Analyser l'internalisation cellulaire de nanoparticules et de bactéries multi-spectrale par cytométrie de flux d'imagerie

Analyser les mécanismes cellulaires d’internalisation des nanoparticules et des bactéries par cytométrie en flux d’imagerie multispectrale. Les macrophages sont d’abord prétraités avec du cyto klain D pour inhiber la polymérisation de l’actine. Des nanoparticules ou des salmonelles sont ajoutées au macrophage, monocouches et incubées.

Ensuite, les macrophages sont récoltés, fixés et étiquetés pour être analysés à l’aide d’un flux d’images. Les cellules de cytomètre en flux d’imagerie multispectrale qui ont des nanoparticules internalisées et/ou des salmonelles sont distinguées de celles avec des nanoparticules liées à la surface et/ou des salmonelles. Les données qui en résultent indiquent que la salmonelle et les nanoparticules ne sont internalisées que par des cellules qui n’ont pas été traitées avec le cyto klain.

D, ce qui suggère que l’internalisation dépend de l’actine. Cette technique présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes existantes telles que la cytométrie en flux et la microscopie confocale. Principalement, il fournit une mesure précise de l’intensité du signal fluorescent et de la résolution spatiale entre différentes caractéristiques cellulaires à grande vitesse.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés pour la recherche sur les biomatériaux, les vaccins et l’administration de médicaments, ainsi que pour les études sur l’interaction avec les agents pathogènes. Cela comprend la délimitation des voies d’internalisation utilisées par les nanoparticules de polyanhydride et les bactéries. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode ont souvent des difficultés.

Il est important de passer du temps à titrer les colorants afin d’obtenir des signaux de fluorescence optimaux. De plus, la connaissance du logiciel et la création de modèles d’analyse prennent du temps. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons constaté que les polynanoparticules hydro présentent des caractéristiques imitant les agents pathogènes en utilisant la microscopie et d’autres techniques.

Nous avons ensuite voulu un système à haut débit pour comparer les processus d’internalisation utilisés par la salmonelle et les nanoparticules d’hydrure de pollen avant d’effectuer le test. Toutes les cultures de cellules de mammifères et de bactéries doivent être récoltées et des suspensions de nanoparticules doivent être préparées. Commencez par récolter des cellules confluentes RA W2 64.7 à l’aide d’un grattoir cellulaire.

Déterminez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Ensuite, plaquez les cellules dans une boîte de culture de 24 puits à une densité de cinq fois 10 à la cinquième cellules par puits dans 0,5 millilitre. Incubation complète DMEM pendant la nuit à 37 degrés Celsius et dans un incubateur à 5 % de CO2.

Pour préparer la salmonella tarica diluée, transformer la salmonelle en C-D-M-E-M pour obtenir une multiplicité d’infection de cent par RA W2 64,7 cellules dans un tube de culture en verre autoclave de 16 x 125 millimètres. Ensuite, à l’aide de papier de lactosérum stérilisé, pesez cinq milligrammes de nanoparticules de polyanhydride chargées de 1 % de FITC générées comme décrit par des collègues de Rean dans leur publication de 2009 et des recherches pharmaceutiques dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre. Ajoutez les nanoparticules à 0,5 millilitre de solution saline tamponnée au phosphate froid et placez-le sur de la glace.

Garder le tube sur de la glace. À l’aide d’un processeur de liquide à ultrasons muni d’un micro-embout, soniquer la suspension pendant environ 25 secondes à une température de quatre à six joules. Maintenant que toutes les cellules et tous les réactifs nécessaires sont prêts, le test de phagocytose peut être effectué.

Marquage 24, boîtes de culture tissulaire contenant des cellules RA W2 64.7 cultivées en préparation du test sur la première plaque. Chacun des échantillons suivants sera analysé en trois exemplaires, cyto et D avec des nanoparticules, cyto et D avec des salmonelles, milieu avec des nanoparticules, milieu avec des nanoparticules de salmonelle uniquement, salmonelle uniquement et AF six cellules de coloration de 60 à seulement quatre degrés Celsius les contrôles seront analysés sur la deuxième plaque et comprendront le milieu plus les nanoparticules et le milieu plus l’incubation de salmonelle à cette basse température, Processus cellulaires lents tels que la phagocytose une heure avant l’induction. Ajoutez cinq microgrammes par millilitre de cyto et D et C-D-M-E-M dans les puits appropriés et incubez les cellules à 37 degrés Celsius.

Après l’incubation, vortex la suspension de nanoparticules et ajoutez 10 microlitres dans les puits appropriés. Ensuite, vortex la salmonelle et ajoutez-la dans les puits appropriés à un moment d’inertie de 100. Tapotez l’assiette plusieurs fois pour mélanger.

Placez ensuite les plaques d’échantillon à 37 degrés Celsius et les plaques de contrôle négatif à quatre degrés Celsius pendant 45 minutes. Après l’incubation, placez les plaques sur de la glace, lavez les cellules deux fois avec du PBS glacé sans calcium ni magnésium en aspirant et en jetant l’ancien milieu pour éliminer les particules non liées, la salmonelle et les cellules mortes ou détachées. Utilisation de pétale de magnésium.

Le pré PBS à ce stade est essentiel car il facilite le détachement des cellules du substrat Pour récolter les cellules, ajoutez 250 microlitres de PBS glacé et raclez doucement les puits, pipetez les cellules récoltées dans des micro-tubes à centrifuger siliconés et conservez-les sur de la glace. Lavez les cellules en ajoutant un millilitre de tampon de lavage à froid, puis centrifugez à 250 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir jeté le surnageant, retirez le tampon résiduel en tapotant le tube de micro-centrifugeuse inversé sur du papier.

Serviette : remettez en suspension la pastille de cellule en ratissant doucement le tube de micro-centrifugeuse sur un support de tube à essai. Pour fixer les cellules, ajoutez 100 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS et laissez les cellules reposer pendant 15 minutes. À température ambiante, lavez les cellules en ajoutant un millilitre de tampon de lavage permanent, puis centrifugez à 250 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Après avoir jeté le surnageant, retirez le tampon résiduel comme précédemment. Puis pour colorer les cellules RA W2 64,7. Pour l’actine, ajoutez 100 microlitres de tampon de lavage permanent contenant Alexa Fluora foid en six 60 pendant 15 minutes.

À température ambiante, les échantillons non colorés doivent être incubés avec une perm, un tampon de lavage sans phin. Après la coloration, lavez et centrifugez à nouveau les cellules, puis mettez-les en suspension dans 50 microlitres de PBS contenant 1 % de PFA et stockez-les dans l’obscurité à quatre degrés Celsius jusqu’à l’acquisition. Mise sous tension, diffusion d’images et lancement.

Inspirez et initialisez la fluidique dans le menu fichier. Choisissez Charger le modèle par défaut. Dans la galerie d’images, menu d’affichage, sélectionnez tout et appuyez sur run setup pour commencer à imager les billes si nécessaire, ajustez le suivi du noyau pour centrer les images latéralement.

Sélectionnez le canal en fond clair et cliquez sur Définir l’intensité. Attendez que le coefficient de variation de la vitesse d’écoulement soit constamment inférieur à 0,2 %Dans l’onglet d’assistance, cliquez sur démarrer tout pour exécuter les étalonnages et les tests et vérifier que tous ont réussi dans le logiciel. Cliquez sur charger l’échantillon.

Ensuite, lorsque vous êtes invité à le faire, placez le flacon contenant l’échantillon le plus brillant. Avec tous les fluorochromes dans le chargeur d’échantillons, sélectionnez un grossissement de 40 x. Une fois les paramètres de l’instrument établis, ne les modifiez pas pour l’ensemble de l’expérience.

Allumez chaque laser de l’expérience en cliquant sur les icônes laser dans le logiciel et réglez la puissance du laser de sorte que chaque fluorochrome ait des valeurs de pixels maximales comprises entre 104 000 points, telles que mesurées dans les nuages de points. Pour éliminer la collecte d’objets indésirables, cliquez sur la fenêtre du classificateur de cellules dans le logiciel. Ensuite, pour collecter uniquement les données de cellule, sélectionnez la limite inférieure de la zone du canal un pour le fond clair et définissez la valeur sur 50 micromètres Les objets dont la surface est inférieure à 50 micromètres seront considérés comme des débris et ne seront pas acquis.

Sélectionnez les chaînes à collecter en cliquant sur les icônes de chaînes appropriées dans le logiciel ici. Les canaux 1, 2, 3, 4, 5 et six sont sélectionnés sous l’onglet de configuration. Entrez le numéro de fichier et le dossier de destination.

Définissez le numéro de séquence sur un et le nombre d’événements à acquérir sur 5 000. Cliquez sur exécuter, acquérir pour collecter et enregistrer le premier fichier de données d’expérience. Cliquez sur FLL et exécutez l’échantillon expérimental suivant.

Répétez l’opération jusqu’à ce que tous les échantillons expérimentaux aient été prélevés. Ensuite, pour exécuter les commandes, cliquez sur les paramètres de composition. Cela désactivera le champ clair et le laser à diffusion et permettra la collecte de tous les canaux de fluorescence sous l’onglet d’acquisition.

Remplacez la valeur d’entrée par 500. Placez ensuite le tube de contrôle et cliquez sur exécuter. Acquérir pour collecter 500 cellules positives dans des contrôles monocolorés.

Répétez l’opération pour chaque fluorochrome de l’expérience afin d’obtenir une matrice de compensation. Une fois que tous les exemples d’images ont été acquis, lancez le logiciel d’analyse d’idées sur un ordinateur d’analyse séparé en double-cliquant sur l’icône des idées sur le bureau. Double-cliquez sur l’assistant d’internalisation et chargez l’un des fichiers RIF d’échantillon de test.

Une fenêtre contextuelle fournira des instructions pour charger les fichiers de test. Suivez les instructions et cliquez sur le bouton suivant. Ensuite, cliquez sur nouvelle matrice.

Cela lancera l’assistant de compensation. Lorsque vous y êtes invité, sélectionnez les fichiers de données pour les commandes de couleur unique afin de les ajouter. Cliquez ensuite dans l’assistant en suivant les instructions jusqu’à ce que le fichier de matrice de compensation soit enregistré et chargé dans la zone de la deuxième étape de l’assistant d’internalisation.

Cliquez sur Suivant et suivez les instructions jusqu’à ce qu’un fichier DAF soit généré. Définissez les propriétés d’affichage de l’image en sélectionnant les couches d’image utilisées lors de l’acquisition. Cliquez sur le canal deux pour FITC et sur le canal cinq pour AF six 60.

Le fond clair et la diffusion latérale sont sélectionnés par défaut. Sélectionnez le canal en fond clair O un pour faire la limite cellulaire et le canal O2 dans lequel les nanoparticules ou les bactéries ont été collectées pour la sonde d’internalisation afin de définir la population cellulaire unique, un nuage de points de la zone en fond clair par rapport au rapport d’aspect en fond clair de toutes les cellules est généré. L’analyse à haut débit de plusieurs fichiers de données nécessite un fichier modèle, il est donc essentiel de définir soigneusement les portes lors de la création d’un fichier modèle.

Chaque point représente les valeurs d’une image de cellule individuelle. Cliquez sur un single. dans un graphique pour sélectionner l’image de cette cellule particulière dans la galerie d’images.

Ensuite, tracez une porte autour des cellules avec l’aire et le rapport d’aspect qui correspondent aux événements de cellule unique. Les cellules simples ont un rapport d’aspect de un tour et de doublets. Avoir un rapport d’aspect d’environ 0,5.

Cliquez sur plusieurs cellules pour différencier la région contenant des cellules uniques des doublets ou des débris. Pour générer un histogramme du dégradé de fond clair, la racine signifie carré de l’image en fond clair. Cliquez sur le bouton suivant.

Ensuite, sous l’onglet population, sélectionnez l’option corbeille pour afficher la corbeille sélectionnée. Cliquez sur les bacs pour déterminer où les cellules et la meilleure focalisation. Commencez et tracez une région linéaire pour les cellules focalisées sur la marche.

Plus le gradient RMS est élevé, mieux vous êtes concentré, sautez l’étape suivante à moins qu’il n’y ait d’autres taches à surveiller. Un nouveau nuage de points de l’intensité du canal deux sur l’axe des x en fonction du pixel maximum du canal deux sur l’axe des y est généré. Cliquez sur les points et visualisez les images pour vous aider à déterminer la région à dessiner autour des cellules qui sont positives pour les nanoparticules ou les bactéries.

Un histogramme de la fonction d’internalisation est généré avec une région qui commence à zéro, qui doit être ajustée en observant les images. La caractéristique d’internalisation est un rapport entre l’intensité à l’intérieur de la cellule et l’intensité de la cellule entière. Il est mis à l’échelle de telle sorte qu’à une valeur de zéro, la moitié de l’intensité se trouve à l’intérieur.

L’assistant a créé une région de chaque cellule qui désigne l’intérieur en créant un masque qui est utilisé, l’entrée d’image de la cellule pour trouver la surface de la cellule et l’a érodée de quatre pixels. Notez que ce masque peut être ajusté manuellement pour différents types de cellules si nécessaire en créant d’abord un masque d’objet sur l’image en fond clair et en l’érodant de plus ou moins de pixels. La fonction d’internalisation est calculée sur la base de ce masque d’objets érodés à l’aide d’un algorithme dans le logiciel.

Cette caractéristique nous permet de distinguer les particules et les bactéries internalisées qui ont la majorité de leur signal fluorescent à l’intérieur de la limite du masque des particules et des bactéries liées à la surface, qui ont la majorité de leur signal fluorescent à l’extérieur de la limite du masque, comme le montre cet exemple, créent un nouvel histogramme avec une nouvelle caractéristique d’internalisation basée sur le masque d’objet érodé. Dessinez une région à contrôler sur des cellules internalisées en affichant l’imagerie en mode chutier sélectionné. Réglez la porte sur 0.3.Ici.

Les cellules dont le score est inférieur à 0,3 sont considérées comme des cellules positives pour les particules liées à la surface. Pour éliminer les cellules avec un marquage d’arrière-plan et pour identifier des nanoparticules ou des bactéries internalisées spécifiques, choisissez les caractéristiques dans le menu d’analyse. Cliquez sur le menu d’analyse.

Cliquez ensuite sur la fonction de comptage des points à côté de celle pour ajouter le nombre moyen de points au rapport statistique. Dans le menu des rapports, cliquez sur l’icône des rapports. Définissez ensuite le rapport de statistiques, puis ajoutez des colonnes, puis sélectionnez la population de cellules appropriée.

Cliquez sur OK. L’assistant d’internalisation ajoutera automatiquement des statistiques à ce rapport pour enregistrer le fichier de données en tant que fichier modèle à utiliser pour l’analyse par lots de tous les fichiers expérimentaux. Cliquez sur le menu Fichier et sélectionnez Enregistrer en tant que modèle.

Fichiers modèles. Avoir l’extension point AST pour analyser plusieurs fichiers de données dans le logiciel d’idée. Cliquez sur outils, sélectionnez les fichiers de données de lot et saisissez tous les fichiers RIF.

Ajoutez le fichier de matrice de compensation et le fichier modèle dans les sections correspondantes pour soumettre le lot au traitement, cliquez sur Soumettre. Après l’étape de traitement, tous les fichiers RAF sont analysés et des fichiers DAF sont générés pour chacun des fichiers bruts individuels. Un rapport final est généré avec des statistiques pour tous les échantillons afin de comparer l’effet de l’inhibition de l’actine et de la basse température sur la phagocytose de la salmonelle et des nanoparticules.

Les cellules RA W2 64.7 ont été incubées à 37 degrés Celsius dans un milieu, avec ou sans cyto klain D, ou incubées dans un milieu à quatre degrés Celsius. Les manipulations de la température et de l’actine ont réduit l’internalisation des nanoparticules et de la salmonelle. Cependant, l’incubation des cellules dans cyto et D augmente le pourcentage de cellules avec des nanoparticules liées à la surface tout en diminuant le pourcentage de cellules avec des salmonelles liées à la surface.

Le pourcentage de cellules positives pour les nanoparticules liées à la surface passe d’environ 8 % à 37 degrés Celsius à plus de 35 % après un traitement cyto et D ou quatre degrés Celsius. En revanche, le pourcentage de cellules contaminées par des salmonelles liées à la surface a été réduit de 35 % à 15 % Après le traitement par cyto et D, l’incubation de cellules RA W2 64,7 avec des salmonelles à quatre degrés Celsius a diminué l’internalisation sans augmentation apparente de la quantité de bactéries liées à la surface par rapport au témoin à 37 degrés Celsius. Ensemble, ces données démontrent que la salmonelle et les nanoparticules sont internalisées par un processus cellulaire similaire qui nécessite de l’actine et dépend de la température.

De plus, les données indiquent que la fixation soutenue de la salmonelle aux macrophages nécessite une polymérisation de l’actine. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’exa l’internalisation cellulaire des nanoparticules et des bactéries par cytométrie en flux d’imagerie multispectrale. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les inhibiteurs sont cytotoxiques.

Par conséquent, des expériences préalables de profilage de cytotoxicité sont nécessaires pour déterminer les concentrations optimales à utiliser. N’oubliez pas que travailler avec la salmonelle peut être dangereux, des précautions telles que le port de l’équipement de protection individuelle approprié et éviter la création d’aérosols doivent être observées lors de l’exécution de cette procédure.