Agroinfiltration efficace des plantes pour l'expression transitoire de haut niveau de protéines recombinantes

Ce système expérimental utilise l’agro-infiltration pour fournir efficacement des constructions génétiques aux feuilles afin de produire des niveaux élevés de protéines recombinantes. Tout d’abord, cultivez les plantes de hamana dans un environnement contrôlé pendant six semaines, trois jours avant l’infiltration. Préparer les cultures d’agrobactéries qui contiennent le gène cible à exprimer dans les plantes le jour de l’infiltration.

Introduire les cultures d’agrobactéries dans le tissu végétal par seringue ou par infiltration sous vide. Des résultats tels que l’intensité de la fluorescence verte de la GFP dans les feuilles de tabac sous la lumière UV démontrent une expression robuste des protéines recombinantes chez les plantes qui rivalise avec celle des systèmes d’expression actuels basés sur les mammifères, les bactéries et les insectes. L’agro-infiltration est un moyen efficace d’introduire des gènes trans dans les cellules végétales, ce qui conduit à une expression de haut niveau des protéines recombinantes.

Il peut être utilisé pour un large éventail d’espèces végétales. Plus important encore, il peut être mis à l’échelle pour la production commerciale de protéines pharmaceutiques. Ainsi, cette méthode peut fournir un aperçu de la cinétique et de l’expression de la GFP et peut être appliquée à d’autres protéines comme les vaccins sous-unitaires, les anticorps monoclonaux recombinants, et peut être utilisée dans les traitements du cancer et des maladies infectieuses.

Une expérience réussie nécessite des conditions optimales pour la culture de bactéries et le matériel végétal. Ce processus d’infiltration est plus facile à reproduire après démonstration visuelle. Commencez par placer jusqu’à 60 granulés de tourbe dans un plateau de propagation.

Ajoutez quatre litres d’eau du robinet et laissez les granulés de pois absorber l’eau pendant deux heures. Maintenant, ajoutez deux graines de hamana dans chaque granulé de tourbe et couvrez le plateau avec un dôme en plastique transparent pour la germination. Placez les graines dans un environnement à 25 degrés Celsius, 84 % d’humidité.

Deux semaines après l’ensemencement, retirez le dôme et transférez les plantes dans un nouveau plateau. Ajoutez ensuite deux litres de 1,48 gramme par litre. L’engrais de Jack Continuez à faire pousser les plantes à 25 degrés Celsius.

50 % d’humidité tous les deux jours. Fournissez deux litres d’engrais jack’s par plateau. À la quatrième semaine, transférez les plantes avec des granulés de tourbe dans un nouveau plateau qui accueille six plantes pour une croissance ultérieure jusqu’à l’âge de six semaines.

Choisissez des plantes de quatre à six semaines et des plantes hamama de cinq à six feuilles chacune pour une infiltration complète avec les souches agrobactériennes hébergeant les gènes d’intérêt. Une feuille pour le contrôle négatif et une feuille pour l’infiltration localisée. Créez une petite entaille avec une aiguille dans l’épiderme à l’arrière de la feuille, en veillant à ne pas percer la feuille des deux côtés.

Saisissez fermement la face avant de la première feuille tout en appliquant une légère contre-pression sur le cou. Avec le pouce d’une main. Injecter les mélanges d’agrobactéries en tampon d’infiltration dans le cou à l’aide d’une seringue, d’une aiguille.

Continuez à injecter les mélanges d’agrobactéries dans l’entaille jusqu’à ce que le cercle vert plus foncé cesse de s’étendre. Créez ensuite une autre entaille et répétez les injections jusqu’à ce que toute la feuille soit infiltrée et que toute la feuille devienne vert plus foncé. Les infiltrations complètes des trois premières feuilles et de la dernière feuille de la quatrième feuille de chaque plante s’infiltrent avec des combinaisons de vecteurs des quatre vecteurs viraux Gemini ou de trois vecteurs magcons.

De plus, faites une entaille pour chaque combinaison de souches d’agrobacterium et infiltrez chaque entaille avec une combinaison. Après l’infiltration, ramenez les plantes dans la salle de croissance et surveillez l’expression des protéines entre deux et 15 jours. Après l’infiltration, placez un bac dans un dessiccation sous vide et transférez-le dans trois litres de tampon d’infiltration contenant les souches d’agrobactéries.

Connectez ensuite la dessiccation à une pompe à vide à membrane de marque de vide. Placez maintenant une plante à l’envers sur la plaque de dessiccation et abaissez la plaque avec la plante jusqu’à ce que tout le système de feuilles et de tiges soit immergé dans le tampon d’infiltration avec la plaque reposant sur le dessus de la baignoire. Positionnez ensuite le joint torique desséché le long de la jante.

Après avoir placé le couvercle de dessiccation sur la chambre, allumez la pompe à vide et commencez à chronométrer lorsque le vide atteint 100 millibars. Après avoir éteint la pompe à vide, ouvrez lentement la soupape de décharge de la dessiccation après une minute à 100 millibars pour permettre l’entrée des agrobactéries dans les espaces interstitiels des tissus végétaux submergés. Répétez cette infiltration.

Étapes clés pour assurer une bonne infiltration. Retirez ensuite la plante de la dessiccation et remettez-la en position verticale. Ramenez les plantes dans la salle de croissance et surveillez l’expression des protéines entre deux et 15 jours après l’infiltration.

Pour démontrer l’efficacité de la seringue, l’infiltration d’agrobacterium dans les tissus végétaux, nous avons testé l’expression de deux protéines fluorescentes, GFP et Ds red par deux vecteurs viraux végétaux déconstruits différents, Gemini, viral et magcon pour fin. Des feuilles d’Hamana entièrement infiltrées par des agrobactéries contenant des vecteurs viraux Gemini. L’expression de la GFP a été observée sur toute la surface foliaire sous la lumière UV, dès 2D PI et a atteint son pic d’accumulation à quatre DPI.

En revanche, les feuilles infiltrées avec des combinaisons de vecteurs magcons contenant des agrobactéries n’ont montré une fluorescence GFP qu’après cinq DPI et ont atteint leur accumulation maximale à sept DPI. Aucune fluorescence verte n’a été observée sur les feuilles infiltrées avec des mélanges d’agrobactéries témoins négatives de EP un 10 plus P 19, indiquant que la fluorescence était spécifique du gène GFP et n’était pas le résultat de la fluorescence de fond des feuilles. À son accumulation maximale, la fluorescence du vecteur magcon exprimée à la GFP est plus intense que celle du vecteur viral Gemini.

Aucune nécrose majeure n’a été observée sur les feuilles infiltrées avec des constructions GFP lorsque les deux protéines fluorescentes ont été exprimées sur la même feuille via des vecteurs viraux Gemini avec une infiltration de tache de seringue, elles ont été détectées avec leur couleur fluorescente attendue à l’endroit où elles ont été infiltrées. Il est intéressant de noter que la co-infiltration de GFP et de DS RED a entraîné une fluorescence jaunâtre. L’infiltration sous vide a également été examinée pour développer une méthode d’agro-infiltration évolutive qui peut être utilisée pour la production à grande échelle de protéines recombinantes par des systèmes d’expression transitoire végétale.

Comme prévu, une fluorescence de la GFP a été observée pour toutes les feuilles de la plante infiltrée par rapport à l’infiltration à la seringue. Il est plus robuste et peut réaliser l’infiltration de chaque plante dans un délai beaucoup plus court. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 48 heures.

La plupart du temps, c’est pour la culture agrobactérienne car le temps d’infiltration réel n’est que de quelques minutes pour une efficacité optimale de l’agro-infiltration et une expression ciblée des protéines. Suivez le protocole. N’oubliez pas de contrôler les paramètres critiques, y compris les conditions de croissance des plantes, la concentration agrobactérienne, la pression du vide et la durée dans le domaine de la biotechnologie végétale.

Cette approche expérimentale peut être utilisée pour explorer le développement et la bioproduction de nouvelles protéines pharmaceutiques dans un large éventail d’espèces végétales. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon d’utiliser l’agro-infiltration pour fournir des constructions génétiques cibles dans la plante et pour permettre aux systèmes d’expression transitoire des plantes de produire des protéines recombinantes, rivalisant avec celles des cultures de cellules de bactéries et d’insectes de mammifères.