Name: Une méthode améliorée pour la mesure précise et rapide des performances de vol en Drosophila (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Découvrez une méthode améliorée pour mesurer rapidement les performances de vol chez Drosophila. Cette technique de haut débit permet d'évaluer les mutations et les conditions comme le vieillissement ou la neurodégénérescence.

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Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé accorde F32 NS078958 (DTB) et R01 AG033620 (BG).

Une. Assembler Vol testeur <ol><li> Vol sécurisé cylindre Ring Stand 1 aide de colliers de chaîne. (Laissez environ 3 cm en dessous du cylindre pour peser plat.) (Note: Le cylindre de vol, nous utilisons est de 90 cm de long avec un diamètre de 13,5 cm.) </li><li> Insérez peser plat avec une fine couche d&#39;huile minérale sous le cylindre de vol. </li><li> Entonnoir sécurisé Ring Support 2 en utilisant un collier de serrage et griffe pince. Ajuster la hauteur de l&#39;entonnoir de sorte que le fond de l&#39;entonnoir est de niveau avec la partie supérieure du cylindre de vol. (Note: le diamètre de l&#39;entonnoir d&#39;extrémité doit être inférieur au diamètre externe de flacons placés dans les tubes de descente de façon que les flacons ne tombent pas à travers.) </li><li> Insérer le tube de chute dans la partie supérieure de l&#39;entonnoir et le fixer à l&#39;aide d&#39;une pince à griffes. (Note: Nous utilisons un tube de descente qui est de 25 cm de long goutte volent contenant des flacons de cette hauteur permet éjection cohérente de toutes les mouches avec force uniforme Le diamètre intérieur du tube de chute devrait être sligh..TLY plus grand que le diamètre extérieur de la cuvette pour permettre à la fiole de tomber librement.) </li><li> Couper feuille (s) de polyacrylamide à la bonne taille. (Remarque: Pour aider à l&#39;insertion et le retrait de la feuille, dont la largeur doit être légèrement plus petite que la circonférence intérieure du cylindre de vol). </li><li> Appliquez une fine couche de Tangle-Trap à la feuille. Laisser reposer pendant 1 heure avant de l&#39;utiliser. (Remarque: Laissez suffisamment d&#39;espace en haut et en bas de la feuille (environ 3 cm) non couché à saisir la feuille pour l&#39;insertion / retrait.) </li><li> Insérer la feuille de polyacrylamide dans le cylindre de vol. </li><li> Assembler les rails de la caméra avec supports de pin. (Remarque: veiller à ce que le bas de la piste peut soutenir la caméra sans blocage de la lentille Reportez-vous à la figure 1B..) </li><li> Ajouter bouchons et visser en place. (Remarque: place les bouchons dans des endroits qui permettront à l&#39;appareil photo pour voir la feuille de plastique toute en mode panoramique.) </li></ol> 2. Exécutez l&#39;expérience <ol> &lt;li&gt; Récupérer flacons de mouches à tester. Pour de meilleurs résultats, ne pas utiliser plus de 20 mouches / flacon. </li><li> Tapoter doucement vol à bas de flacon, débrancher, puis insérez dans le tube de chute et libérer flacon. (Note: Le flacon tombe vers le bas du tube de descente jusqu&#39;à ce qu&#39;il frappe l&#39;ouverture étroite de l&#39;entonnoir Lorsque le flacon frappe l&#39;entonnoir, les mouches sont éjectées dans le cylindre de vol.). </li><li> Soulevez le tube de descente pour enlever le flacon vide. (Remarque: les flacons multiples de mouches du même groupe de test peuvent être analysés sur une feuille de polyacrylamide unique Nous constatons que jusqu&#39;à 200 mouches (10 flacons de 20 mouches chacun) peuvent être testées et imagées facilement sur une seule feuille.. </li><li> Retirer la feuille de plastique et placez-le sur une surface plate et blanche. (Remarque: carton blanc peut être utilisé si les paillasses sont de couleur foncée.) </li><li> Assembler les rails de la caméra sur la feuille de plastique. La caméra doit être suffisamment élevée au-dessus de la feuille pour avoir à la fois le haut et le bas de la feuille dans le champ de vision. </li><li> Faites glisser la caméra le long ee piste tout en maintenant la touche &quot;capture&quot; d&#39;acquérir une image panoramique. </li><li> Le nombre de mouches atterrissent dans l&#39;huile peut être compté manuellement pour chaque essai. </li><li> Répétez les étapes 02.02 à 02.07 pour toutes les conditions d&#39;une expérience donnée. Les mouches peuvent être retirées de la feuille entre chaque essai. Sinon, plusieurs feuilles peuvent être utilisées, avec une nouvelle feuille pour chaque essai. </li></ol> 3. Collecte de données <ol><li> Ouvrez des fichiers image en utilisant le logiciel ImageJ. </li><li> les images des cultures, si nécessaire d&#39;inclure uniquement la surface d&#39;atterrissage. (Il s&#39;agit de la zone revêtue dans Tangle-Trap.) </li><li> Convertir des images en 8 bits en niveaux de gris. </li><li> Créer un «seuil» pour filtrer le fond blanc. (Image → Ajuster → Seuil). </li><li> Définissez les paramètres pour identifier chaque volée en utilisant le menu &quot;analyser des particules&quot;. (Analyser → analyser des particules) Définir les paramètres utilisés pour identifier une particule. Avec notre mis en place, nous constatons que l&#39;aide d&#39;unzone de 5-90 pixels 2 et une circularité de 0,4-1,0 permettra d&#39;identifier avec précision tous les échantillons. </li><li> Mesurer l&#39;emplacement de chaque volée en utilisant la liste générée de coordonnées pour chaque particule. Les coordonnées x en pixels peuvent être converties en centimètres pour calculer la hauteur d&#39;atterrissage. </li><li> Importer la table dans un tableur (comme Microsoft Excel). </li></ol>

<ol><li>Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Am%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of behavior.</a> Sci. Am. 229, 24-37 (1973).</li>
<li>Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+locomotor%2C+learning%2C+and+memory+deficits+in+Drosophila+models+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration.</a> J. Vis. Exp. , e2504(2011).</li>
<li>de Vries, S. E., Clandinin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+Stimulation+of+Escape+Behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster.</a> J. Vis. Exp. , e50192(2013).</li>
<li>Mundiyanapurath, S., Certel, S., Kravitz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+aggression+in+Drosophila+%28fruit+flies%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Studying aggression in Drosophila (fruit flies).</a> J. Vis. Exp. , e155(2007).</li>
<li>Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assay+Drosophila+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Methods to assay Drosophila behavior.</a> J. Vis. Exp. , e3795(2012).</li>
<li>Shiraiwa, T., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proboscis+extension+response+%28PER%29+assay+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. , e193(2007).</li>
<li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flightless+flies%3A+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li>
<li>Atkinson, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+separation+of+two+behavioral+phenotypes+by+a+mutation+affecting+the+promoters+of+a+Ca-activated+K+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular separation of two behavioral phenotypes by a mutation affecting the promoters of a Ca-activated K channel.</a> J. Neurosci. 20, 2988-2993 (2000).</li>
<li>Atkinson, N. S., Robertson, G. A., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+component+of+calcium-activated+potassium+channels+encoded+by+the+Drosophila+slo+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A component of calcium-activated potassium channels encoded by the Drosophila slo locus.</a> Science. 253, 551-555 (1991).</li>
<li>Elkins, T., Ganetzky, B., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+mutation+that+eliminates+a+calcium-dependent+potassium+current%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Drosophila mutation that eliminates a calcium-dependent potassium current.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 8415-8419 (1986).</li>
<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li>
<li>Fry, S. N., Rohrseitz, N., Straw, A. D., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+control+of+flight+speed+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Visual control of flight speed in Drosophila melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 212, 1120-1130 (2009).</li>
<li>Mronz, M., Lehmann, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+free-flight+response+of+Drosophila+to+motion+of+the+visual+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">The free-flight response of Drosophila to motion of the visual environment.</a> J. Exp. Biol. 211, 2026-2045 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêt à divulguer.

En utilisant les méthodes décrites ici, nous avons été en mesure d&#39;évaluer rapidement les performances de vol d&#39;un grand nombre de mutants de drosophile, offrant une plus grande efficacité qu&#39;auparavant. Pour nos expériences, nous nous séparons systématiquement hommes et les femmes et les élever à faible densité (moins de 20 mouches / flacon) pour limiter l&#39;agression qui pourrait endommager les ailes. Une autre considération importante est de bien contrôler les différences de performances de vol...

Drosophila a longtemps été utilisée pour étudier la base génétique du comportement 1, et les chercheurs ont mis au point un certain nombre de façons d&#39;analyser différents types de comportements 2-6. Les mouches ont été particulièrement utiles pour fournir des modèles utiles de troubles neuromusculaires 7. Un test couramment utilisé pour étudier le comportement locomoteur des performances de vol. Le testeur de vol initial est utile pour identifier les ponts mutants défectueux et pour l&#39;évaluation quantitative de la capacité de vol 1, mais il a plusieurs inconvénients qui limitent son application pour les écrans à haut débit: l&#39;utilisation de bouteilles enduites d&#39;huile est salissant et fastidieux, certaines fonctionnalités telles que la longueur du cylindre et l&#39;introduction des mouches dans le tube avec une force variable de réduire la précision quantitative, et il est difficile de récupérer vol direct à partir de l&#39;appareil d&#39;essai. Pour surmonter ces limitations, nous avons modifié le testeur de vol pour inclure un certain nombre d&#39;améliorations. Nous avons ajouté un &quot;drop tuêtre &quot;d&#39;introduire mouches pour éliminer la variabilité entre les expériences et les utilisateurs. Nous utilisons des feuilles d&#39;acrylique amovibles recouvertes d&#39;un adhésif qui permet de faciliter le nettoyage et la récupération de vol individuels. Nous avons augmenté la longueur du tube de vol d&#39;améliorer la précision quantitative et de fiabilité. Enfin , nous utilisons un appareil photo numérique et des logiciels d&#39;imagerie pour calculer les hauteurs d&#39;atterrissage de vol. Nous croyons que ces améliorations seront utiles à tous les laboratoires intéressés à mener des écrans génétiques à grande échelle pour les défauts de performances de vol.

<table><tbody><tr><td>Couteau à mastic</td><td>Home Depot</td><td>630147</td><td><a href="http://www.homedepot.com">www.homedepot.com</a></td></tr><tr><td>Moulure à bande arrière en pin (2x)</td><td>Home Depot</td><td>156469</td><td><a href="http://www.homedepot.com">www.homedepot.com</a></td></tr><tr><td>Planche de fourrure</td><td>Home Depot</td><td>164704</td><td><a href="http://www.homedepot.com"> www.homedepot.com</a></td></tr><tr><td>Tangle-Trap Insect Trap Coating BioControl</td><td>Network</td><td>268941</td><td><a href="http://www.biconet.com">www.biconet.com</a></td></tr><tr><td>Ordinateur portable&nbsp ;</td><td>Apple</td><td></td><td><a href="http://www.apple.com/mac/">www.apple.com/mac/</a></td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26291</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Panneau d’affichage blanc</td><td>Staples</td><td>247403</td><td><a href="http://www.staples.com">www.staples.com</a></td></tr><tr><td>Plat de pesée en polystyrène</td><td>Fisher Scientific</td><td>S67091A</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td></tr><tr><td>Appareil photo numérique</td><td>Sony</td><td>DSC-TX7</td><td><a href="http://www.store.sony.com">www.store.sony.com</a> </td></tr><tr><td>Pince fine</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td><a href="http://www.finescience.com">www.finescience.com</a></td></tr><tr><td>Cylindre en polycarbonate (tube de descente)</td><td>McMaster-Carr</td><td>8585K62</td><td><a href="http://www.mcmaster.com">www.mcmaster.com</a></td></tr><tr><td>Cylindre de vol (acrylique)</td><td>McMaster-Carr</td><td>8486K943</td><td><a href="http:// www.mcmaster.com">www.mcmaster.com</a></td></tr><tr><td>Feuilles polycarbonate</td><td>McMaster-Carr</td><td>85585K25</td><td><a href="http://www.mcmaster.com">www.mcmaster.com</a></td></tr><tr><td>support d’anneau (2x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47808</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Support d’anneau</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47791</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Pinces d’extension à trois broches (x2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-769-7Q</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Entonnoir</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-3</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com</a></td></tr> <tr><td>pinces de chaîne (2x)</td><td>VWR</td><td>21573-275</td><td><a href="http://www.vwr.com">www.vwr.com</a></td></tr><tr><td>Flacons en verre</td><td>VWR</td><td>66020-198</td><td><a href="http://www.vwr.com/">www.vwr.com</a></td></tr></tbody></table>

une méthode améliorée pour la mesure précise et rapide des performances de vol en<em&gt; drosophila</em

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila s&#39;est avéré être un système de modèle utile pour l&#39;analyse du comportement, y compris le vol. Le testeur de vol chute impliqué initiale vole dans une huile revêtu graduée; hauteur d&#39;atterrissage a permis de mesurer les performances de vol en évaluant comment les mouches loin tomberont avant de produire une poussée suffisante pour prendre contact avec la paroi du cylindre. Nous décrivons ici une version mise à jour de l&#39;appareil de contrôle de vol avec quatre améliorations majeures. Tout d&#39;abord, nous avons ajouté un &quot;tube de descente&quot; de veiller à ce que toutes les mouches entrent dans le cylindre de vol à une vitesse similaire entre les essais, ce qui élimine la variabilité entre les utilisateurs. Deuxièmement, nous avons remplacé le revêtement de l&#39;huile de feuilles de plastique amovibles revêtus de Tangle-Trap, un adhésif conçu pour capturer des insectes vivants. Troisièmement, nous utilisons un cylindre plus de permettre la discrimination plus précise de la capacité de vol. Quatrième nous utilisons un appareil photo numérique et des logiciels d&#39;imagerie pour automatiser la notation des performances de vol. Ces améliorations permettent de rapIdentifiant, l&#39;évaluation quantitative du comportement de vol, utile pour les grands ensembles de données et les écrans génétiques à grande échelle.

<html> La figure 1A montre un schéma de l&#39;ensemble de testeur de vol mis à jour. Figure 1B illustre la conception de la voie permettre à l&#39;appareil de prendre une image panoramique sans bloquer le champ de vision. Les résultats représentatifs sont présentés dans la figure 2, où les performances de vol de mouches mutantes slowpoke, qui ont un vol défaut 8-10 connu, sont comparées au type sauvage Canton-S vole. Contrôle vole toujours at...

Nous décrivons ici une méthode de mesure rapide et précise des performances de vol chez la drosophile, permettant le criblage à haut débit.

Une méthode améliorée pour la mesure précise et rapide des performances de vol en<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer rapidement et précisément la performance de vol chez Drosophila. Cela est réalisé en faisant d'abord tomber les mouches dans un cylindre de vol. La deuxième étape de la procédure consiste à imager la surface d'atterrissage à l'aide d'un appareil photo numérique.La dernière étape consiste à analyser les données à l’aide d’un logiciel d’imagerie en mesurant la hauteur d’atterrissage de chaque mouche. En définitive, cette procédure permet d’identifier des mutations et des conditions telles que le vieillissement ou la neurodégénérescence, qui altèrent la capacité de vol, et aide à quantifier la performance de vol. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le testeur de vol original, est qu’elle convient mieux aux écrans à haut débit destinés à détecter des mutants et d’autres conditions affectant le vol.Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque nous avons pris conscience du temps nécessaire pour tester un grand nombre de génotypes à l'aide du dispositif de vol d'origine. Fixer le cylindre de vol sur un support annulaire à l'aide de pinces à chaîne. Laisser environ tr

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Suivi vidéo haute résolution de la locomotion chez les adultes Drosophila melanogaster

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