Agroinfiltration efficace des plantes pour l'expression transitoire de haut niveau de protéines recombinantes

Ce système expérimental utilise l'infiltration agro pour délivrer efficacement des constructions génétiques aux feuilles afin de produire des niveaux élevés de protéines recombinantes. Commencez par cultiver des plantes end hamana dans un environnement contrôlé pendant six semaines, trois jours avant l'infiltration. Préparez les cultures d'agrobactéries contenant le gène cible à exprimer dans les plantes le jour de l'infiltration.

Introduisez les cultures d'agrobactéries dans le tissu végétal par infiltration au moyen d'une seringue ou sous vide. Des résultats tels que l'intensité de la fluorescence verte de la GFP dans les feuilles de tabac sous lumière UV démontrent une expression robuste de protéines recombinantes chez les plantes, comparable à celle des systèmes d'expression actuels basés sur des mammifères, des bactéries ou des insectes. L'infiltration agro est une méthode efficace pour introduire des gènes transgéniques dans les cellules végétales, conduisant à une expression élevée de protéines recombinantes.

Il peut être utilisé pour un large éventail d'espèces végétales. Plus important encore, il peut être mis à l'échelle pour la production commerciale de protéines pharmaceutiques. Cette méthode permet donc d'obtenir des informations sur la cinétique et l'expression de la GFP et peut être appliquée à d'autres protéines telles que les vaccins unitaires, les anticorps monoclonaux recombinants, et peut être utilisée dans le traitement du cancer et des maladies infectieuses.

Une expérience réussie nécessite des conditions optimales tant pour la culture bactérienne que pour le matériel végétal. Ce processus d'infiltration est plus facile à reproduire après une démonstration visuelle. Commencez par placer jusqu'à 60 pastilles de tourbe dans un bac de propagation.

Ajoutez quatre litres d'eau du robinet et laissez les pastilles de pois absorber l'eau pendant deux heures. Ajoutez ensuite deux graines hamana dans chaque pastille de tourbe et recouvrez le plateau d'un dôme en plastique transparent pour la germination. Placez les graines dans un environnement à 25 degrés Celsius et 84 % d'humidité.

Deux semaines après le semis, retirez le dôme et transférez les plantes dans un nouveau bac. Ajoutez ensuite deux litres d'engrais Jack's à raison de 1,48 gramme par litre. Poursuivez la culture des plantes à 25 degrés Celsius.

Environnement à 50 % d'humidité tous les deux jours. Fournir deux litres d'engrais Jack par plateau. À la quatrième semaine, transférer les plantes avec des pastilles de tourbe vers un nouveau plateau accueillant six plantes pour une croissance supplémentaire jusqu'à l'âge de six semaines.

Sélectionnez quatre plants de Hamama âgés de six semaines et ayant chacun cinq à six feuilles : trois feuilles pour une infiltration complète avec les souches agrobactériennes portant les gènes d'intérêt, une feuille pour le témoin négatif et une feuille pour l'infiltration en points. Réalisez une petite entaille à l’aide d’une aiguille dans l’épiderme de la face inférieure de la feuille, en veillant à ne pas transpercer complètement la feuille des deux côtés.

Saisissez fermement la face avant de la première feuille tout en exerçant une pression contre la nuque. À l’aide du pouce d’une main, injectez les mélanges d’agrobactéries dans le tampon d’infiltration dans la nuque à l’aide d’une seringue et d’une aiguille.

Continuez à injecter les mélanges d'agrobactéries dans l'entaille jusqu'à ce que le cercle vert foncé cesse de s'étendre. Créez ensuite une nouvelle entaille et répétez les injections jusqu'à ce que toute la feuille soit infiltrée et que l'ensemble de la feuille devienne vert foncé. Infiltrez complètement les trois premières feuilles ainsi que la dernière feuille, qui servira de quatrième feuille pour chaque plante, avec des combinaisons de vecteurs soit constituées des quatre vecteurs viraux Gemini, soit des trois vecteurs magcon.

Aussi, effectuez une incision pour chaque combinaison de souches d'agrobactéries et inoculez chaque incision avec une combinaison. Après l'infiltration, remettez les plantes dans la chambre de croissance et surveillez l'expression protéique entre deux et quinze jours. Après l'infiltration, placez un bac dans un dessiccateur sous vide et transférez-y trois litres de tampon d'infiltration contenant les souches d'agrobactéries.

Ensuite, reliez le dessiccateur à une pompe à vide à membrane. Placez maintenant une plante à l’envers sur la plaque du dessiccateur et abaissez la plaque avec la plante jusqu’à ce que l’ensemble du système foliaire et caulinaire soit immergé dans le tampon d’infiltration, la plaque reposant sur le dessus du récipient. Positionnez ensuite la joint torique du dessiccateur le long du rebord.

Après avoir mis le couvercle du dessiccateur sur la chambre, enclenchez la pompe à vide et commencez le chronométrage lorsque le vide atteint 100 millibars. Après avoir éteint la pompe à vide, ouvrez lentement la vanne de décharge du dessiccateur après une minute à 100 millibars pour permettre l’entrée des bactéries agro dans les espaces interstitiels du tissu végétal immergé. Répétez cette infiltration.

Étapes préliminaires pour assurer une bonne infiltration. Retirez ensuite la plante du dessiccateur et remettez-la en position verticale. Replacez les plantes dans la chambre de croissance et surveillez l'expression protéique entre deux et quinze jours après l'infiltration.

Pour démontrer l'efficacité de l'infiltration par seringue d'agrobactéries dans le tissu végétal, nous avons testé l'expression de deux protéines fluorescentes, GFP et DsRed, à l'aide de deux vecteurs viraux végétaux déconstruits différents : Gemini viral et magcon pour end. Des feuilles de Hamana entièrement infiltrées avec des agrobactéries contenant les vecteurs viraux Gemini ont été utilisées. L'expression de GFP a été observée sur toute la surface foliaire sous lumière UV, dès 2 DPI, et a atteint un niveau d'accumulation maximal à 4 DPI.

En revanche, les feuilles infiltrées avec le vecteur magcon contenant des combinaisons d'agrobactéries ont montré une fluorescence GFP uniquement après cinq jours post-infiltration (DPI) et ont atteint leur accumulation maximale à sept DPI. Aucune fluorescence verte n’a été observée dans les feuilles infiltrées avec le mélange d’agrobactéries de contrôle négatif EP1 10 plus P19, indiquant que la fluorescence était spécifique au gène GFP et n’était pas due à une fluorescence de fond provenant des feuilles. Lors de son accumulation maximale, la fluorescence du vecteur magcon exprimant GFP est plus intense que celle du vecteur viral Gemini.

Aucune nécrose majeure n'a été observée sur les feuilles infiltrées avec des constructions GFP lorsque les deux protéines fluorescentes étaient exprimées sur la même feuille à l'aide de vecteurs viraux Gemini par infiltration locale à la seringue ; elles ont été détectées avec leur couleur fluorescente attendue au niveau du site d'infiltration. Fait intéressant, l'infiltration conjointe de GFP et de DS RED a produit une fluorescence jaunâtre. L'infiltration sous vide a également été testée afin de développer une méthode d'agro-infiltration échelonnée pouvant être utilisée pour la production à grande échelle de protéines recombinantes par des systèmes d'expression transitoire chez les plantes.

Comme prévu, une fluorescence GFP a été observée pour toutes les feuilles de la plante infiltrée par rapport à l'infiltration à la seringue. Cette méthode est plus robuste et permet d'effectuer l'infiltration de chaque plante en un délai nettement plus court. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 48 heures.

La plupart du temps, cela concerne la culture agrobactérienne, car la durée réelle d'infiltration ne dure que quelques minutes. Pour une efficacité optimale de l'infiltration agrobactérienne et une expression ciblée des protéines, suivez le protocole. Veillez à maîtriser les paramètres critiques, notamment les conditions de croissance des plantes, la concentration en agrobactéries, la pression et la durée du vide. Dans le domaine de la biotechnologie végétale.

Cette approche expérimentale peut être utilisée pour explorer le développement et la bioproduction de protéines pharmaceutiques novatrices dans un large éventail d'espèces végétales. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière d'utiliser l'infiltration agro-induite pour introduire des constructions génétiques cibles dans la plante et permettre aux systèmes d'expression transitoire végétale de produire des protéines recombinantes, rivalisant ainsi avec les cultures cellulaires bactériennes, insectes et mammaliennes.