Identification de séquences de localisation Plasmodesmal en protéines In Planta

L’objectif global de cette procédure est d’identifier le signal de localisation des plasmodesmes dans les protéines cibles. La méthode peut aider à répondre à des questions clés lors de l’étude des connexions intercellulaires des plantes en identifiant la pensée critique dans les signaux qui dirigent les protéines vers les plasmodesmes, ce qui facilite à son tour le transport de cellule à cellule des grandes molécules moléculaires. Le principal avantage de cette technique est que la procédure est fiable et qu’elle peut être facilement adaptée à la découverte de séquences de signal de localisation des plasmodesmes dans la plupart des protéines ciblées sur les plasmodesmes.

La démonstration vidéo de cette méthode est essentielle car la plantation, la filtration et la préparation des étapes d’observation confocale sont difficiles à apprendre par une publication imprimée typique. Plantez les graines de Nicotiana benthamiana dans un sol humide et à haute densité. Pendant la croissance, conservez-les dans une chambre environnementale contrôlée à 20 à 25 degrés Celsius et sous 16 heures de lumière par jour, qui contient environ 75 micromoles de photons par mètre carré par seconde.

Une fois que le diamètre de l’u. fil atteint un demi-centimètre, transférez soigneusement les plants dans des pots plus grands et poursuivez leur croissance dans la même chambre dans les mêmes conditions. Maintenez les plantes jusqu’à ce qu’elles atteignent le stade de quatre à huit feuilles en quatre semaines.

À ce stade, les plus grandes feuilles doivent avoir un diamètre de quatre à six centimètres. Pour faciliter l’identification et l’analyse, choisissez un système d’expression et marquez par fluorescence chaque protéine exprimée comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Préparez un plasmide à base de pPZP-RCS2 comme décrit et ajoutez-en un microgramme dans une culture de 100 microlitres de cellules compétentes d’Agrobacterium tumefaciens.

Incuber les cellules sur de la glace pendant 30 minutes. Ensuite, congelez les cellules dans de l’azote liquide pendant une minute. Ensuite, réchauffez les cellules à 28 degrés Celsius pendant 15 minutes, puis ajoutez un millilitre de milieu LB au mélange de cellules approprié.

Après avoir ajouté le milieu LB, remettez les cellules à 28 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, faites tourner les cellules à 3 000 fois G pendant une minute. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 0,2 millilitre de milieu LB et placez-les sur des plaques de gélose LB sélectives d’antibiotiques.

Faites pousser les cellules sur les plaques à 28 degrés Celsius pendant 48 heures jusqu’à ce que les colonies individuelles soient visibles. Ensuite, choisissez et plaquez plusieurs colonies individuelles sur des plaques de gélose LB fraîches et faites pousser les cellules à 28 degrés Celsius pendant 48 heures. Ensuite, prélevez une petite quantité de bactéries de chaque plaque pour analyse et utilisez la PCR de colonie pour confirmer la présence des constructions binaires spécifiques d’intérêt.

Ajouter chaque colonie d’agrobactéries avec la construction d’intérêt à cinq millilitres de milieu LB complété par les antibiotiques appropriés. Faites pousser les cellules pendant la nuit à 28 degrés Celsius. Ensuite, centrifuger les cellules à 3 000 fois G.Remettre la pastille en suspension à une OD600 de 0,5 en tampon d’agro-infiltration.

Incuber la suspension pendant deux heures à température ambiante, puis charger l’inoculum dans une seringue en plastique d’un millilitre. En tenant une feuille de N. Benthamiana complètement mature avec un doigt ganté sur la face adaxiale, appuyez l’embout de la seringue contre l’épiderme inférieur de la feuille. Ensuite, introduisez lentement l’agrobactérie dans le milieu d’infiltration en injectant le milieu.

Maintenez la plante infiltrée jusqu’à ce qu’elle soit observée. À l’aide d’une lame, coupez chaque feuille en fragments entre les nervures 24 à 48 heures après l’infiltration. Placez les tranches de feuilles sur la lame de l’objet avec la surface abaxiale de la feuille vers le haut.

Ensuite, placez une goutte d’eau sur la tranche de feuille et couvrez-la avec le verre de protection. Immobilisez le verre de protection avec de petits morceaux de ruban adhésif de chaque côté. Transférez une lame sous un microscope confocal à balayage laser et utilisez une lentille subjective 10X pour identifier les cellules avec le meilleur signal.

Ensuite, utilisez un objectif subjectif 63X pour enregistrer des images afin d’effectuer des observations plus détaillées. De plus, utilisez les fluorescents appropriés pour exciter les protéines fluorescentes exprimées. Conservez tous les paramètres utilisés pour l’acquisition d’images afin de maintenir la cohérence entre les expériences.

En moyenne, examinez 100 à 120 cellules pour chaque condition expérimentale. Diagnostiquez la localisation des protéines testées à l’aide des images du microscope confocal. Ces images illustrent les modèles caractéristiques de localisation des plasmodesmes ponctués périphériques observés pour la protéine de mouvement TMV pleine longueur fusionnée à la molécule cargo CFP, et pour le signal de localisation des plasmodesmes identifié fusionné à CFP, ainsi que pour la protéine de localisation co-exprimée des plasmodesmes, PDCB1 fusionnée à DsRed.

Dans des conditions de contrôle, le ciblage des plasmodesmes de la protéine de mouvement du TMV pleine longueur fusionnée à CFP et le signal de localisation dans la protéine de mouvement du TMV fusionnée à CFP apparaissent comme illustré ici avec la localisation subcellulaire de CFP et la localisation nucléocytoplasmique du marqueur DsRed2. Lorsque le quatrième acide aminé, la valine, est muté en alanine, le ciblage des plasmodesmes à la fois par la protéine de mouvement du TMV sur toute la longueur et par le signal de localisation identifié dans la protéine de mouvement du TMV est perdu. Cela indique que ce résidu est important pour la localisation, la structure ou la fonction du signal des plasmodesmes.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être terminée en 50 heures si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’avoir les plantes en très bonne santé et que les plantes sont au bon stade foliaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension, non seulement de la façon d’identifier le signal de la protéine de localisation des plasmodesmes, mais aussi de savoir comment identifier d’autres signaux dans les protéines végétales.