Mesure longitudinale de la matrice extracellulaire rigidité de tumeur modèles 3D utilisant Microrhéologie de particules de suivi

L’objectif général de cette procédure est de mesurer les changements longitudinaux des propriétés mécaniques de la matrice extracellulaire dans des modèles de cancer tridimensionnels. Ceci est accompli en récoltant d’abord les cellules cancéreuses et en cultivant le stéroïde tumoral par une méthode appropriée jusqu’à ce qu’elles aient atteint la taille souhaitée. La deuxième étape consiste à intégrer le stéroïde tumoral dans le collagène ou une autre matrice extracellulaire appropriée.

Ensuite, la grille de points d’échantillonnage est construite et une vidéo est prise à chaque point. La dernière étape consiste à analyser les données vidéo, puis à calculer et co-enregistrer les propriétés logiques réelles à chaque point spatial. En fin de compte, ce protocole utilise l’analyse des trajectoires des sondes de traçage pour quantifier longitudinalement les changements spatiaux de la mécanique de la matrice extracellulaire de manière non destructive.

L’idée est qu’en réunissant des mesures basées sur l’imagerie de la radiologie de la matrice extracellulaire avec des modèles tumoraux 3D in vitro, qui restaurent les interactions de la matrice extracellulaire, cette approche peut fournir un aperçu quantitatif des changements dépendants du temps dans le microenvironnement mécanique qui accompagnent les processus d’invasion de la croissance tumorale et la réponse au traitement. La méthode présentée dans cette vidéo adopte une approche de superposition aros pour générer des OID 3D non adhérents à partir de la première pancarte de la lignée cellulaire du cancer du pancréas établie. Pour commencer, mélangez 10 millilitres d’eau de qualité culture cellulaire avec 0,1 gramme d’aros pour obtenir une solution à 1 % d’aros.

Chauffez la solution d’aros à plus de 70 degrés Celsius avant Ali. En citant 40 microlitres de la solution dans chaque puits d’une plaque de 96 puits, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant une heure, récoltez les cellules cancéreuses via la trypsine et préparez une suspension cellulaire unique avant de diluer la suspension cellulaire à 1000 cellules par millilitre. Ajoutez 100 microlitres de cette dilution dans le puits contenant le lit d’aros durci.

Placez l’échantillon sur un agitateur pendant la nuit dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 après l’incubation. Retirez l’échantillon de l’agitateur et ajoutez-y 100 microlitres de milieu de culture cellulaire, procédez à l’incubation du stéroïde résultant jusqu’à ce que le diamètre souhaité soit atteint. Par exemple, après neuf jours, une casserole, un stéroïde aura un diamètre d’environ 450 microns.

Pour commencer, préparez un poste de travail à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire avec deux flacons de deux millilitres. Le premier flacon contiendra le stéroïde tumoral et le deuxième flacon sera un contrôle acellulaire. Préparez un mélange dilué de sondes traceurs fluorescentes d’un diamètre modifié au carboxylate en ajoutant deux parties de sondes mères à 25 parties d’eau stérile.

Sortez une bouteille de 3,1 milligrammes par millilitre de collagène bovin du réfrigérateur et placez-la sur de la glace aliquote 125 microlitres de collagène, suivie de 50 microlitres de solution de sonde de traceur diluée dans un flacon un vortex brièvement pour répartir brièvement les sondes. Ajoutez ensuite 235 microlitres de milieu de culture cellulaire approprié contenant du rouge de phénol pour un volume total de 410 microlitres et tourbillonnez brièvement avant de retirer 205 microlitres et de le placer dans le deuxième flacon. Ensuite, ajoutez environ deux microlitres d’hydroxyde de sodium molaire dans le flacon.

Un pour ramener la solution à pH neutre vortex brièvement pour mélanger. Remettez ensuite immédiatement dans le support à glace afin que le mélange ne commence pas à durcir. Retirez délicatement 40 microlitres de milieu du puits contenant le stéroïde tumoral.

Conservez ces 40 microlitres pendant la réalisation de l’étape suivante. Vérifiez le puits pour voir si le stéroïde a été retiré à l’étape précédente. Si ce n’est pas le cas, remettez les 40 microlitres dans le puits et répétez l’étape précédente.

Si c’était le cas, ajoutez les 40 microlitres contenant le stéroïde dans le flacon. Un flacon de mélange doux avant de transférer le mélange en portions de 60 microlitres dans trois puits séparés d’une plaque de 96 puits, inspectez chaque puits avec un microscope après avoir ajouté le mélange pour déterminer quel puits contient le stéroïde. Ajoutez ensuite environ deux microlitres d’hydroxyde de sodium molaire et 40 microlitres de milieu de culture cellulaire dans le deuxième flacon et vortex avant Ali.

Citer 60 microlitres de ce mélange à un puits vide dans la plaque à 96 puits et l’étiqueter comme un contrôle acellulaire. Placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pour qu’elle durcisse pendant au moins une heure afin de construire une grille de points d’échantillonnage. Tout d’abord, transférez la plaque d’échantillon de l’incubateur à la platine du microscope.

Attendez 10 minutes pour que l’échantillon s’équilibre à la température ambiante si une platine chauffée n’est pas disponible. Observez l’échantillon à l’aide d’objectifs de faible puissance pour vous assurer qu’il est intact et prêt pour l’imagerie. Déterminez la position de la tumeur dans le puits et documentez-la avec une image en lumière transmise pour un co-enregistrement spatial ultérieur.

Typiquement, 20 points d’échantillonnage dans chaque puits répartis en anneaux concentriques autour du sphéroïde S produiront des résultats suffisamment détaillés. Déplacez la platine dans la position souhaitée et utilisez un logiciel d’interface de microscope pour enregistrer les coordonnées XNY. Passez le microscope à une lentille d’objectif haute puissance et sélectionnez le cube de filtre approprié pour la longueur d’onde x citation des sondes de traçage.

À l’aide de la liste des points créés, passez au premier point de la grille. Ajustez la mise au point pour trouver le fond du puits avant de remonter. Trouver un champ de vision contenant plusieurs sondes de traçage mises au point.

Observez l’histogramme d’intensité et ajustez l’intensité et le temps d’exposition pour obtenir la plus grande plage dynamique possible tout en veillant à ce que l’image ne soit pas saturée. Obtenez une séquence vidéo à une fréquence d’images de 20 à 30 millisecondes par image et enregistrez-la avec une convention de dénomination appropriée. Pendant l’enregistrement, ne touchez pas le microscope ou la table.

Répétez l’enregistrement pour chaque point d’échantillonnage de la grille. Ensuite, répétez le processus pour construire une grille pour chaque puits de l’expérience et répétez tout le processus pour chaque fois. Point sur la durée du suivi longitudinal.

Pour commencer l’analyse des données. Copiez toutes les données vidéo dans un dossier d’analyse. Importez des données d’image dans MATLAB ou un autre logiciel d’analyse.

Calibrez le logiciel en analysant plusieurs images de la vidéo afin de déterminer correctement les paramètres de sélection et de rejet permettant d’identifier les positions du centre de la sonde. Ensuite, utilisez le logiciel pour déterminer automatiquement chaque position de sonde pour toutes les images vidéo, puis reliez ces positions en trajectoires. Utilisez les données de trajectoire pour calculer le déplacement carré moyen, ou TMS, en fonction du temps de latence, en vous assurant d’appliquer le facteur d’étalonnage spatial approprié pour l’objectif spécifique ou pour n’importe quel pliage de pixel.

Calculez G Star en utilisant la relation d’Einstein de Stokes généralisée, en tenant compte des limites d’applicabilité de la relation d’Einstein de Stokes généralisée pour un échantillon particulier. Répétez les étapes d’analyse pour chaque champ de vision de l’expérience. Co-enregistrez les données de position avec le mod viscoélastique I à une fréquence d’intérêt particulière, en fonction du fabricant du microscope utilisé.

Cette étape peut être facilitée par une routine personnalisée, qui lit les métadonnées du microscope ou les données de position peuvent être compilées manuellement. Des séquences vidéo sont acquises à plusieurs positions spatiales dans un puits représentatif contenant un nodule tumoral 3D et reliées pour fournir une carte de microradiologie spatiale de l’échantillon lorsqu’elles sont surveillées longitudinalement : les populations de cellules à la périphérie de la casserole. L’un des stéroïdes utilisés dans cet exemple dégradera spontanément les fibres de collagène environnantes et envahira la matrice extracellulaire en quelques jours.

Dans cet exemple, le co-enregistrement de la micrologie fournit une lecture quantitative de l’invasion évidente dans la matrice qui se produit à gauche, mais pas à droite du stéroïde. Le suivi longitudinal de ces régions spatiales disparates montre une baisse de la composante réelle du module de cisaillement viscoélastique complexe d’environ quatre ordres de grandeur concomitante à l’invasion. Des données dépendantes de la fréquence complète sont montrées contrastant les propriétés théologiques du matériau dans la région un et la région deux au quatrième jour.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler qu’il faut veiller à éviter les pièges courants lors de l’analyse des trajectoires de sonde qui conduisent à des conclusions inappropriées. Nous encourageons les lecteurs à se référer à la littérature PTM citée ici, qui aborde des considérations telles que la dérive de l’échantillon et l’interprétation de l’hétérogénéité. Cette procédure peut être combinée à une imagerie de fluorescence longitudinale ou terminale supplémentaire pour répondre à d’autres questions, telles que la corrélation entre le remodelage mécanique et les événements de signalisation clés ou la réponse cytotoxique à une intervention.