Méthodes pour augmenter la sensibilité de la haute résolution de fusion Single Nucleotide Polymorphism génotypage dans le paludisme

L'objectif général de l'expérience suivante de fusion à haute résolution est d'augmenter la sensibilité de détection des allèles mutants présents à de faibles concentrations dans des échantillons individuels. Cela est réalisé en premier lieu en préparant l'ADN extrait en diluant le témoin aux volumes et concentrations nécessaires. La deuxième étape consiste à préparer les tests avec des proportions asymétriques des amorces sens et antisens afin d'augmenter le produit du sonde sur le témoin.

Après avoir préparé les réactions, la température d'hybridation est fixée entre les températures de fusion de la sonde lorsqu'elle est liée au brin sauvage ou au brin muté. La dernière étape consiste à analyser les produits amplifiés sur la plateforme HRM appropriée. En fin de compte, le biais d'amplification de l'allèle muté et la PCR asymétrique basée sur une sonde permettent une détection plus sensible des mutations ponctuelles difficiles à identifier présentes à faible concentration dans les échantillons.

Cette sensibilité accrue est utile pour la surveillance des mutations dans les populations. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la fusion à haute résolution standard ou le génotypage tac man réside dans sa capacité à offrir une sensibilité accrue pour les allèles présents à de faibles concentrations, et permet également le génotypage de SNPs situés à proximité les uns des autres dans le génome. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la propagation de la résistance aux médicaments chez le parasite du paludisme.

Il peut également être appliqué à d'autres systèmes, comme la surveillance d'autres types de maladies infectieuses telles que le VIH, ou la détection de variants rares de cancer dans une population de cellules. La procédure sera démontrée par Caitlin Durphy, une technicienne de notre laboratoire.

Les gabarits pour la fusion à haute résolution, ou HRM, sont préparés à partir d'échantillons de plasmodium falciparum obtenus directement à partir du sang de patients participant à des études sur le terrain. Les échantillons peuvent être conservés sur papier filtre, sur des tests de détection rapide ou sous forme de culots de globules rouges ; ils peuvent également être adaptés en culture pour une croissance in vitro. Certains souches de laboratoire standards destinés à l'analyse peuvent être commandés auprès du centre de ressources pour les réactifs de recherche et de référence sur le paludisme. Les échantillons peuvent être extraits de sang total, de globules rouges ou de papier filtre, ou utilisés directement à partir de culots de globules rouges ou de cultures, pour une amplification directe à partir de culots de globules rouges.

Déterminez d'abord le taux de parasitémie des globules rouges par microscopie de frottis mince en suivant la procédure des Centers for Disease Control and Prevention. Les globules rouges présentant un taux de parasitémie supérieur à 0,5 % sont ensuite dilués au 1/400. Dans le tampon TE, trois microlitres de globules rouges dilués seront utilisés pour chaque réaction de cinq à dix microlitres, en raison de la variabilité inter-échantillons ; des contrôles positifs et négatifs doivent toujours être inclus dans les analyses HRM.

Préparez des dilutions de 10 picogrammes à 10 nanogrammes par microlitre de plasmide ou d'étalons dont les génotypes de snip ont été vérifiés par séquençage, en tant que témoins positifs. Utilisez de l'eau de qualité PCR comme témoin négatif sans matrice pour les réactions d'amplification. Commencez cette procédure en préparant des stocks de travail à 10 x des amorces et sondes.

Le même protocole s'applique aux essais utilisant des plaques de 96 puits, des plaques de 384 puits, des bandes de huit tubes ou des capillaires en verre. Toutefois, aux fins de cette démonstration, seules les plaques de 96 puits et les capillaires en verre seront utilisées. Ce tableau indique les concentrations recommandées de solutions mères à 10 x ainsi que les concentrations finales pour le génotypage HRM basé sur des sondes bloquées.

Préparez les mélanges de réaction pour chacun. Ajoutez un microlitre de chaque amorce avant et arrière et des sondes à concentration de travail 10 x. Quatre à cinq microlitres du mélange maître HRM, un microlitre de matrice et de l'eau de qualité PCR jusqu'à un volume total de réaction de 10 microlitres.

Procédez de la même manière pour chaque capillaire en verre. Recouvrez les plaques et les capillaires en verre. Utilisez des scellés optiques pour l'amplification sur plaque et des bouchons en plastique pour les systèmes basés sur des capillaires.

Veillez à ce que la couverture soit complète et que les plaques et les bouchons soient hermétiquement scellés et bien fixés pour éviter l'évaporation pendant l'amplification. Faites centrifuger les échantillons pour éliminer les bulles d'air.

Faire centrifuger les plaques dans une centrifugeuse de table pendant trois minutes à 1 800 ×g. Faire centrifuger les capillaires en verre dans une pico-centrifugeuse pendant 10 à 15 secondes. Placer la plaque de réaction et les capillaires en verre dans un thermocycleur et exécuter les protocoles d'amplification standard avec sonde bloquée ou MAAB. Après l'amplification par PCR, passer à l'analyse de fusion via l'interface logicielle du système.

Faites fondre la plaque de 40 degrés Celsius à 80 degrés Celsius afin de produire les pics de fusion de la sonde et de l'amplicon. La première étape de l'analyse de fusion sur le Light Cycler 480 consiste à normaliser à partir de la dérivée négative de la fluorescence normalisée par rapport à la température. Déplacez les barres de normalisation pour encadrer la région de fusion de la sonde.

La région de fusion de la sonde est la région de fusion à la température la plus basse des deux. Les barres de normalisation doivent se situer à la base des pics de fusion. Après la normalisation, sélectionnez « calculer les groupes » pour attribuer automatiquement les échantillons aux groupes si nécessaire, ou réaffectez manuellement les échantillons à des groupes spécifiques.

Sélectionnez les échantillons qui n'ont pas amplifié ou qui présentent des pics de fusion irréguliers. Puis allez à « nouvel appel » et sélectionnez négatif. Après avoir sélectionné tous les échantillons restants mal classés, allez à « nouvel appel », choisissez le regroupement approprié et cliquez sur appliquer le changement. Attribuez les génotypes pour chaque groupe en fonction des standards.

Après avoir confirmé que les groupes calculés sont corrects, sélectionnez « Modifier les noms des groupes » sous l'onglet de regroupement. Saisissez les génotypes des étalons dans la case de couleur correspondante. Par exemple, si l'étalon 3D seven possède un génotype C connu et se trouve dans le groupe un, alors tous les échantillons du groupe un ont le génotype C. Appuyez sur Résultats et les génotypes s'affichent à côté des échantillons.

Enfin, exportez les résultats sous forme d'un fichier TXT pour une analyse supplémentaire de la population d'échantillons. Une fois l'analyse terminée sur le thermocycleur 2.0, enregistrez les noms et les positions des échantillons dans les données d'échantillons. Avant de commencer l'analyse, étiquetez les témoins négatifs ainsi que les génotypes des standards de fusion. Lancez l'analyse de fusion en sélectionnant « Analyse », en choisissant « Génotypage » dans l'analyse de courbe de fusion, puis en appuyant sur OK.

Pour augmenter la sensibilité du regroupement automatique, sélectionnez tous les échantillons afin qu'ils s'affichent sur le tracé des courbes de fusion. Déplacez la barre de normalisation jusqu'à la limite supérieure des pics de fusion de la sonde. Vérifiez que les échantillons ont été correctement regroupés en sélectionnant individuellement chaque groupe sous le nom du groupe.

Exporter les génotypes de chaque échantillon en sélectionnant tous les échantillons, en copiant les données et en les collant dans une feuille de calcul. Le tracé de la dérivée négative de la fluorescence normalisée par rapport à la température est généralement la manière la plus simple de visualiser les pics de fusion et de déterminer les génotypes. Réglage de la fenêtre d'analyse sur une région de sonde uniquement permet une distinction claire des pics correspondant à des SNP spécifiques.

Les correspondances parfaites produisent des pics de fusion plus élevés, indiqués en rouge. Les désappariements de SNP présentent quant à eux des températures de fusion plus basses, indiquées en gris, lorsque les deux allèles sont présents dans un échantillon. L'analyse HRM basée sur la probabilité représente les deux allèles sous forme de deux courbes de pic, montrées en orange, dont les pics correspondent aux échantillons à allèle unique illustrés en rouge et en gris. Une réduction progressive de la température de fusion au cours de l'amplification entraîne un biais en faveur de l'allèle muté, représenté par le pic situé du côté gauche dans un échantillon polygénomique ou polyallélique.

Le biais d'amplification dû à cet allèle muté confère une sensibilité élevée à la technique HRM pour la détection d'allèles minoritaires présents à moins de 1 % dans des échantillons polygénomiques ou polyalléliques. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est essentiel de garder à l'esprit que la qualité de l'échantillon est primordiale. De légères variations des concentrations en tampon peuvent décaler les courbes de HRM.

L'utilisation de témoins est une méthode utile pour normaliser les résultats. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser la PCR asymétrique par sonde et le biais d'amplification de l'allèle muté afin de génotyper avec précision et sensibilité les SNP du paludisme à partir de divers types d'échantillons.