Le poisson zèbre rapide et efficace génotypage utilisant la PCR avec haute résolution Melt analyse

L'objectif général de cette procédure est de cribler rapidement différents génotypes, mutations ou transgènes chez le poisson-zèbre. Cette étape est réalisée en extrayant d'abord l'ADN à partir de prélèvements minces, puis en amplifiant l'ADN par PCR. L'étape suivante consiste à dénaturer les amplicons PCR tout en enregistrant les courbes de fusion, qui sont ensuite analysées par un logiciel.

En fin de compte, les résultats montrent des courbes de fusion distinctes pour les différents génotypes. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'électrophorèse sur gel ou la PCR en volume est sa sensibilité aux variations d'un seul nucléotide, aux petites insertions, à toutes les délétions, et le fait que cette technique soit rapide et fiable. Bien que cette méthode puisse être utilisée pour génotyper rapidement et efficacement le poisson zèbre, elle peut également s'appliquer à d'autres systèmes et organismes modèles, notamment des lignées cellulaires, des souris et d'autres animaux.

Au jour de la préparation de l'ADN, ajouter de la protéinase K fraîche au tampon de lyse à une concentration de un milligramme par millilitre. Le tissu peut être prélevé sur un poisson adulte à l'aide d'une petite pince ou sur un poisson embryonnaire. Anesthésier d'abord le poisson dans une solution Trica.

Attendez que les mouvements des branchies ralentissent. Ensuite, placez le poisson sur une pile de compresses et, à l’aide d’un scalpel stérile, prélevez un petit morceau de la nageoire caudale d’environ deux à trois millimètres de long. Replacez rapidement le poisson dans un aquarium étiqueté contenant de l’eau fraîche pour sa récupération.

Prélevez le lambeau de nageoire à l’aide d’une pointe de pipette stérile et transférez-le dans un tube contenant 100 microlitres de tampon de lyse d’ADN. Veillez à étiqueter à la fois le réservoir de l’animal et le tube, puis incubez tous les tissus prélevés pendant au moins quatre heures et jusqu’à toute une nuit à 55 degrés Celsius. Après l’incubation, inactiver la protéine ACE K en chauffant les tubes à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Ces échantillons doivent être utilisés immédiatement pour la PCR, mais peuvent également être conservés à moins 20 degrés Celsius pendant jusqu'à trois mois. Réalisez la PCR dans une plaque de 96 ou 384 puits pour chaque réaction. Combinez au plus une microlitre d'ADN adulte avec quatre microlitres de light scanner.

Un mélange maître contenant la sonde fluorescente et les amorces à une concentration finale de cinq pico molaire chacune. Si l'ADN provient d'un embryon, utilisez jusqu'à trois microlitres. Recouvrez les réactions avec 30 microlitres d'huile minérale, puis fermez-les hermétiquement.

Ensuite, recouvrez la plaque PCR chargée avec un film adhésif optiquement transparent. Optimisez maintenant les conditions de cyclage PCR. Un ensemble de conditions typique commence par cinq minutes de temps de fusion.

Cela est suivi de 30 cycles de PCR avec des dénaturations de dix secondes, 25 secondes d'hybridation et 30 secondes d'élongation. La réaction doit se terminer par une dénaturation supplémentaire de 32e cycle, puis refroidir à 15 degrés Celsius. Analyser la plaque de PCR en la plaçant dans un système d'analyse de fusion dans le logiciel.

Configurez la température et créez un nouveau fichier de stockage des données. Définissez un sous-ensemble. Sélectionnez les puits contenant les échantillons dans le coin inférieur gauche de l'écran.

Sélectionnez l'onglet normalisé pour éliminer les variants fluorescents. Positionnez manuellement la double ligne parallèle dans les régions pré-fusion, de fusion et post-fusion, puis normalisez les signaux fluorescents pré-fusion et post-fusion de tous les échantillons à un et zéro respectivement. Ensuite, distinguez les génotypes en fonction de leur température de fusion en sélectionnant d'abord le regroupement.

Ensuite, sélectionnez « auto group » dans la liste de sélection standard. Dans la section de regroupement, choisissez « normal » ou « high » pour les profils de fusion présentant respectivement une transition unique ou des transitions multiples. Ces options se trouvent dans la liste de sélection de sensibilité située sous la section de regroupement.

Sélectionnez maintenant les groupes de calcul dans la section de regroupement, puis allez dans le menu Fichier et cliquez sur Enregistrer pour sauvegarder les résultats. Le protocole peut être réalisé en une seule journée ou réparti en étapes sur plusieurs jours. Lors de la réalisation de la PCR, les températures de fusion de l'amplicon dépendent de la taille et de la teneur en GC, mais des températures initiale et finale de 60 degrés Celsius et 95 degrés Celsius sont généralement adaptées une fois la courbe de fusion effectuée.

L'analyse des courbes de fusion fluorescentes nécessite généralement une normalisation de la variation des différentes courbes d'échantillons à l'aide de régions pré- et post-fusion comme références. Cela améliore la comparaison des résultats provenant d'échantillons différents, dans lesquels la variation de la fluorescence est liée à de légères variations expérimentales. Chaque paire de lignes de température destinée à la normalisation doit être placée à environ un degré Celsius d'intervalle.

Les données peuvent être représentées de deux manières : par un graphique montrant les profils de courbe de fusion, ou par un graphique montrant un tracé de différence soustractive par rapport à un échantillon de référence après analyse HRMA, permettant la détection de mutations ou de transgènes. Deux mutations différentes dans le gène EIF two B five sont indiquées par les courbes rouge et bleue. Ces échantillons mutants sont identifiés par leur différence significative dans la forme de leur courbe de fusion ou par un changement de fluorescence par rapport aux courbes types de type sauvage.

Cet exemple de quatre génotypes différents dans un seul prélèvement d'embryons illustre la puissance et la sensibilité de la méthode. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de huit heures. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment effectuer l'analyse de la courbe de dénaturation (HRMA) pour un criblage à grande échelle efficace des génotypes de zebrafish.