Identification de séquences de localisation Plasmodesmal en protéines In Planta

L'objectif général de cette procédure est d'identifier le signal de localisation des plasmodesmes dans des protéines cibles. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant l'étude des connexions intercellulaires chez les plantes en identifiant les séquences critiques des signaux qui dirigent les protéines vers les plasmodesmes, facilitant ainsi le transport intercellulaire de molécules de grande taille. Le principal avantage de cette technique est que la procédure est fiable et peut être facilement adaptée à la découverte de séquences de signal de localisation aux plasmodesmes dans la plupart des protéines ciblant ces structures.

La démonstration vidéo de cette méthode est essentielle, car les étapes de plantation, de filtration et de préparation pour l'observation en microscopie confocale sont difficiles à apprendre par le biais de publications classiques sur papier. Planter des graines de Nicotiana benthamiana dans un sol humide et à forte densité. Pendant la croissance, les maintenir dans une chambre environnementale contrôlée à une température de 20 à 25 degrés Celsius et sous 16 heures de lumière par jour, correspondant à environ 75 micromoles de photons par mètre carré par seconde.

Une fois que le diamètre du u. fil atteint un demi-centimètre, transférez délicatement les semis dans des pots plus grands et poursuivez leur croissance dans la même chambre et dans les mêmes conditions. Maintenez les plantes jusqu'à ce qu'elles atteignent le stade de quatre à huit feuilles en quatre semaines.

À ce stade, les feuilles les plus grandes doivent avoir un diamètre de quatre à six centimètres. Pour une identification et une analyse faciles, choisissez un système d'expression et marquez fluorescentemment chaque protéine exprimée comme décrit dans le protocole de texte associé. Préparez un plasmide basé sur pPZP-RCS2 comme indiqué et ajoutez un microgramme de celui-ci dans une culture de 100 microlitres de cellules compétentes d’Agrobacterium tumefaciens.

Incuber les cellules sur de la glace pendant 30 minutes. Ensuite, congeler rapidement les cellules dans de l'azote liquide pendant une minute. Puis, réchauffer les cellules à 28 degrés Celsius pendant 15 minutes, puis ajouter un millilitre de milieu LB au mélange de cellules compétentes.

Après avoir ajouté le milieu LB, remettre les cellules à 28 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, centrifuger les cellules à 3 000 ×g pendant une minute. Resuspendre le culot cellulaire dans 0,2 millilitre de milieu LB et les ensemencer sur des boîtes de gélose LB contenant un antibiotique sélectif.

Faites croître les cellules sur les boîtes de Pétri à 28 degrés Celsius pendant 48 heures, jusqu'à ce que des colonies individuelles soient visibles. Ensuite, prélèvez et repiquez plusieurs colonies individuelles sur des boîtes de Pétri fraîches contenant de l'agar LB, puis faites croître les cellules à 28 degrés Celsius pendant 48 heures. Puis, prélevez une petite quantité de bactéries à partir de chaque boîte pour analyse, et utilisez la PCR sur colonies afin de confirmer la présence des constructions binaires spécifiques d'intérêt.

Ajouter chaque colonie d'agrobactérie contenant le construct d'intérêt à cinq millilitres de milieu LB supplémenté avec les antibiotiques appropriés. Faire croître les cellules toute la nuit à 28 degrés Celsius. Ensuite, centrifuger les cellules à 3 000 ×g. Résuspendre le culot à une DO600 de 0,5 dans du tampon d'agroinfiltration.

Incuber la suspension pendant deux heures à température ambiante, puis charger l'inoculum dans une seringue en plastique de un millilitre. En tenant une feuille complètement mature de N. benthamiana avec un doigt ganté sur la face adaxiale, appuyer l'embout de la seringue contre l'épiderme inférieur de la feuille. Ensuite, introduire lentement l'agrobactérie dans le milieu d'infiltration en injectant le milieu.

Conserver la plante infiltrée jusqu'au moment de l'observation. Utiliser une lame pour découper chaque feuille en fragments situés entre les nervures, 24 à 48 heures après l'infiltration. Placer les tranches de feuille sur la lame porte-objet avec la face abaxiale de la feuille tournée vers le haut.

Ensuite, déposez une goutte d'eau sur la tranche de feuille et recouvrez-la avec la lame de couverture. Immobilisez la lame de couverture à l'aide de petits morceaux de ruban adhésif placés de chaque côté. Placez une lame sous un microscope confocal à balayage laser et utilisez un objectif de 10X pour identifier les cellules présentant le meilleur signal.

Ensuite, utilisez un objectif à immersion de 63X pour enregistrer des images afin d'effectuer des observations plus détaillées. De plus, utilisez les fluorescences appropriées pour exciter les protéines fluorescentes exprimées. Conservez tous les paramètres utilisés pour l'acquisition d'images afin de maintenir une cohérence entre les expériences.

En moyenne, examiner 100 à 120 cellules pour chaque condition expérimentale. Diagnostiquer la localisation des protéines testées à l’aide des images obtenues par microscopie confocale. Ces images illustrent les profils caractéristiques de localisation périphérique ponctuée aux plasmodesmes observés pour la protéine de mouvement complète du TMV fusionnée à la molécule transportée CFP, pour le signal de localisation aux plasmodesmes identifié fusionné à CFP, ainsi que pour la protéine de localisation aux plasmodesmes coexprimée, PDCB1, fusionnée à DsRed.

Dans des conditions contrôlées, le ciblage des plasmodesmes par la protéine de mouvement complète du TMV fusionnée à la CFP et par le signal de localisation de la protéine de mouvement du TMV fusionné à la CFP apparaît comme illustré ici, avec une localisation sous-cellulaire de la CFP et une localisation nucléocytoplasmique du marqueur DsRed2. Lorsque le quatrième acide aminé, la valine, est muté en alanine, le ciblage des plasmodesmes par la protéine de mouvement complète du TMV ainsi que par le signal de localisation identifié dans la protéine de mouvement du TMV est perdu. Cela indique que ce résidu est important pour la structure ou la fonction du signal de localisation aux plasmodesmes.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 50 heures si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder les plantes en très bon état de santé et au stade foliaire approprié. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre non seulement comment identifier le signal de la protéine localisée dans les plasmodesmes, mais aussi savoir comment détecter d'autres signaux spécifiques dans les protéines végétales.