Détermination de l’interaction tripartite entre deux monomères d’un facteur de transcription MADS-box et d’une protéine de capteur de calcium par essai BiFC-FRET-FLIM

L’étude des interactions protéine-protéine permet de comprendre la régulation de nombreux processus biologiques. Ici, nous démontrons une procédure décrite initialement par Y John shoe and co. Workers en 2007, où les auteurs ont utilisé BiFC en combinaison avec FRET pour valider l’interaction tripartite entre trois molécules de protéines.

Cependant, nous avons inclus des mesures de la durée de vie de la fluorescence dans cette procédure pour étayer les mesures FRET. Pour démontrer une interaction tripartite, nous avons choisi une protéine, qui est connue pour homodimériser. En outre, il a également été validé en interne pour interagir avec un capteur de calcium de protéine appelée protéine C dans ce protocole.

Les protéines MNC interagissent dans le cytoplasme. Dans cette technique, deux protéines sont marquées avec des protéines YFP fractionnées. Leur interaction se traduit par la restitution de YFP fonctionnels qui agissent comme un accepteur FRET au troisième partenaire en interaction, qui est étiqueté avec CFP agissant en tant que donneur FRET.

Commencez par l’amplification des séquences codantes des gènes d’intérêt qui sont des gènes M et C dans notre cas par PCR et clonez-les dans des vecteurs d’entrée appropriés. Valider les clones sélectionnés sur les plaques contenant des antibiotiques par digestion de restriction et séquençage de l’ADN. Mobilisez les CDS reconstitués des clones d’entrée vers les vecteurs de destination.

Tous les vecteurs utilisés dans cette expérience sont répertoriés dans le premier tableau. Enfin, transformez les cellules de l’agrobactérie GV3101 avec les vecteurs de destination par électroporation. Ici, nous cultivons des plantes Nicotiana Benthamiana encore quatre à six étapes de départ dans des conditions contrôlées dans une chambre de culture.

Préparez le mélange de sol en mélangeant de la soilrite, de la tourbe de coco et du compost dans un rapport de 2:1:1. Étalez une couche d’un pouce d’épaisseur de ce mélange dans un plateau en plastique pour faire le lit de sol et le saturer avec un peu d’eau. Saupoudrez environ 200 graines sur le sol et transférez-les dans un plateau plus grand qu’environ un centimètre d’eau stagnante.

Couvrez ce plateau avec une pellicule de plastique pour créer une chambre à humidité. Transférez ce plateau dans une chambre de culture fixée à 23 degrés centigrades avec un cycle de lumière de 16 heures et un cycle sombre de huit heures. Après deux semaines, transférez les jeunes plants dans de petits pots de trois à quatre pouces contenant un mélange de sol saturé d’eau.

Placez ces pots dans un plateau en plastique et transférez-les dans la chambre de culture pendant quatre semaines supplémentaires. Pour l’agroinfiltration, les souches bactériennes doivent être fraîchement sous-cultivées et mélangées avec la souche P19 d’agrobactérie dans des proportions appropriées. Commencez cette procédure en inoculant des souches d’agrobactéries GV3101 contenant des constructions BiFC et FRET à partir de plaques de stries dans 10 ml.

au bouillon contenant des antibiotiques appropriés. Parallèlement, initier également une culture de la souche P19 d’agrobactéries, qui est ajoutée pour empêcher le silence transgénique. Couvrez la fiole avec du papier d’aluminium et conservez-la dans un agitateur d’incubateur, réglez-la à 28 degrés centigrades à 170 tr / min pendant 16 heures.

Après la croissance pendant la nuit, transférer 1 ml de ces cultures dans une coudée jetable pour mesurer la densité optique à 600 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre. Mélanger les cultures de BiFC et fret appropriés contenant des souches contenant de sorte que la DO finale soit de 0,5 et celle de P19 soit de 0,3 dans un volume total de 2 ml.

Pour atteindre ces ratios, nous suivons la formule affichée à l’écran pour ces calculs. Centrifuger les cultures d’agrobactéries mélangées à 3000G pendant cinq minutes à température ambiante et jeter soigneusement le surnageant. Suspendre les granulés dans un 2 ml.

tampon d’infiltration. Vous devrez peut-être utiliser un mélangeur vortex pour suspendre complètement les cellules dans une suspension cellulaire homogène. Après cela, incubez les tubes à température ambiante dans l’obscurité pendant trois heures.

Pendant ce temps, étiquetez chaque pot de plante pour le mélange de construction avec lequel il va être infiltré. Remplissez une seringue sans aiguille de 1 ml avec le mélange agrobactérien.

Appuyez doucement mais fermement sur l’extrémité de la seringue sur le côté abaxial d’une feuille complètement dilatée tout en soutenant la feuille de l’autre côté. Poussez doucement le piston jusqu’à ce que la solution se remplisse dans la surface foliaire équivalente à deux à trois fois celle de la pointe de la seringue. Infiltrez le mélange bactérien jusqu’à quatre endroits sur une feuille et répétez cette procédure pendant trois à quatre feuilles pour un type d’infiltration.

Incluez également au moins deux plantes par construction pour l’infiltration. N’oubliez pas de vous essuyer les mains avec 70% d’alcool ou de changer vos gants pour éviter toute contamination croisée. Transférer tous les pots sur un plateau et incuber dans la chambre de croissance dans les mêmes conditions de croissance.

Vérifiez une petite partie de la feuille agroinfiltrée à l’aide d’un microscope à fluorescence. Lorsque la fluorescence du YFP et du CFP est détectable dans les cellules, passez au microscope confocal pour le test BiFC FRET-FLIM. Dans notre cas, cette analyse a été réalisée trois jours après l’agroinfiltration.

Maintenant que les plantes sont prêtes à être visualisées au microscope, coupez des échantillons de feuilles carrées de cinq à 8 mm de la pointe de la seringue et montez-les sur de l’eau distillée. Placez un couvercle propre sur celui-ci et scellez-le.

Visualisez ces échantillons dans un microscope confocal à balayage laser. Dans cette procédure, la base de la détermination et de la quantification de l’interaction entre deux protéines est la réduction de la durée de vie de fluorescence du partenaire donneur FRET lors de son interaction avec l’accepteur, qui est utilisée pour calculer l’efficacité de FRET. La complexité dans le cas d’une interaction tripartite augmente encore parce que l’accepteur FRET dans ce cas n’est pas une molécule unique, mais une paire YFP BiFC divisée, qui devrait d’abord être reconstituée in vivo pour devenir un fluorophore accepteur FRET fonctionnel.

Pour réaliser FRET-FLIM, nous devons déterminer la durée de vie de fluorescence des molécules donneuses, d’abord seul, puis en présence d’un partenaire FRET. Ouvrez l’application FLIM dans le microscope à balayage laser confocal, démarrez la console et utilisez le comptage de photons de reconnaissance de formes pour mesurer la durée de vie de la fluorescence. Sélectionnez le mode de mesure standard de comptage de tous les photons.

Nous prendrons deux types de plantes agroinfiltrées. L’un qui a le gène CCFP et l’autre qui a CCFP avec MYFP parce que l’interaction de la protéine M a déjà été validée avec la protéine C en utilisant BiFC et Y2H, nous nous attendons à une bonne efficacité FRET avec cette paire en interaction. Maintenant, nous scannons d’abord la feuille agroinfiltrée CCFP et recherchons une cellule montrant une bonne fluorescence CFP.

Les paramètres du microscope sont affichés à l’écran. L’échantillon est éclairé à une puissance laser suffisante pour atteindre environ 0,1 photon par impulsion. Pour les échantillons à intensité de fluorescence variable, nous capturerons 50 images pour collecter les photons adéquats nécessaires à la mesure de la durée de vie.

Comme la CFP est connue pour présenter deux durées de vie de fluorescence en raison de son adaptation confirmative, nous alimentons les données à l’aide d’un modèle de reconvolution exponentielle tout en maintenant la valeur de N égale à deux. À ces réglages, les deux durées de vie sont visibles à une et 3,2 nanosecondes. Nous utiliserons la durée de vie la plus élevée pour tous les calculs ultérieurs.

Nous sommes maintenant prêts à mesurer le FRET entre CCFP et MYFP. Pour cela, utilisons l’échantillon de feuilles de la plante agroinfiltrée avec CCFP et MYFP. Nous recherchons une cellule qui exprime à la fois CCFP et MYFP et confirmons leurs modèles d’émission respectifs en les excitant à l’aide d’un laser à impulsions de 40 nanomètres et d’un laser à lumière blanche de 514 nanomètres.

Après cela, nous passons à la console FLIM pour mesurer la durée de vie de CFP en utilisant les mêmes paramètres que nous avons utilisés précédemment pour mesurer la durée de vie de CCFP. Mais cette fois, la cellule exprime également myFP qui peut potentiellement interagir avec CCFP et provoquer une réduction de la durée de vie de CCFP. Comme nous avons lu le graphique obtenu en utilisant le modèle de reconvolution exponentielle N avec N égal à deux, il y a en fait une diminution de la durée de vie CFP de 3,2 à 2,6 nanosecondes.

Nous démarrons maintenant la console FRET dans le logiciel et calculons l’efficacité FRET en entrant manuellement une durée de vie incontestable dans l’équation fournie dans le logiciel et l’efficacité FRET observée est de 56%Passons maintenant à l’étape finale, c’est-à-dire visualiser l’interaction entre trois partenaires. Pour cela, nous prélevons l’échantillon de feuilles d’une plante qui a été co-infiltrée avec CCFP et MYFPN avec MYFPC. Nous scannons la plante foliaire à la recherche d’une cellule qui montre à la fois la CFP et la fluorescence YFP reconstituée émanant de l’interaction entre deux protéines M.

Nous utilisons le même laser et la même longueur d’onde d’émission que ceux utilisés précédemment. Par la suite, nous éteignons le laser de 514 nanomètres et passons à la console FLIM. Si le dimère MYFP interagit avec CCFP.

Nous devrions voir une réduction de la durée de vie du CCFP telle qu’observée lors de son interaction avec le MYFP. Cependant, si le CCFP n’interagit pas avec le dimère MYFP, sa durée de vie en fluorescence devrait rester observée à 3,2 nanosecondes. En utilisant les paramètres similaires mentionnés ci-dessus, nous mesurons la durée de vie de la PCP en présence de YFP reconstitué.

Nous ajustons le graphique à l’aide du modèle de reconvolution exponentielle N avec un égal à deux et passons à la console FRET. Et oui, il y a une baisse de la durée de vie de la PCP de 3,2 à 2,3 nanosecondes. Nous calculons l’efficacité FRET comme décrit ci-dessus.

L’efficacité FRET calculée est de 55% Ici, nous avons utilisé FLIM pour mesurer la durée de vie de fluorescence du partenaire donneur FRET en présence et en l’absence de l’accepteur FRET. Une réduction de la durée de vie de fluorescence du donneur était attendue s’il y avait une interaction positive entre les deux protéines. En cas de contrôle positif, il s’agit du CCFP et du MYFP.

Nous observons une réduction de la durée de vie de fluorescence du donneur de 3,3 à 2,5 nanosecondes et l’efficacité FRET était de 56%Un exercice similaire avec YFP reconstitué résultant de l’interaction entre deux amonomères et les protéines C a également entraîné une interaction FRET positive conduisant à la réduction de la durée de vie de fluorescence du donneur à 2,6 nanosecondes. L’efficacité FRET calculée était d’environ 55% dans ce cas. La réduction de la durée de vie de la fluorescence du donneur FRET fournit une preuve solide d’une interaction tripartite entre ces protéines.

Le protocole décrit ici est un outil puissant pour déterminer les interactions tripartites protéine-protéine dans les cellules vivantes. Cette procédure peut également aider à déterminer la localisation intracellulaire des complexes résultants, ce qui est important pour déchiffrer la fonction et la signification physiologique de tout complexe protéique. En conclusion, le test FRET-FLIM basé sur BiFC offre l’occasion d’étudier et de caractériser des aspects importants des interactions protéiques tripartites, ce qui peut être utile dans les études d’interaction protéine-protéine dans les systèmes animal et végétal.