Name: Analyser linternalisation cellulaire de nanoparticules et de bactéries multi-spectrale par cytométrie de flux dimagerie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 7 s
Description: Découvrez l'analyse de l'internalisation cellulaire de nanoparticules et de bactéries par cytométrie de flux d'imagerie multi-spectrale. Cette méthode utilise des macrophages RAW 264.7 pour étudier les mécanismes dépendants de l'actine.

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Les auteurs tiennent à remercier le Prix ONR-Muri (NN00014-06-1-1176) et le US Army Medical Research et du matériel de commande (Numéros de subvention W81XWH-09-1-0386 et W81XWH-10-1-0806) pour les financiers soutenir.

<ol><li>Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+protective+single-dose+intranasal+nanoparticle-based+vaccine+platform+for+respiratory+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases.</a> PLoS One. 6, e17642(2011).</li>
<li>Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., García-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+the+magnitude+and+persistence+of+antibody+responses+with+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity.</a> Nature. 470, 543-547 (2011).</li>
<li>Rice-Ficht, A. C., Arenas-Gamboa, A. M., Kahl-McDonagh, M. M., Ficht, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+particles+in+vaccine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Polymeric particles in vaccine delivery.</a> Curr. Opin. Microbiol. 13, 106-112 (2010).</li>
<li>Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyanhydrides+as+localized+drug+delivery+carrier%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Drug.+Deliv%22%5BJournal%5D)">Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update.</a> Expert. Opin. Drug. Deliv. 5, 889-907 (2008).</li>
<li>Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ester-anhydride%29%3Apoly%28beta-amino+ester%29+micro-+and+nanospheres%3A+DNA+encapsulation+and+cellular+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection.</a> Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).</li>
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<li>Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+differentially+modulates+particle+binding%2C+phagocytosis+and+downstream+antimicrobial+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms.</a> Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).</li>
<li>Murphy, K. C., Campellone, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambda+Red-mediated+recombinogenic+engineering+of+enterohemorrhagic+and+enteropathogenic+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli.</a> BMC. Mol. Biol. 4, 11(2003).</li>
<li>Karsi, A., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+host+range+fluorescence+and+bioluminescence+expression+vectors+for+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria.</a> Plasmid. 57, 286-295 (2007).</li>
<li>Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li>
<li>Doherty, G. J., McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of endocytosis.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).</li>
<li>Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+inhibitors+to+study+endocytic+pathways+of+gene+carriers%3A+optimization+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls.</a> Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).</li>
<li>Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-sensitive+non-phospholipid+vesicle+and+macrophage-like+cells%3A+binding%2C+uptake+and+endocytotic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).</li>
<li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li>
</ol>

Sherree L. ami est employé par Amnis Corporation, qui fabrique le système X ImageStream.

Des études ont montré que les nanoparticules biodégradables à base de poly (lactique-co-acide glycolique (PLGA) ou polyanhydrides peuvent être utilisés pour délivrer des antigènes encapsulés ou des médicaments à des cellules cibles. L&#39;adoption de ces nanoparticules par les cellules phagocytaires est important pour leur efficacité, ce qui rend quantitative . analyse de l&#39;internalisation crucial dans la conception de nouveaux systèmes de nanoparticules de livraison En utilisant cette méthode, l&#39;absorption diff...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> RAW 264.7 lignée cellulaire </td><td> American Type Culture Collection (ATCC) </td><td> TIB-71 </td><td></td></tr><tr><td> Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S 11150 </td><td> Premium Grade </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> 24 et la plaque</td><td> PPT </td><td> 92024 </td><td></td></tr><tr><td> Flacons de culture cellulaire </td><td> PPT </td><td> 90151 </td><td></td></tr><tr><td> Racloir à cellules </td><td> PPT </td><td> 99002 </td><td> 24 cm </td></tr><tr><td> Salmonella enterica sérotype Typhimurium </td><td> ATCC </td><td> 14028 </td><td></td></tr><tr><td> BTX ECM630 Manipulateur cellule électro </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP308 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon phosphate salin (PBS) </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Ultrasons processeur liquide </td><td> Misonix </td><td> S-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Cytochalasine-D </td><td> Sigma-Aldrich, </td><td> C8273 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldéhyde </td><td> Polysciences </td><td> 04018 </td><td></td></tr><tr><td> Le tampon de lavage </td><td> FBS 2% de la chaleur inactivé, l&#39;azoture de sodium à 0,1% dans du PBS. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Perm / tampon de lavage </td><td> BD Biosciences </td><td> 554714 </td><td></td></tr><tr><td> Clear-voir microtubes Snap Cap </td><td> Sigma </td><td> T4816 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 660 phalloïdine </td><td> Invitrogen </td><td> A22285 </td><td></td></tr><tr><td> X ImageStream </td><td> Amnis Corporationtion </td><td> 100200 </td><td> Options: 658nm laser, passeur d&#39;échantillons </td></tr><tr><td> L&#39;azoture de sodium </td><td> Fisher Scientific </td><td> S-500 227I </td><td></td></tr></tbody></table>

analyser l&#39;internalisation cellulaire de nanoparticules et de bactéries multi-spectrale par cytométrie de flux d&#39;imagerie

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Systèmes Nanoparticulate ont émergé comme des outils précieux dans la livraison des vaccins par leur capacité à fournir efficacement des marchandises, y compris les protéines, les cellules présentatrices d&#39;antigènes 1-5. L&#39;internalisation des nanoparticules (NP) par les cellules présentatrices de l&#39;antigène est une étape cruciale pour générer une réponse immunitaire efficace à l&#39;antigène encapsulé. Pour déterminer comment les changements dans la fonction incidence des nanoparticules formulation, nous avons cherché à développer un débit élevé, quantitative protocole expérimental qui était compatible avec la détection des nanoparticules internalisées ainsi que les bactéries. À ce jour, deux techniques indépendantes, la microscopie et cytométrie de flux, ont été les méthodes utilisées pour étudier la phagocytose des nanoparticules. La nature à haut débit de la cytométrie de flux génère données statistiques solides. Toutefois, en raison de faible résolution, il ne parvient pas à quantifier avec précision par rapport à des cellules internalisées nanoparticules liées. Microscopie génère des images à haute résolution spatiale; houtefois, cela prend du temps et implique de petits échantillons 6-8. Multi-spectrale cytométrie de flux d&#39;imagerie (MIFC) est une nouvelle technologie qui intègre les aspects de la microscopie et cytométrie en flux qui effectue multicolore imagerie spectrale de fluorescence champ et lumineux à la fois à travers un noyau laminaire. Cette capacité fournit une analyse précise des intensités de signaux fluorescents et les relations spatiales entre les différentes structures et fonctions cellulaires à haute vitesse. Nous décrivons ici une méthode utilisant MIFC pour caractériser les populations de cellules qui ont intériorisé des nanoparticules polyanhydrides ou Salmonella enterica sérotype Typhimurium. Nous décrivons également la préparation de suspensions de nanoparticules, l&#39;étiquetage, l&#39;acquisition de la cellule sur un système ImageStream X et l&#39;analyse des données en utilisant l&#39;application IDÉES. Nous démontrons également l&#39;application d&#39;une technique qui peut être utilisé pour différencier l&#39;internalisation pathways pour nanoparticules et les bactéries à l&#39;aide cytochalasine-D comme inhibiteur de l&#39;actine-phagocytose.

Dans cet article, nous décrivons une méthode utilisant multi-spectrale cytométrie de flux d&#39;imagerie pour quantifier l&#39;internalisation des nanoparticules ou des bactéries polyanhydride par des cellules RAW 264.7.

Analyser l&#39;internalisation cellulaire de nanoparticules et de bactéries multi-spectrale par cytométrie de flux d&#39;imagerie

Les systèmes nanoparticulaires se sont imposés comme des outils précieux pour l'administration de vaccins grâce à leur capacité à délivrer efficacement des charges, notamment des protéines, vers...

Pour analyser les mécanismes cellulaires d'internalisation de nanoparticules et de bactéries par cytométrie en flux à imagerie multispectrale. Les macrophages sont d'abord prétraités avec de la cytochalasine D afin d'inhiber la polymérisation de l'actine. Des nanoparticules ou des salmonelles sont ajoutées aux macrophages en monocouche et incubées.Ensuite, les macrophages sont récoltés, fixés et marqués pour analyse à l’aide d’un flux d’images. Un cytomètre de flux à imagerie multispectrale permet de distinguer les cellules ayant internalisé des nanoparticules ou des salmonelles de celles présentant des nanoparticules ou des salmonelles liées à la surface. Les données obtenues indiquent que les salmonelles et les nanoparticules sont internalisées uniquement par les cellules qui n’ont pas été traitées avec la cyto klaine.D suggérant que l'internalisation dépend de l'actine. Cette technique présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes existantes telles que la cytométrie en flux et la microscopie confocale. Principalement, elle permet de mesurer avec précision les intensités du signal fluorescent et la résolution spatiale entre différentes caractéristiques cellulaires à grand

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Source : Zhang, Y., et al. Application de nanoparticules fluorescentes pour étudier le remodelage du système endo-lysosomal par des bactéries intracellulaires. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo démontre l’utilisation de nanoparticules fluorescentes pour visualiser le remodelage endo-lysosomal dans les cellules épithéliales humaines infectées par des bactéries intracellulaires. À la suite d’une invasion bactérienne, les agents pathogènes manipulent le cytosquelette de l’hôte et le système...

Visualisation médiée par des nanoparticules du remodelage endo-lysosomal dans des cellules infectées par des bactéries

Nous passons en revue nos résultats récents sur l'intégration de la microscopie à fluorescence et des outils d'imagerie cytométrie en flux sur un téléphone portable à l'aide compacts et rentables opto-fluidiques pièces jointes. Ce téléphone portable sur la base de micro-analyse pourrait être utile pour l'analyse cytométrique, telles que l'exécution de tâches diverses cellules de comptage ainsi que pour criblage à haut débit d'échantillons d'eau, par exemple, dans les pays à ressources limitées.

Champ large Microscopie fluorescente et cytométrie de flux fluorescente imagerie sur un téléphone portable

Dans cette étude, l’objectif principal était de surveiller l’absorption cellulaire et l’exocytose éventuelle des nanotubes de carbone (NTC). Dans cette perspective, nous avons proposé ici une méthode unique utilisant la cytométrie en flux d’imagerie multispectrale permettant une quantification et une localisation des NTC dans un nombre statistiquement pertinent de cellules.

Localisation et quantification relative des nanotubes de carbone dans les cellules avec la cytométrie en flux d’imagerie multispectrale

L'analyse de l'interaction des nanoparticules avec des sous-populations de cellules immunitaires définies par cytométrie de flux.

Détection de nanoparticules fluorescentes Interactions avec immunitaire primaire sous-populations de cellules par cytométrie en flux

Cet article décrit les méthodes pour la synthèse et le marquage fluorescent de nanoparticules (NP). Les IP ont été appliquées dans des expériences pulse-chase d'étiqueter le système endo-lysosomale des cellules eucaryotes. La manipulation du système d'endo-lysosomal par les activités de l'agent pathogène intracellulaire Salmonella enterica ont été suivis par imagerie des cellules vivantes et quantifiée.

Application de nanoparticules fluorescentes pour étudier Rénovation du système Endo-lysosomale par des bactéries intracellulaires

Cette méthode démontre une technique d’évaluation de la fonction des granulocytes en mesurant simultanément la phagocytose des bactéries et l’explosion oxydative. La cytométrie en flux basée sur l’image a permis d’identifier trois sous-ensembles distincts de granulocytes activés qui différaient tous dans leur capacité fonctionnelle relative.

Basée sur l'image de cytométrie en flux Technique pour évaluer les changements de granulocytes Fonction In Vitro

Analyse en cytométrie en flux s’est avérée précieuse pour enquêter sur des cultures pures et le contrôle dynamique des communautés microbiennes. Nous présentons trois flux de travail complet, de prélèvement d’échantillons pour l’analyse des données, des cultures pures et communautés complexes dans un milieu claire ainsi que dans des matrices difficiles, respectivement.

CARACTERISATION Microbiome dynamique – écoulement Cytometry basé dans les Workflows de Cultures pures des communautés naturelles

L'analyse micronutrique in vitro est une méthode bien établie pour évaluer la génotoxicité et la cytotoxicité, mais la notation de l'essai à l'aide de la microscopie manuelle est laborieuse et souffre de subjectivité et de variabilité inter-scorer. Cet article décrit le protocole développé pour effectuer une version entièrement automatisée de l'essai utilisant la cytométrie multispectrale de flux d'imagerie.

Une méthode automatisée pour effectuer l'essai micronutrique in vitro à l'aide de la cytométrie du flux d'imagerie multispectrale

Cet article présente l’intégration d’un module de focalisation spectrale et d’un laser à impulsions à double sortie, permettant une imagerie hyperspectrale rapide des nanoparticules d’or et des cellules cancéreuses. Ce travail vise à démontrer les détails des techniques optiques non linéaires multimodales sur un microscope à balayage laser standard.

Imagerie biomoléculaire de l’absorption cellulaire de nanoparticules à l’aide de la microscopie optique multimodale non linéaire

Ce protocole décrit une approche quantitative pour mesurer l’auto-agrégation microbienne à l’aide de la cytométrie en flux d’imagerie.

Cytométrie en flux d’imagerie pour étudier l’auto-agrégation microbienne

Cette étude élucide le traitement phagocytaire des particules de Godanti Bhasma (GB) dans les cellules de mammifères, en caractérisant leur absorption cellulaire, la dynamique des vacuoles, l’acidification et la dégradation. Ces résultats font non seulement progresser notre compréhension des mécanismes fondamentaux de la phagocytose, mais établissent également la GB comme un système modèle prometteur pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Exploration des événements cellulaires séquentiels de la phagocytose déclenchée par Godanti Bhasma dans les cellules de mammifères

Découvrez l'analyse de l'internalisation cellulaire de nanoparticules et de bactéries par cytométrie de flux d'imagerie multi-spectrale. Cette méthode utilise des macrophages RAW 264.7 pour étudier les mécanismes dépendants de l'actine.

Analyser l'internalisation cellulaire de nanoparticules et de bactéries multi-spectrale par cytométrie de flux d'imagerie

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