Une méthode efficace pour quantitative, analyse unicellulaire de la chromatine Modification et architecture nucléaire dans l'ensemble du montage ovules dans Arabidopsis

L’objectif global de cette procédure est de préparer Arabidopsis Vues pour l’hybridation en monture entière et l’immunomarquage. Ceci est accompli en fixant d’abord les boutons floraux frais dans la solution fixatrice. La deuxième étape consiste à disséquer soigneusement et à intégrer des vues dans des coussinets d’acrylamide miniatures directement sur des lames de microscopie.

Ensuite, le traitement des tissus permet la clarification et la perméation des tissus. La dernière étape consiste à incuber les échantillons traités avec une solution d’anticorps pour l’immuno-coloration ou une sonde marquée pour l’hybridation fluorescente en C deux. En fin de compte, l’imagerie confocale à haute résolution suivie d’une reconstruction tridimensionnelle permet une analyse quantitative en montage entier au niveau de la cellule unique.

Cette méthode a d’abord été utilisée pour donner un aperçu de l’organisation de la tomodensitométrie dans la vue, mais elle a également pu être appliquée pour analyser d’autres compartiments cellulaires dans d’autres tissus de la plongée et dans d’autres organismes modèles. Dans des tubes de micro-fuge remplis d’un tampon BBO fraîchement préparé, refroidis sur de la glace à raison de 20 à 30 carpiens par tube, réglez les tubes pour qu’ils se balancent doucement à température ambiante pendant une demi-heure. Ensuite, faites tourner les tubes pendant une minute à 400 G.Ensuite, aspirez soigneusement les surnageants, jetez-les et ajoutez un millilitre de PBT aux carpes. Placez les tubes sur de la glace pour chaque tube de carpe à monter.

Préparez-vous sur de la glace. Cinq tubes de 200 microlitres. Un mélange fraîchement préparé à 5 % d’acrylamide.

Cinq lames de super givre propres étiquetées avec un crayon, un Eloqua de pensée de 20 % PS et un Eloqua de pensée de 20 % NAPS à partir d’un tube de carpes. Prenez-en quatre ou cinq avec une pointe d’extrémité coupée et placez-les chacun sur une seule lame. Retirez l’excès de liquide en pipetant soigneusement à l’aide de fines aiguilles.

Faites des coupes longitudinales dans les carpiens et enlevez les parois carpiennes pour libérer les rangées de vues. Cette étape demandera de la pratique. Empêchez les vues de sécher en ajoutant jusqu’à 10 microlitres de PBS, puis dans un tube de micro-fuge contenant le mélange d’acrylamide.

Ajoutez rapidement 12 microlitres de NAPS et 12 microlitres de PS. Mélangez bien la solution avec le pipetage et ajoutez rapidement 30 microlitres de cet acrylamide activé. Mélanger sur une lame avec des vues disséquées. Placez délicatement une petite lamelle sur la préparation et laissez la solution polymériser à température ambiante pendant environ une heure.

Préparez chaque diapositive de cette manière plus tard. Utilisez une lame de rasoir pour détacher les caillus. Les échantillons peuvent être stockés toute la nuit à quatre degrés Celsius dans un bocal coplan avec PBS ou procéder directement au traitement.

Généralement, le traitement doit être effectué dans des bocaux coplan avec 80 millilitres de solution. Et sous la hotte. Commencez par clarifier les tissus par incubation dans une série de solutions de méthanol-éthanol, une solution individuelle d’éthanol-éthanol, puis à nouveau dans de l’éthanol puis du méthanol.

Chaque bain dure cinq ou 30 minutes. Voir le protocole texte. Ensuite, utilisez une solution individuelle de méthanol PBT avec 2,5 % de formaldéhyde pendant 15 minutes.

Rincez ensuite le mouchoir en PBT deux fois pendant 10 minutes par bain. Après cela, les lames peuvent être stockées pendant la nuit à quatre degrés Celsius si nécessaire. Ensuite, prélevez jusqu’à six lames du bocal et égouttez l’excès de liquide.

Placez-les sur un papier de soie et ajoutez rapidement 100 microlitres d’une enzyme de digestion de la paroi cellulaire réfrigérée. Mélanger sur les coussinets. Couvrez ensuite les diapositives avec de grands lamelles de protection.

Incuber les lames pendant deux heures à 37 degrés Celsius dans une chambre humide. Il est important d’optimiser la température de digestion du CO pour chaque nouvelle solution enzymatique car cette étape est critique pour une coloration homogène par la suite. Lavez les lames deux fois avec du PBT pendant cinq minutes par lavage.

Ensuite, égouttez les lames maintenant sur chaque lame. Ajoutez 100 microlitres d’ARN A dans du PBS complété avec 1 % d’entrejambe et incubez les lames pendant une heure à 37 degrés Celsius dans une chambre humide après l’incubation, lavez les lames deux fois avec du PBT comme auparavant, puis fixez à nouveau le tissu en incubant les lames dans un bain de PBTF fraîchement préparé pendant 20 minutes. Rincez le PBTF avec un lavage au PBT pendant 10 minutes.

Procédez ensuite à la perméation tissulaire en incubant les lames dans du PBS avec 2 % d’entremibe pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Utilisez deux lavages en PBT de cinq minutes chacun pour éliminer la solution perméable. Procédez ensuite à l’immuno-marquage.

Commencez par incuber les lames dans l’anticorps primaire d’intérêt. Appliquez 100 microlitres d’aliquotes de l’anticorps dilué dans du PBS et avec 0,2 % entre les deux sur chaque lame. Transférez les lames dans une chambre humide et incubez-les à quatre degrés Celsius pendant 12 à 24 heures.

Lavez les lames dans un bain de PBT pendant deux à quatre heures en les balançant doucement à température ambiante. Ensuite, ajoutez 100 microlitres d’anticorps secondaires dilués de un à 200 dans du PBS avec 0,2 % entre 20 et incubez les lames pendant 24 heures à quatre degrés Celsius. Un bain d’une heure dans le PBT avec un léger balancement est suffisant pour laver les lames d’anticorps secondaires non liés.

Ensuite, contre-colorez l’ADN avec une solution de 10 microgrammes par millilitre d’iodure de propidium dans du PBS. Laissez la coloration se poursuivre pendant 15 minutes, puis lavez les lames avec du PBT à l’aide d’un balancement doux pendant 15 minutes à température ambiante. Montez maintenant les lames avec un milieu anti-décoloration complété par 10 microgrammes par millilitre d’iodure de propidium.

Après avoir laissé reposer pendant une heure, imager les lames sur un microscope confocal à l’aide d’une lentille d’immersion glycérol 63x. Ainsi, lors de l’acquisition d’images, il est essentiel de maintenir les paramètres de balayage identiques entre les échantillons pour permettre une quantification comparative et d’utiliser un mode de détection linéaire. Plus tard, reconstruisez les images en série en structures tridimensionnelles, segmentez chaque noyau d’intérêt et utilisez un logiciel de traitement d’images 3D pour quantifier les signaux.

En utilisant ce protocole de préparation robuste à grande échelle, l’ensemble des Monts Vues conservera sa structure tridimensionnelle. Les structures subcellulaires deviennent visibles avec beaucoup de détails, comme on le voit avec la chromatine. Lors de la coloration de l’ADN, l’hétérochromatine apparaît comme un foyer brillant et bien défini sans qu’il soit nécessaire d’appliquer une déconvolution.

Ce protocole permet une immunocoloration parallèle avec plusieurs anticorps en un seul tour. Par exemple, le marqueur permissif associé à la chromatine U, la lysine quatre méthylée à trois trimms H et le marqueur associé à l’hétérochromatine H trois monométhyllysine 27 ont tous deux été détectés dans une expérience sur des lames répétées distinctes pour analyser la dynamique de la chromatine. Une autre technique compatible est l’hybridation fluorescente C deux ou poisson poisson à 45 s.Ribosomique.

Les répétitions d’ADN ont été utilisées pour définir les régions d’organisation nucléaire. La sonde a été directement marquée avec Alexa 4 88, et l’ADN a été contre-coloré Pour l’analyse de l’ification, il est très important de tester différentes dilutions corporelles et les temps d’incubation pour identifier les conditions qui donnent un signal robuste et hogène avec le plus bas possible. Et la contrition corporelle.

Comme cette méthode permet d’obtenir une excellente conservation du tissu et une perméation optimale pour l’analyse de l’organisation de la chromatine sur cellule unique, elle ouvre la voie aux scientifiques dans le domaine de la biologie cellulaire végétale ou de l’épigénétique végétale pour étudier l’organisation nucléaire ou subcellulaire au niveau d’une cellule unique et dans le contexte de l’homme dans son ensemble.