détection de SNP devraient être plus petits, généralement 50-80 pb. </li><li> PCR <ol><li> Effectuer réaction de PCR dans une plaque de 96 puits ou 384 puits. </li><li> Utilisez 10 pi volume total: 4 master mix de LightScanner pi (0,1 U chaud Commençons Taq-AB polymérase, tampon, 0,2 mM dNTPs, le chlorure de magnésium 2 mM, et 1x colorant fluorescent d&#39;ADN double brin contraignante); 5 pmol de chaque amorce, et 1 pl matrice d&#39;ADN génomique extrait de queue adulte aileron ou 3 pl de l&#39;ADN génomique de la queue embryonnaire 13. </li><li> échantillons de couverture avec 30 ul d&#39;huile minérale. </li&gt; <li> Couvrir la plaque avec un joint adhésif optiquement transparent. </li><li> Optimiser PCR vélo conditions-typiques conditions sont 95 ° C pendant 5 min et 30 cycles de 10 s à 95 ° C, 25 sec à 60 ° C, 30 secondes à 72 ° C, se terminant par 95 ° C pendant 30 sec et refroidi à 15 ° C. </li><li> Magasin plaques PCR à 4 ° C ou continuent directement à AGRH. </li><li> Confirmer notre produit de PCR par analyse de sa dimension en utilisant une électrophorèse sur gel d&#39;agarose pendant l&#39;optimisation initiale de la PCR, et, si indiqué, par séquençage du produit de PCR. </li></ol></li></ol> 3. HRMA <ol><li> chauffer les assiettes <ol><li> Placer la plaque dans un système d&#39;analyse à l&#39;état fondu. </li><li> Ouvrez le logiciel (Software LightScanner Call-IT 2.0). </li><li> Faites chauffer les assiettes de 60 à 95 ° C. </li><li> Créer un nouveau fichier de stockage de données. </li></ol></li><li> Analyser les données de HRMA (Figure 2). Plusieurs étapes d&#39;analyse sont possibles. Nous montrons l&#39;ensemble le plus couramment utilisé de données manipulations. <ol><li> réglage de sous-ensemble Cliquez sur l&#39;onglet Sous-ensemble. Sélectionnez les puits avec des échantillons. </li><li> Normalisation <ol><li> Sélectionnez l&#39;onglet Normaliser dans le panneau de gauche. Pour éliminer la fluorescence variance, positionner manuellement la double ligne parallèle en pré-(initiale) et les régions poste (finale)-fusion comme illustré (figure 2C, pointes de flèches) et normaliser préfusion et de fluorescence post-fusion des signaux de tous les échantillons de 1 et 0 , respectivement 14. </li><li> Ajuster le positionnement des lignes de sorte que la région de fusion est dans la région entre les pré-et post-fusion des lignes, mais pas sélectionné. En général, la Basse-Min et Max Basse (et supérieur Min et Max supérieur) lignes de température doivent être placés à environ 1 ° C dehors. </li><li> Choisissez positions de température de normalisation tels que tous les échantillons ont (100%) fluorescence maximale ou totale de la région de première fusion et un minimum ou pas (0%) fluorescence pour la région post-fusion (mieux que possible). La normalisation devrait conduire à une ligne presque horizontale à la fluorescence maximale de 1 qui s&#39;étend jusqu&#39;au point de fusion, puis une ligne presque horizontale à partir du point de la fluorescence minimum de 0 à l&#39;état fondu, il ne devrait pas y avoir des niveaux de fluorescence supérieures à 1 ou inférieures à 0 . Par exemple, sur la figure 2C, normaliser les courbes de préfusion en utilisant des plages de températures de 79-80 ° C. </li></ol></li><li> Groupement / Clustering Distinguer les génotypes en fonction de leur température de fusion (figure 2C, boîte verte). Sélectionnez Groupement. <ol><li> Sélectionnez Autogroup de la liste de sélection des normes dans la section Groupement. </li><li> Sélectionnez Normal ou Haut pour la fusion des profils avec des transitions simples ou multiples transitions respectivement dans la liste de sélection de sensibilité dans la section Groupement. </li><li> Sélectionnez ComputeGroupes sous la section Groupement. </li><li> Allez dans le menu Fichier et cliquez sur Enregistrer pour enregistrer les résultats. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li>
<li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Sander, J. D., Cade, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).</li>
<li>Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+gene+targeting+in+zebrafish+using+customized+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).</li>
<li>Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+melting+analysis+%28HRMA%29%3A+more+than+just+sequence+variant+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutation%22%5BJournal%5D)">High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening.</a> Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).</li>
<li>Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+methods+for+generating+and+detecting+locus-specific+mutations+induced+with+TALENs+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome.</a> PLoS Genet. 8 (8), (2012).</li>
<li>Liew, M., Pryor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+of+single-nucleotide+polymorphisms+by+high-resolution+melting+of+small+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons.</a> Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).</li>
<li>Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+Amplicon+DNA+melting+analysis+for+mutation+scanning+and+genotyping%3A+cross-platform+comparison+of+instruments+and+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes.</a> Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).</li>
<li>Carrillo, J., Martínez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melting+analysis+for+the+identification+of+novel+mutations+in+DKC1+and+TERT+genes+in+patients+with+dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cell.+Mol.+Dis.%22%5BJournal%5D)">High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita.</a> Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).</li>
<li>Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melt+analysis+%28HRMA%29%3B+a+viable+alternative+to+agarose+gel+electrophoresis+for+mouse+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping.</a> PloS one. 7 (9), (2012).</li>
<li>Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIK3CA+hotspot+mutation+scanning+by+a+novel+and+highly+sensitive+high-resolution+small+amplicon+melting+analysis+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method.</a> J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).</li>
<li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li>
<li>Xing, L., Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+foxP2+zinc+finger+nuclease+mutant+has+normal+axon+pathfinding%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding.</a> PloS one. 7 (8), (2012).</li>
<li>Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+High+Resolution+Melting+analysis+as+an+alternate+tool+to+screen+for+risk+alleles+associated+with+small+kidneys+in+Indian+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns.</a> BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).</li>
<li>Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+Expanded+instrument+comparison+of+amplicon+DNA+melting+analysis+for+mutation+scanning+and+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping.</a> Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).</li>
<li>Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Genotyping+by+Amplicon+Melting+Analysis+Using+LCGreen%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen.</a> Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).</li>
<li>Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+closed-tube+methylation-sensitive+high+resolution+melting+assay+%28MS-HRMA%29+for+the+semi-quantitative+determination+of+CST6+promoter+methylation+in+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples.</a> BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).</li>
<li>Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+two+broad-range+PCR+assays+for+pathogen+detection+in+positive-blood-culture+bottles%3A+PCR-high-resolution+melting+analysis+versus+PCR-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry.</a> J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

PCR combinée avec HRMA est une technologie puissante pour le génotypage du poisson zèbre. Les avantages de cette approche sont sa vitesse, la robustesse et la sensibilité à détecter même des mutations ponctuelles. L&#39;ensemble du protocole, à partir de la cassette d&#39;analyse ailette pour faire fondre la courbe, peut être effectuée en moins de huit heures par une seule personne. De plus, la technique est susceptible de criblage à haut débit, ne nécessite pas l&#39;utilisation de bromure d&#39;éthidium, et est scellé...

Poisson zèbre (Danio rerio) est un système de modèle vertébré largement utilisé pour les études de développement et de modélisation de la maladie. Récemment, de nombreuses technologies transgéniques et de mutation ont été développés pour le poisson zèbre. Techniques de transgénèse rapides, généralement basés sur un système de transposon Tol2 1, ont été combinées avec une amélioration des options de clonage multiple pour l&#39;assemblage de fragments d&#39;ADN 2. Nucléases à doigts de zinc (ZFN) et transcription nucléases effectrices activateur comme (Talens) ont été utilisées pour cibler les lieux dans les cellules somatiques et germinales chez le poisson zèbre 3,4. Ces techniques peuvent générer efficacement des animaux génétiquement modifiés, avec la création de mutation à haute fréquence et la transmission de la lignée germinale 3,4. Malgré ces avancées, les techniques de génotypage traditionnels chez le poisson zèbre limiter la puissance des outils de mutagenèse et la transgenèse. PCR suivie d&#39;une électrophorèse sur gel, parfois combinée à RESTRICTIOn digestion avec des enzymes, est largement utilisée pour détecter la modification du génome, mais est longue et moins sensible pour identifier de petites insertions ou délétions. essais de sonde TaqMan ont des coûts initiaux élevés et nécessitent une optimisation soignée. Le séquençage des produits de PCR peut prendre plusieurs jours et n&#39;est pas pratique pour le dépistage à grande échelle. longueur des fragments de restriction (RFLP) analyse ne peut discriminer SNP affectant un nombre limité de sites de reconnaissance des enzymes de restriction. Analyse à haute résolution fusion (HRMA), un post-PCR méthode d&#39;analyse en tube fermé, est un procédé récemment mis au point qui est rapide, sensible, peu coûteux, et aptes à la sélection de grands nombres d&#39;échantillons. HRMA peut être utilisé pour détecter des SNP, les mutations et les transgènes 7.5. HRMA est basé sur la dénaturation thermique des ADN double brin, et chaque amplicon de PCR a une dissociation uniques (fondre) caractéristique 5. Les échantillons peuvent être victimes de discrimination en raison to leur composition différente de nucléotides, contenu GC, ou longueur, généralement en combinaison avec un colorant fluorescent qui se lie uniquement l&#39;ADN double brin 8. Ainsi, HRMA peut distinguer différents génotypes sur la base des caractéristiques différentes à l&#39;état fondu de courbe. Parce que HRMA utilise des réactifs à faible coût et est un processus post-PCR en une seule étape, il peut être utilisé pour des stratégies à haut débit. HRMA est non destructive, si suite à l&#39;analyse des amplicons PCR peuvent être utilisés pour d&#39;autres applications. HRMA a été appliqué dans de nombreux organismes, y compris les systèmes et les lignées cellulaires, les souris et les humains 9-11. Son utilisation a été récemment décrit dans le poisson zèbre pour détecter des mutations induites par les nucléases à doigt de zinc (ZFN) et Talens 6,12,13. Dans cet article, nous décrivons comment effectuer HRMA basée sur la PCR chez le poisson zèbre embryonnaire et adulte (figure 1). Ce protocole est adapté pour détecter des SNP, les transgènes et les mutations, notamment single changements de paires de bases, des insertions ou des suppressions.

<table><tbody><tr><td>100 Reaction LightScanner Master Mix</td><td>BioFire</td><td>HRLS-ASY-0002</td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Plaques PCR 96 puits BLK/WHT Laboratories</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9665</td><td>www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Joints adhésifs Microseal 'B'</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>MSB1001</td><td>www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>96-well LightScanner Instrument</td><td>BioFire</td><td>LSCN-ASY-0040</td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Logiciel LightScanner avec Call-IT 2.0</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Analyse de fusion haute résolution 2.0</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>LightScanner Primer Design Software</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Vector NTI</td><td>Software Invitrogen</td><td></td><td>www.invitrogen.com</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>paraformaldéhyde</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

le poisson zèbre rapide et efficace génotypage utilisant la pcr avec haute résolution melt analyse

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Le poisson zèbre est un système de modèle vertébré puissant pour étudier le développement, la modélisation de la maladie, et en effectuant le criblage de médicaments. Récemment, une variété d&#39;outils génétiques ont été mis en place, y compris des stratégies multiples pour induire des mutations et de générer des lignées transgéniques. Cependant, le dépistage à grande échelle est limitée par des méthodes de génotypage traditionnels, qui prennent beaucoup de temps et de main-d&#39;œuvre. Nous décrivons ici une technique pour analyser les génotypes de poisson zèbre par PCR combinées avec l&#39;analyse à haute résolution fusion (AGRH). Cette approche est rapide, sensible et peu coûteux, avec un risque plus faible d&#39;objets de contamination. Le génotypage par PCR avec HRMA peut être utilisé pour des embryons ou des poissons adultes, y compris dans des protocoles de criblage à haut débit.

Le protocole peut être effectué pendant une seule journée ou dans des étapes séparées sur plusieurs jours (diagramme de flux de travail est représentée sur la figure 1). extraction de l&#39;ADN est suivie par la fusion et l&#39;analyse des amplicons PCR. Les températures pour la fusion de l&#39;amplicon dépendent de la taille et de GC-contenu, mais en général, et de commencer à des températures de 50 ˚ C et 95 ˚ C terminales sont appropriées (figures 2A et 2B). Une fois...

PCR combinée à l&#39;analyse de fusion à haute résolution (AGRH) est démontré comme une méthode rapide et efficace de déterminer le génotype du poisson zèbre.

Le poisson zèbre rapide et efficace génotypage utilisant la PCR avec haute résolution Melt analyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

L'objectif général de cette procédure est de cribler rapidement différents génotypes, mutations ou transgènes chez le poisson-zèbre. Cette étape est réalisée en extrayant d'abord l'ADN à partir de prélèvements minces, puis en amplifiant l'ADN par PCR. L'étape suivante consiste à dénaturer les amplicons PCR tout en enregistrant les courbes de fusion, qui sont ensuite analysées par un logiciel.En fin de compte, les résultats montrent des courbes de fusion distinctes pour les différents génotypes. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'électrophorèse sur gel ou la PCR en volume est sa sensibilité aux variations d'un seul nucléotide, aux petites insertions, à toutes les délétions, et le fait que cette technique soit rapide et fiable. Bien que cette méthode puisse être utilisée pour génotyper rapidement et efficacement le poisson zèbre, elle peut également s'appliquer à d'autres systèmes et organismes modèles, notamment des lignées cellulaires, des souris et d'autres animaux.Au jour de la préparation de l'ADN, ajouter de la protéinase K fraîche au tampon de lyse à une concentration de un milligramme par millilitre. Le tissu peut être prélevé sur un poisson adulte à l'aide d'une petite pince ou sur un poisson embryonnaire. Anesthésier d'abord le poisson dans une solution Trica.Attendez que les mouvements des branchies ralentissent. Ensuite, placez le poisson sur une pile de compresses et, à l’aide d’un scalpel stérile, prélevez un petit morceau de la nageoire caudale d’environ deux à trois millimètres de long. Replacez rapidement le poisson dans un aquarium étiqueté contenant de l’eau fraîche pour sa récupération.Prélevez le lambeau de nageoire à l’aide d’une pointe de pipette stérile et transférez-le dans un tube contenant 100 microlitres de tampon de lyse d’ADN. Veillez à étiqueter à la fois le réservoir de l’animal et le tube, puis incubez tous les tissus prélevés pendant au moins quatre heures et jusqu’à toute une nuit à 55 degrés Celsius. Après l’incubation, inactiver la protéine ACE K en chauffant les tubes à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes.Ces échantillons doivent être utilisés immédiatement pour la PCR, mais peuvent également être conservés à moins 20 degrés Celsius pendant jusqu'à trois mois. Réalisez la PCR dans une plaque de 96 ou 384 puits pour chaque réaction. Combinez au plus une microlitre d'ADN adulte avec quatre microlitres de light scanner.Un mélange maître contenant la sonde fluorescente et les amorces à une concentration finale de cinq pico molaire chacune. Si l'ADN provient d'un embryon, utilisez jusqu'à trois microlitres. Recouvrez les réactions avec 30 microlitres d'huile minérale, puis fermez-les hermétiquement. Ensuite, recouvrez la plaque PCR chargée avec un film adhésif optiquement transparent. Optimisez maintenant les conditions de cyclage PCR. Un ensemble de conditions typique commence par cinq minutes de temps de fusion.Cela est suivi de 30 cycles de PCR avec des dénaturations de dix secondes, 25 secondes d'hybridation et 30 secondes d'élongation. La réaction doit se terminer par une dénaturation supplémentaire de 32e cycle, puis refroidir à 15 degrés Celsius. Analyser la plaque de PCR en la plaçant dans un système d'analyse de fusion dans le logiciel.Configurez la température et créez un nouveau fichier de stockage des données. Définissez un sous-ensemble. Sélectionnez les puits contenant les échantillons dans le coin inférieur gauche de l'écran.Sélectionnez l'onglet normalisé pour éliminer les variants fluorescents. Positionnez manuellement la double ligne parallèle dans les régions pré-fusion, de fusion et post-fusion, puis normalisez les signaux fluorescents pré-fusion et post-fusion de tous les échantillons à un et zéro respectivement. Ensuite, distinguez les génotypes en fonction de leur température de fusion en sélectionnant d'abord le regroupement.Ensuite, sélectionnez « auto group » dans la liste de sélection standard. Dans la section de regroupement, choisissez « normal » ou « high » pour les profils de fusion présentant respectivement une transition unique ou des transitions multiples. Ces options se trouvent dans la liste de sélection de sensibilité située sous la section de regroupement.Sélectionnez maintenant les groupes de calcul dans la section de regroupement, puis allez dans le menu Fichier et cliquez sur Enregistrer pour sauvegarder les résultats. Le protocole peut être réalisé en une seule journée ou réparti en étapes sur plusieurs jours. Lors de la réalisation de la PCR, les températures de fusion de l'amplicon dépendent de la taille et de la teneur en GC, mais des températures initiale et finale de 60 degrés Celsius et 95 degrés Celsius sont généralement adaptées une fois la courbe de fusion effectuée.L'analyse des courbes de fusion fluorescentes nécessite généralement une normalisation de la variation des différentes courbes d'échantillons à l'aide de régions pré- et post-fusion comme références. Cela améliore la comparaison des résultats provenant d'échantillons différents, dans lesquels la variation de la fluorescence est liée à de légères variations expérimentales. Chaque paire de lignes de température destinée à la normalisation doit être placée à environ un degré Celsius d'intervalle.Les données peuvent être représentées de deux manières : par un graphique montrant les profils de courbe de fusion, ou par un graphique montrant un tracé de différence soustractive par rapport à un échantillon de référence après analyse HRMA, permettant la détection de mutations ou de transgènes. Deux mutations différentes dans le gène EIF two B five sont indiquées par les courbes rouge et bleue. Ces échantillons mutants sont identifiés par leur différence significative dans la forme de leur courbe de fusion ou par un changement de fluorescence par rapport aux courbes types de type sauvage.Cet exemple de quatre génotypes différents dans un seul prélèvement d'embryons illustre la puissance et la sensibilité de la méthode. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de huit heures. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment effectuer l'analyse de la courbe de dénaturation (HRMA) pour un criblage à grande échelle efficace des génotypes de zebrafish.

rapid-efficient-zebrafish-genotyping-using-pcr-with-high-resolution

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Cet article décrit l’extraction de l’ADN du clip de queue de poisson zèbre. Le protocole démontre une méthode rapide et efficace pour analyser les génotypes du poisson-zèbre.

Extraction d’ADN à partir d’un clip de queue : une méthode utilisée dans le génotypage du poisson-zèbre

Dans cette vidéo, nous décrivons une technique de PCR de fusion à haute résolution pour déterminer le polymorphisme de longueur de fragments d’ADN de différentes longueurs de séquence, sur la base de l’analyse de la température de fusion.

PCR de fusion à haute résolution pour déterminer les variations de séquence dans les séquences d’ADN mutant

Bien que l'analyse haute résolution de fusion offre la possibilité de différencier les polymorphismes nucléotidiques simples dans une population hétérogène, biais d'amplification allèle mutant peut augmenter sa capacité à détecter les allèles présents à des pourcentages relativement faibles dans un échantillon. Ce protocole décrit des améliorations qui permettent d'améliorer la sensibilité de l'analyse de fusion de haute résolution.

Méthodes pour augmenter la sensibilité de la haute résolution de fusion Single Nucleotide Polymorphism génotypage dans le paludisme

La technique de génotypage décrit ici, qui couple de réaction en chaîne par polymérase fluorescente (PCR) à une électrophorèse sur gel capillaire, permet de génotypage à haut débit des clones knock-out à médiation par nuclease. Il évite les limitations rencontrées par d'autres techniques de génotypage et est plus rentable que les méthodes de séquençage.

L&#39;utilisation d&#39;un PCR-capillaire fluorescent Gel Electrophoresis Technique pour Génotype CRISPR / cas9 médiation Knockout Mutants dans un format à haut débit

Édition de génome ciblé dans le système de modèle Danio rerio (poisson-zèbre) a été grandement facilitée par l’émergence des approches axées sur les CRISPR. Ici, nous décrivons un protocole simplifié et robuste pour la génération et l’identification d’allèles de dérivés CRISPR non-sens qui intègre l’analyse de mobilité hétéroduplex et l’identification des mutations à l’aide de séquençage de prochaine génération.

Une Production efficace et généré par l’Identification de CRISPR/Cas9 les débouchures de gène dans le modèle système Danio rerio

Poisson zèbre servaient récemment un système de modèle in vivo pour étudier la synchronisation de réplication ADN au cours du développement. Voici détaillées les protocoles d’utilisation des embryons de poisson-zèbre à synchronisation de réplication de profil. Ce protocole peut être facilement adapté pour étudier la synchronisation de la réplication en mutants, types de cellules individuelles, les modèles de maladies et d’autres espèces.

Profilage ADN calendrier de réplication à l’aide de poisson-zèbre comme un système de modèle In Vivo

Poisson zèbre ont été utilisés comme des organismes modèle génétique fiable dans la recherche biomédicale, en particulier avec l’avènement des techniques de modification génétique. Lorsque les larves phénotypes sont supposés, identification de l’ADN d’extraction et de génotype peut être difficile. Ici, nous décrivons une procédure efficace de génotypage pour les larves de poisson zèbre, par coupure de queue, dès 72 h après la fécondation.

Extraction d’ADN de haut débit et le génotypage des larves de poisson zèbre 3dpf de découpage Fin

Les technologies d'édition génétique ont permis aux chercheurs de générer des mutants de poissons zèbres pour étudier la fonction génique avec une relative facilité. Ici, nous fournissons un guide pour effectuer le génotypage d'embryons parallèles et la quantification des signaux d'hybridation in situ chez le poisson zèbre. Cette approche impartiale offre une plus grande précision dans les analyses phénotypiques basées sur l'hybridation in situ.

Génotypage et quantification de l'hybridation in situ Taining in Zebrafish

La régénération des muscles squelettiques est entraînée par les cellules souches musculaires résidentes des tissus, qui sont altérées dans de nombreuses maladies musculaires telles que la dystrophie musculaire, ce qui entraîne l’incapacité du muscle à se régénérer. Ici, nous décrivons un protocole qui permet l’examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson zèbre de la maladie musculaire.

Examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson-zèbre de maladie musculaire

Les technologies CRISPR-Cas ont révolutionné le domaine de l’édition du génome. Cependant, trouver et isoler la modification souhaitée de la lignée germinale reste un goulot d’étranglement majeur. Par conséquent, ce protocole décrit une méthode robuste pour dépister rapidement les spermatozoïdes de poisson-zèbre injectés par F0 CRISPR pour les modifications de la lignée germinale en utilisant des techniques standard de PCR, de digestion de restriction et d’électrophorèse sur gel.

Dépistage des spermatozoïdes pour l’isolement rapide des modifications de la lignée germinale chez le poisson zèbre

Ici, nous présentons un protocole pour marquer les protéines avec une étiquette de protéine de fluorescence chez les larves de poisson-zèbre, un système in vivo nouvellement développé et modifié particulièrement utile pour visualiser les protéines de faible abondance chez le poisson zèbre.

Marquage par fluorescence pour visualiser les protéines faiblement exprimées chez le poisson-zèbre

Découvrez le génotypage rapide du poisson zèbre par PCR et analyse de fusion haute résolution. Cette méthode sensible détecte les mutations et transgènes pour accélérer le criblage génétique.

Le poisson zèbre rapide et efficace génotypage utilisant la PCR avec haute résolution Melt analyse

Explorer plus de vidéos