Méthodes pour augmenter la sensibilité de la haute résolution de fusion Single Nucleotide Polymorphism génotypage dans le paludisme

L’objectif global de l’expérience de fusion à haute résolution suivante est d’augmenter la sensibilité de détection des allèles mutants présents à de faibles concentrations avec des échantillons individuels. Pour ce faire, il faut d’abord préparer l’ADN extrait en diluant la matrice aux volumes et concentrations nécessaires. La deuxième étape consiste à préparer les dosages avec des proportions asymétriques de l’amorce avant et arrière pour augmenter le produit de la sonde matrice.

Après la préparation des réactions, la température de recuit est réglée entre les températures de fusion de la sonde lorsqu’elle est liée au type sauvage ou à la matrice mutante. La dernière étape consiste à analyser les produits amplifiés sur la plateforme de GRH appropriée. En fin de compte, le biais d’amplification des allèles mutants et la PCR asymétrique basée sur une sonde permettent une détection plus sensible de la mutation SNP difficile à de faibles concentrations présentes dans les échantillons.

Cette sensibilité accrue est utile pour la surveillance des mutations dans les populations. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la fusion standard à haute résolution ou le génotypage tac man, est qu’elle permet une sensibilité accrue pour les allèles présents à de faibles concentrations, et permet également le génotypage des SNP situés à proximité les uns des autres dans le génome. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la propagation de la résistance aux médicaments chez le parasite du paludisme.

Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que la surveillance d’autres types de maladies infectieuses telles que le VIH ou la détection de variantes rares du cancer dans une population de cellules. Caitlin Durphy fera la démonstration de la procédure. Un technicien de notre laboratoire.

Des modèles pour la fusion à haute résolution ou HRM sont préparés à partir d’échantillons de plasmodium falciparum obtenus directement à partir du sang de patients participant à des études sur le terrain. Les échantillons peuvent être stockés sur du papier filtre, sur des tests de détection rapide ou sous forme de granulés de globules rouges. Les échantillons peuvent également être cultivés pour être cultivés in vitro. Certaines souches de laboratoire standard pour l’analyse peuvent être commandées auprès du centre de recherche sur le paludisme et les échantillons de réactifs de référence peuvent être extraits de sang total, de globules rouges ou de papier filtre, ou utilisés directement à partir de globules rouges granulés ou de culture pour une amplification directe à partir de globules rouges granulés.

Déterminez d’abord le para des globules rouges à l’aide de la microscopie à frottis mince en suivant la procédure des Centers for Disease Control and Prevention. Les globules rouges dont le taux de paras est supérieur à 0,5 % sont ensuite dilués de un à 400. Dans TE, trois microlitres de globules rouges dilués seront utilisés pour chaque réaction de cinq à 10 microlitres en raison d’une variabilité, les contrôles positifs et négatifs doivent toujours être inclus dans les analyses HRM.

Préparez 10 picogrammes à 10 nanogrammes par dilutions d’un microlitre de plasmide ou d’étalons avec des génotypes de snip vérifiés en tant que trolls positifs. Utilisez de l’eau de qualité PCR comme contrôle négatif sans matrice pour les réactions d’amplification. Commencez cette procédure en préparant 10 x stocks de travail d’amorces et de sondes.

Le même protocole s’applique aux analyses utilisant des plaques de 96 puits, des plaques de 384 puits, des bandes de huit tubes ou des capillaires de verre. Mais pour les besoins de cette démonstration, seules des plaques à 96 puits et des capillaires en verre seront utilisés. Ce tableau indique les concentrations recommandées de 10 fois le stock de travail ainsi que les concentrations finales pour le génotypage HRM basé sur une sonde bloquée.

Préparez des mélanges réactionnels pour chacun. Eh bien, ajoutez un microlitre de chacune des 10 amorces et sondes avant et arrière de la matière de travail. Quatre à cinq microlitres du master HRM mélangent un microlitre d’eau de qualité PCR pour un volume de réaction total de 10 microlitres.

Faites de même pour chaque capillaire en verre. Couvrez les assiettes et les capillaires en verre. Utilisez des joints de plaque optiques pour l’amplification à base de plaques et des capuchons en plastique pour les systèmes capillaires.

Assurez-vous que la couverture est complète et que les plaques et les capuchons sont complètement scellés et sécurisés pour éviter l’évaporation. Pendant l’amplification. Faites tourner les échantillons pour éliminer les bulles d’air.

Faites tourner les plaques dans une centrifugeuse de table pendant trois minutes à 1 800 fois G.Faites tourner les capillaires en verre dans un pico fuge pendant 10 à 15 secondes. Placez la plaque de réaction et les capillaires en verre dans un thermocycleur exécutant des protocoles d’amplification standard à sonde bloquée ou MAAB. Après l’amplification par PCR, passez à l’analyse de fusion à partir de l’interface du logiciel du système.

Faites fondre la plaque de 40 à 80 degrés Celsius pour produire des pics de fusion de sonde et d’amplicon. La première étape de l’analyse de fusion sur le cycle léger quatre 80 est la normalisation à partir de la dérivée négative de la fluorescence normalisée par rapport à la vue de température. Déplacez les barres de normalisation pour entourer la zone de fusion de la sonde.

La région de fusion de la sonde est la température la plus basse des deux régions de fusion. Les barres de normalisation doivent se trouver à la base des pics de fusion. Après la normalisation, sélectionnez calculer les groupes pour attribuer automatiquement des échantillons à des groupes si nécessaire, réaffectez manuellement des échantillons à des groupes spécifiques.

Sélectionnez des échantillons qui n’ont pas amplifié ou qui ont des pics de fusion déchiquetés. Allez ensuite à un nouvel appel et sélectionnez négatif. Après avoir sélectionné les échantillons mal classés restants, passez à nouvel appel, sélectionnez le regroupement approprié et cliquez sur Appliquer le changement Attribuer des génotypes à chaque groupe en fonction des normes.

Après avoir vérifié que les groupes calculés sont corrects, sélectionnez Modifier les noms de groupe sous l’onglet Regroupement. Entrez les génotypes des normes dans la case colorée correspondante. Par exemple, si la norme 3D sept a un génotype C connu et se trouve dans le premier groupe, tous les échantillons du premier groupe ont des résultats de génotype C et les génotypes sont affichés à côté des échantillons.

Enfin, exportez les résultats sous forme de fichier TXT pour une analyse plus approfondie de la population de l’échantillon. Une fois l’essai terminé sur le light cycler 2.0, notez les noms et les positions des échantillons sous les données de l’échantillon Avant de commencer l’analyse, étiquetez les témoins négatifs et les génotypes des étalons de fusion. Commencez l’analyse de fusion en sélectionnant l’analyse, en choisissant le génotypage sous l’analyse de la courbe de fusion et le pressage. D’accord.

Pour augmenter la sensibilité du regroupement automatique, sélectionnez tous les échantillons de sorte que l’affichage dans le tracé des courbes de fusion. Faites glisser la barre de normalisation jusqu’à la limite supérieure des pics de fusion de la sonde. Vérifiez que les échantillons ont été correctement regroupés en sélectionnant individuellement chaque groupe sous le nom du groupe.

Exportez les génotypes de chaque échantillon en sélectionnant tous les échantillons, en copiant les données et en les collant dans une feuille de travail. Le tracé de la dérivée négative de la fluorescence normalisée par rapport à la température est généralement le moyen le plus simple de visualiser les pics de fusion et de déterminer les génotypes. Le réglage de la fenêtre d’analyse sur une seule région de sonde permet de différencier clairement les pics correspondant à des SNP spécifiques.

Des correspondances parfaites se traduisent par des pics de fusion plus élevés indiqués en rouge. Alors que les mésappariements SNP ont des températures de fusion plus basses indiquées en gris lorsque les deux allèles sont présents dans un échantillon. L’analyse HRM basée sur Prob représente les deux allèles sous la forme de deux courbes de pic indiquées en orange avec des pics qui correspondent à des échantillons d’allèles uniques indiqués en rouge et gris, la réduction progressive de la température d’ealing pendant l’amplification entraîne un biais vers l’allèle mutant représenté par le pic du côté gauche dans un échantillon polygénomique ou polyallélique.

Ce biais d’amplification des allèles mutants se traduit par une sensibilité HRM pour détecter les allèles mineurs présents à moins de 1 % dans les échantillons polygénomiques ou polyalléliques. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que la qualité de l’échantillon est essentielle. Des différences mineures dans les concentrations de tampon peuvent déplacer les courbes HRM.

L’utilisation de contrôles est un moyen utile de standardiser les résultats. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la PCR asymétrique basée sur les probs et le biais d’amplification des allèles mutants pour génotyper avec précision et sensibilité les SNP du paludisme à partir d’une variété de types d’échantillons.