Name: Une méthode efficace pour quantitative, analyse unicellulaire de la chromatine Modification et architecture nucléaire dans lensemble du montage ovules dans Arabidopsis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Découvrez une méthode d'immunomarquage et de FISH pour l'analyse unicellulaire des modifications de la chromatine et de l'architecture nucléaire dans les ovules entiers d'Arabidopsis thaliana.

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Nous remercions Ueli Grossniklaus (Université de Zurich) pour son soutien technique et financier. Nous sommes reconnaissants à Valeria Gagliardini, Christof Eichenberger, Arturo Bolanos et Peter Kopf pour le soutien général du laboratoire. Cette recherche a été financée par l’Université de Zurich, des subventions du Fonds national suisse à CB (31003A_130722) et Ueli Grossniklaus (31003A_141245 et 31003AB-126006), et de l’Agence Nationale de la Recherche à la DG (Programme ANR-BLANC-2012).

La procédure est décrite dans le flux de travail dans la figure 1, et la configuration de la dissection et l&#39;incorporation de tissus sont présentés dans la figure 2. 1. Fixation tissulaire <ol><li> Recueillir 20-30 carpelles dans un tube de centrifugeuse contenant fraîchement tampon fixateur BVO sur la glace. </li><li> Fixer le tissu 30 min en agitant doucement à température ambiante. </li><li> Faites tourner les tubes contenant les carpelles en fixateur dans une paillasse centrifuger 1 min à 400 x g. </li><li> Retirez soigneusement le tampon fixateur et ajouter 1 ml de PBT, placer les tubes sur la glace. </li></ol> 2. Dissection and Embedding <ol><li> Préparer cinq tubes Eppendorf avec chacun 200 pl d&#39;une fraîchement préparé, 5% d&#39;acrylamide mélange. </li><li> Préparer cinq lames Superfrost pré-nettoyées à l&#39;éthanol à 70% et étiquetés avec un crayon. </li><li> Décongeler une aliquote de 20% et 20% APS NaPS chacun, sur la glace. </li><li> Prenez 4-5 carpelles avec une pointe coupe-fin, le lieueux sur une lame propre, éliminer l&#39;excès de liquide. </li><li> Faire des coupes longitudinales avec une aiguille fine et détacher les murs de carpelles de libérer les lignes de ovules comme le montre la figure 2, éviter le séchage en couvrant avec du PBS (pas plus de 10 pi). </li><li> Ajouter rapidement et mélanger 12 NaPS pi, 12 pi APS avec une aliquote de 200 ul acrylamide mélange. </li><li> Ajouter 30 ul de l&#39;acrylamide activé sur les ovules disséqués. </li><li> Couvrir avec une lamelle mm 20 x 20, laisser polymériser à température ambiante, 45-60 min. </li><li> Retirer la lamelle couvre-objet en utilisant une lame de rasoir. A ce stade, les échantillons peuvent être conservés pendant une nuit à 4 ° C dans une jarre de Coplin contenant du PBS. </li></ol> 3. Traitement des tissus NOTE: Toutes les étapes, sauf 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 et 3.4.3 sont effectués dans des bocaux de Coplin avec 80 ml de solution sous le capot chimique à température ambiante. Les lames sont transférés avec une pointe plate-pince. <ol><li> clarification des tissus etfixation: <ol><li> Incuber 5 min dans du methanol. </li><li> Incuber 5 min dans de l&#39;éthanol. </li><li> Incuber 30 min dans de l&#39;éthanol: xylène (1:1). </li><li> Incuber 5 min dans de l&#39;éthanol. </li><li> Incuber 5 min dans du methanol. </li><li> Incuber 15 min dans du methanol et le PBT (1:01), complété avec 2,5% de formaldehyde. </li><li> Rincer 2 x 10 min en PBT. A ce stade, les lames peuvent être conservées pendant une nuit à 4 ° C. </li></ol></li><li> paroi cellulaire digestion: <ol><li> Décongeler une aliquote de la paroi cellulaire digestion mélange sur de la glace. </li><li> Prenez une diapositive de la cuve à rainures, drainer l&#39;excès de liquide en le plaçant à la verticale sur une serviette en papier. </li><li> Ajouter 100 pi de la paroi cellulaire digestion mélange sur le pavé de l&#39;acrylamide et couvrir avec une lamelle 23 mm x 46. Répétez l&#39;opération pour les autres diapositives. Incuber pendant 2 heures à 37 ° C dans une chambre humide (décrit dans Matériels). </li><li> Laver les lames 2 x 5 min en PBT. </li></ol></li><li> RNase A de traitement: <ol><li> Prenez une diapositive de la cuve à rainures, égoutter èmee excès de liquide que précédemment. </li><li> Incuber chaque lame avec 100 pl de RNase A à 100 ug / ml dans du PBS avec 1% de Tween-20 pendant 1 h à 37 ° C dans une chambre humide. </li><li> Laver les lames de 2 x 5 min en PBT. </li></ol></li><li> Post-fixation et perméabilisation: <ol><li> Post-fixer pendant 20 min dans fraîchement PBT-F. </li><li> Rincer les lames pendant 10 minutes dans le PBT. </li><li> Perméabiliser pendant 2 h dans du PBS avec 2% de Tween-20 à 4 ° C. </li><li> Rincer les lames de 2 x 5 min en PBT. </li></ol></li></ol> 4. Immunocoloration NOTE: Pour cette étape, la concentration optimale de l&#39;anticorps primaire doit être testée en utilisant différentes dilutions (1:200, 1:500, 1:1000) d&#39;anticorps. <ol><li> Incuber chaque lame avec 100 pi d&#39;anticorps primaire dilué dans du PBS avec 0,2% de Tween-20 pendant 12 à 24 heures à 4 ° C. </li><li> Laver les lames en PBT pour 2-4 heures à température ambiante sous agitation douce. </li><li> Appliquer le1:200 d&#39;anticorps secondaire dans du PBS + 0,2% de Tween-20 pendant 24 h à 4 ° C. </li><li> Laver les lames dans PBT pendant 1 heure à température ambiante sous agitation douce. </li><li> Contre-colorer avec 10 pg / ml d&#39;iodure de propidium dans du PBS pendant 15 min, puis rincer 15 min dans du PBS sous agitation douce, à température ambiante. </li><li> Mont en milieu de montage anti-décoloration de liquide supplémenté avec 10 pg / ml d&#39;iodure de propidium. Que le milieu de montage durcir pendant 1 heure avant l&#39;acquisition d&#39;images par CLSM. </li></ol> 5. Imagerie quantitative <ol><li> acquisition de l&#39;image: <ol><li> Acquérir des images de haute résolution en utilisant CLSM, de préférence en utilisant un mode de balayage de résonance, ce qui permet une meilleure conservation des signaux de fluorescence au cours de l&#39;imagerie 23 prolongée, et une lentille à immersion 63X de glycérol. </li><li> Testez les paramètres d&#39;acquisition tels que l&#39;intensité du laser, le gain, sténopé, la taille de voxel et le facteur de zoom au début de l&#39;expérience de définir une procédure d&#39;acquisition standard pour suivre strictement tout au long detoutes les diapositives pour des mesures quantitatives cohérentes. </li><li> Vérifier l&#39;absence de diaphonie entre fluorochromes. Le cas échéant, mettre en place une analyse séquentielle. Acquérir les images de transmission séparément et non simultanément. </li><li> Effectuer une acquisition d&#39;image de série, en trois dimensions avec la plus haute résolution possible dans les dimensions X et Y et avec 2x suréchantillonnage dans la dimension z (la règle de Nyquist). </li></ol></li><li> Traitement de l&#39;image: <ol><li> Reconstruire des images de série en trois dimensions en utilisant un logiciel de source commerciale ou ouvert. </li><li> Définir des surfaces de contour autour de chaque noyau (ou cellule) d&#39;intérêt en 3D. </li><li> Quantifier la fluorescence dans chaque canal à la somme des intensités de pixels dans chaque objet. </li><li> Exporter les données vers Excel pour des analyses statistiques. Normaliser les signaux d&#39;anticorps contre les signaux de coloration par exemple d&#39;ADN. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Chez les plantes à fleurs, la lignée reproducteur féminin est entouré de plusieurs couches de cellules, y compris le nucelle et les téguments de l&#39;ovule, ce qui rend la coloration cytologique en tout montage techniquement difficile. Nous présentons ici un protocole efficace permettant à l&#39;élaboration et au traitement d&#39;un grand nombre d&#39;ovules appropriés pour la coloration cytologique comme immunologique, la coloration de l&#39;ADN et l&#39;hybridation fluorescente in situ l&#39;ensemble du mont...

Chez les plantes à fleurs, l&#39;établissement de lignées de reproduction commence par la différenciation des CML, MMC féminine et masculine cellule microspores mère. La MMC se développe à partir d&#39;une cellule nucellaire sous-épidermique à l&#39;extrémité distale de l&#39;ébauche ovule, et la cellule mère des microspores se développe à partir du tissu sporogène dans la loge des anthères, qui sont situés profondément à l&#39;intérieur des organes floraux 1. SMC subissent une méiose pour produire des spores haploïdes, qui donnent alors lieu à des gamétophytes sur la mitose. Le gamétophyte femelle, ou sac embryonnaire, se compose d&#39;un ovule, une cellule centrale, deux synergides et trois antipodes. Le gamétophyte mâle, ou le pollen, est composé d&#39;une cellule végétative et deux spermatozoïdes. Alors que le gamétophyte mâle reste une étude d&#39;objet de relativement accessible, le gamétophyte femelle est incorporé dans l&#39;ovule, se joint à la carpelle de fleur, et pose donc des défis particuliers pour les analyses moléculaires et cytologiques. Récemment, cependant, assistée par lasermicrodissection offert une solution élégante permettant des analyses du transcriptome dans la console MMC et les cellules gamétophytiques femmes 2-4. En plus de l&#39;expression du gène candidat analyses, par exemple, en utilisant l&#39;hybridation in situ de l&#39;ARN ou des dosages de gène rapporteur dans les analyses cytologiques permet l&#39;étude des dynamiques de composants cellulaires endogènes en utilisant une coloration spécifique cellulaire directe ou indirecte immunomarquage. En particulier, la coloration cytogénétique utilisant FISH et coloration de l&#39;ADN, avec immunomarquage des modifications de la chromatine ou des composants de la chromatine sont des approches centrales à élucider la dynamique de la chromatine et l&#39;organisation nucléaire chez Arabidopsis 5. Typiquement, la méiose entraîne la dynamique des chromosomes spécifiques qui a été bien étudiés dans plante mâle méiocytes 6,7; encore à grande échelle, la réorganisation de la chromatine spécifique de la cellule, ce qui reflète probablement la reprogrammation épigénétique dynamique a été décrite au cours du développement du pollen 8-10. En revanche, en raisonà l&#39;inaccessibilité relative de la meiocyte femelle et gamétophyte, ces enquêtes restent techniquement difficile à appliquer, et nécessitent souvent dissection sectionnement ou manuel et la digestion enzymatique (voir ci-dessous). En outre, l&#39;absence fréquente de clarté optique dans l&#39;ensemble du montage est un obstacle à l&#39;imagerie haute résolution des cellules reproductrices dans ovules intacts. Une méthode classique pour l&#39;analyse cytologique de l&#39;organisation des chromosomes entiers dans des ovules de montage utilise la coloration de Feulgen 11-13. Elle implique une hydrolyse acide (en utilisant de l&#39;acide hypochloreux) de l&#39;ADN qui en résulte provoque la dénaturation des protéines et la destruction de la structure de la chromatine ainsi. Alternativement, l&#39;organisation des chromosomes dans méiocytes femmes et les cellules gamétophytiques peut être observée en utilisant la coloration DAPI et immunomarquage sur coupes semi-fines ou sacs embryonnaires disséqués et MMC (par exemple voir 14-18). Il est clair, cependant, la dissection manuelle et la coupe peut être beaucoup de travail etentrave sur l&#39;analyse qualitative et quantitative d&#39;un grand nombre d&#39;épitopes de la chromatine. Ici, nous fournissons un protocole efficace pour préparer un grand nombre d&#39;ovules Arabidopsis pour une variété de coloration cytologique en aval dans l&#39;ensemble du montage. En bref, les boutons floraux sont incubées dans une solution de fixation, des rangées de ovules sont disséqués du carpelle et intégrés dans l&#39;acrylamide sur la diapositive que fait pour méiocytes de pollen 19,20. Les ovules sont incorporés en outre compensées et fixés dans le méthanol, l&#39;éthanol, le xylène et avant la digestion de la paroi cellulaire et de perméabilisation. Des variations possibles de ces étapes sont décrites. Les échantillons peuvent ensuite être utilisés pour la coloration de l&#39;ADN, une immunocoloration et FISH. Le mode de préparation est efficace et permet parallèle expérimental (jusqu&#39;à 16 lames peuvent être préparés d&#39;une journée d&#39;analyse en aval différent). Les traitements décrits permettent signaux homogènes dans l&#39;ensemble du montage et bien conservés histologique, cellulaire,et l&#39;organisation nucléaire dans les cellules reproductrices et les cellules environnantes qui bénéficient nucellaires comparaisons qualitatives et quantitatives entre les types cellulaires. Calibré, l&#39;imagerie à haute résolution basée sur CLSM suivie d&#39;une reconstruction en 3 dimensions permet des mesures quantitatives significatives de signaux fluorescents. Nous avons utilisé avec succès cette procédure pour analyser la dynamique de la chromatine dans la console MMC de différenciation 21 et le développement gamétophyte femelle 22; Nous présentons ici des résultats représentatifs de l&#39;analyse de l&#39;hétérochromatine, immunologique de la chromatine, la GFP immunologique et FISH dans l&#39;ensemble du montage ovules. Nous croyons en outre que notre protocole sera adapté pour d&#39;autres tissus végétaux et des espèces.

<table><tbody><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BVO Tampon de fixation (basé sur32)</td><td></td><td></td><td>2 mM EGTA, pH 7,5, 1 % (v/v) formaldéhyde, 10 % DMSO, 1x PBS, 0,1 % Tween-20</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td>1x PBS, 0,1 % Tween-20</td></tr><tr><td>PBT-F</td><td></td><td></td><td>1x PBT, 2,5 % (v/v) formaldéhyde</td></tr><tr><td>30 % acrylamide :bisacrylamide</td><td></td><td></td><td>3 g d’acrylamide, 0,33 g de bisacrylamide, 1x PBS (préparer 10 ml, conserver à 4 &deg ; C)</td></tr><tr><td>200 ml 5 % d’acrylamide mélange dans du PBS</td><td></td><td></td><td>34 ml 30 % acrylamide :bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (à faire frais à partir de 30 % de stock)</td></tr><tr><td>20 % de persulfte</td><td></td><td></td><td>d’ammonium 0,2 g de persulfte d’ammonium, 1 ml d’eau stérile (préparer les aliquotes avec 1 ml et conserver à -20 &deg ; C)</td></tr><tr>sulfite <td></td><td></td><td>de sodium à 20 %</td><td>0,2 g de sulfite de sodium, 1 ml d’eau stérile (préparer des aliquotes avec 1 ml et conserver à -20 &deg ; C)</td></tr><tr>Mélange <td></td><td></td><td>d’enzymes de paroi cellulaire</td><td>0,5 % (p/v) de cellulase, 1 % (p/v) de driselase, 0,5 % (p/v) de pectolyase</td></tr><tr><td>Réactifs et matériaux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amaresco</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Schaurlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Schaurlau</td><td>ME03062500</td><td></td></tr><tr><td>Xylène</td><td>ROTH</td><td>4436.1</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase</td><td>Sigma</td><td>1794</td><td></td></tr><tr><td>Driselase</td><td>Sigma</td><td>D8037</td><td></td></tr><tr><td>pectolyase</td><td>Sigma</td><td>P5936</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck</td><td>8.22184.0500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>acrylamide</td><td>Sigma</td><td>A-3553</td><td></td></tr><tr><td>bisacrylamide</td><td>Sigma</td><td>M2022</td><td></td></tr><tr><td>persulfate d’ammonium</td> toxique <td>Sigma</td><td>A9164</td><td></td></tr><tr><td>Sulfite de sodium</td><td>Fluka</td><td>71988</td><td></td></tr><tr><td>Anti-triméthyl-histone H3 (Lys4)</td><td>Upstate</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>Anti-monométhyl-histone H3 (Lys27)</td><td>Upstate</td><td>07-448</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488~chèvre ~anti ~lapin (H+L)</td><td>Sonde moléculaire</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>ProlongGold</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>toxique</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>ARNASE toxique A</td><td>Roche</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>Coplin pot</td><td>Huber & CO</td><td>10.055</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td>DUMONT BIOLOGIE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Heidolph</td><td>543-12310-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Chambre</td><td></td><td></td> humide <td>Une boîte en plastique avec une serviette en papier humide à l’intérieur, un support en plastique est placé dans la boîte pour soutenir les toboggans et garder les toboggans hors de l’eau.</td></tr><tr><td>Toboggan Superfrost Plus</td><td>Thermo Fisher</td><td>J1800AMNZ</td><td>Menzel-Gl&auml ; ser</td></tr><tr><td>FISH Tag DNA KIt</td><td>Invitrogen</td><td>F32947</td><td></td></tr><tr><td>GFP booster</td><td>Chromotek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode efficace pour quantitative, analyse unicellulaire de la chromatine modification et architecture nucléaire dans l&#39;ensemble du montage ovules dans<em&gt; arabidopsis</em

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

Chez les plantes à fleurs, la transition du destin cellulaire somatique à la reproduction est marquée par la spécification des cellules mères de spores (SMC) dans les organes floraux de la plante adulte. Le SMC femelle (cellule mère de mégaspore, MMC) distingue dans l&#39;ébauche ovule et subit la méiose. Le mégaspore haploïde sélectionné est ensuite soumis à la mitose pour former le gamétophyte femelle multicellulaire, qui donnera naissance aux gamètes, l&#39;ovule et la cellule centrale, avec des cellules accessoires. L&#39;accessibilité limitée de la console MMC, meiocyte et gamétophyte femelle à l&#39;intérieur de l&#39;ovule est techniquement difficile pour cytologique et cytogénétique des analyses au niveau d&#39;une seule cellule. En particulier, immunodétection directe ou indirecte d&#39;épitopes cellulaires ou nucléaires est affaiblie par la faible pénétration des réactifs à l&#39;intérieur de l&#39;imagerie cellulaire végétale et une seule cellule est affermé par le manque de clarté optique dans l&#39;ensemble du montage tissus. Ainsi, nous avons développé une méthode efficace pour analyser les nucll&#39;organisation de l&#39;oreille et la modification de la chromatine à haute résolution de la cellule unique dans l&#39;ensemble du montage ovules d&#39;Arabidopsis embarqués. Il est basé sur la dissection et l&#39;incorporation d&#39;ovules fixes dans une fine couche de gel d&#39;acrylamide sur une lame de microscope. Les ovules embarqués sont soumis à des traitements chimiques et enzymatiques visant à améliorer la clarté des tissus et de la perméabilité des réactifs d&#39;immunomarquage. Ces traitements préserver organisation, ADN et de protéines épitopes cellulaires et la chromatine. Les échantillons peuvent être utilisés pour différentes analyses cytologiques aval, y compris la chromatine immunocoloration, l&#39;hybridation in situ par fluorescence (FISH), et la coloration de l&#39;ADN pour l&#39;analyse de l&#39;hétérochromatine. La microscopie confocale à balayage laser (CLSM), l&#39;imagerie à haute résolution, suivie d&#39;une reconstruction 3D permet des mesures quantitatives à seule cellule de résolution.

Nous fournissons un protocole robuste pour la préparation à grande échelle et le traitement des ovules Arabidopsis appropriés pour la coloration cytologique dans l&#39;ensemble du montage. Merci à l&#39;encastrement, les ovules conservent une structure en 3 dimensions (Figure 3). En outre, le traitement des tissus, y compris la clarification optique permet des structures sous-cellulaires d&#39;imagerie à haute résolution. Figure 4 montre coloration de l&#39;ADN dans l&#39;ovule...

Nous fournissons ici un protocole efficace et fiable pour immunologique, hybridation fluorescente in situ, la coloration de l&#39;ADN suivie quantitative, imagerie à haute résolution dans des ovules d&#39;Arabidopsis thaliana l&#39;ensemble du montage. Cette méthode a été utilisée avec succès pour analyser des modifications de la chromatine nucléaire et de l&#39;architecture.

Une méthode efficace pour quantitative, analyse unicellulaire de la chromatine Modification et architecture nucléaire dans l&#39;ensemble du montage ovules dans<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

L'objectif général de cette procédure est de préparer des vues d'Arabidopsis pour l'hybridation in situ et l'immunomarquage en montage entier. Cela est réalisé en fixant d'abord des boutons floraux frais dans une solution de fixation. La deuxième étape consiste à disséquer soigneusement les vues et à les inclure dans des pastilles miniatures d'acrylamide directement sur des lames de microscope.L'étape suivante du traitement des tissus permet la clarification et la perméabilisation du tissu. La dernière étape consiste à incuber les échantillons traités avec une solution d'anticorps pour la coloration immunohistochimique ou avec une sonde marquée pour l'hybridation in situ en deux dimensions fluorescente. Enfin, une imagerie confocale à haute résolution suivie d'une reconstruction tridimensionnelle permet une analyse quantitative en montage complet au niveau de la cellule unique.Cette méthode a été initialement utilisée pour obtenir des informations sur l'organisation du CT dans la vue, mais elle pourrait également être appliquée pour analyser d'autres compartiments cellulaires dans d'autres tissus du plongeon et chez d'autres organismes modèles. Dans des tubes microfuge remplis de tampon BBO fraîchement préparé, refroidi sur glace, placez 20 à 30 carpes par tube, puis mettez les tubes à agiter doucement à température ambiante pendant une demi-heure. Ensuite, centrifugez les tubes pendant une minute à 400 G. Aspirez ensuite soigneusement les surnageants, jetez-les, et ajoutez un millilitre de PBT aux carpes. Placez les tubes sur glace pour chaque tube de carpes à monter.Préparer sur glace. Cinq tubes contenant 200 microlitres. Un mélange fraîchement préparé d'acrylamide à 5 %.Cinq lames super frost propres étiquetées au crayon, une solution Eloqua de 20 % de PS et une solution Eloqua de 20 % de NAPS provenant d'un tube de carpes. Prélevez quatre ou cinq avec une extrémité coupée et déposez-les chacune sur une lame. Éliminez le liquide en excès en pipetant soigneusement à l’aide d’aiguilles fines.Effectuez des incisions longitudinales dans les os du carpe et retirez les parois carpiennes afin de libérer les rangées de vues. Cette étape nécessitera de la pratique. Évitez le dessèchement des vues en ajoutant jusqu'à 10 microlitres de PBS, puis transférez-les dans un tube microfuge contenant le mélange d'acrylamide.Ajouter rapidement 12 microlitres de NAPS et 12 microlitres de PS. Bien mélanger la solution par pipetage, puis ajouter rapidement 30 microlitres d'acrylamide activée. Répartir le mélange sur une lame contenant des vues disséquées. Déposer délicatement une petite lame couvre-objet sur la préparation et laisser polymériser la solution à température ambiante pendant environ une heure.Préparez chaque lame de cette manière ultérieurement. Utilisez une lame de rasoir pour détacher les lamelles. Les échantillons peuvent être conservés une nuit à quatre degrés Celsius dans un bocal Coplin contenant du PBS ou être traités directement sans interruption.Le traitement doit généralement être effectué dans des bocaux Coplan contenant 80 millilitres de solution, et sous la hotte aspirante. Commencez par clarifier les tissus par incubation dans une série de solutions composée de méthanol, d'éthanol, d'une solution d'éthanol et de xylène en rapport de un pour un, puis à nouveau d'éthanol et de méthanol.Chaque bain dure cinq ou 30 minutes. Consulter le protocole écrit. Ensuite, utiliser une solution de PBT-méthanol à un pour un avec 2,5 % de formaldéhyde pendant 15 minutes.Ensuite, rincez le tissu dans du PBT deux fois pendant 10 minutes par bain. Après cela, les lames peuvent être conservées toute la nuit à quatre degrés Celsius si nécessaire. Ensuite, prenez jusqu'à six lames provenant du flacon et éliminez le liquide en excès.Placez-les sur un morceau de papier absorbant et ajoutez rapidement 100 microlitres d'une enzyme de digestion de la paroi cellulaire refroidie. Mélangez sur les supports. Ensuite, recouvrez les lames avec de grandes lamelles.Incuber les lames pendant deux heures à 37 degrés Celsius dans une chambre humide. Il est important d'optimiser la température de digestion au CO pour chaque nouvelle solution enzymatique, car cette étape est cruciale pour obtenir une coloration homogène ultérieurement. Rincer les lames deux fois avec du PBT, cinq minutes par rinçage.Ensuite, égouttez les porte-objets, un par un. Ajoutez 100 microlitres de RNAs A dans du PBS complété avec 1 % de Tween et incubez les porte-objets pendant une heure à 37 degrés Celsius dans une chambre humide. Après l'incubation, lavez les porte-objets deux fois avec du PBT comme précédemment, puis fixez à nouveau le tissu en incubant les porte-objets dans un bain de PBTF fraîchement préparé pendant 20 minutes. Rincez le PBTF par un lavage au PBT pendant 10 minutes.Procéder ensuite à la perméabilisation du tissu en incubant les lames dans du PBS contenant 2 % de Tween pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Effectuer deux lavages dans du PBT de cinq minutes chacun pour éliminer la solution de perméabilisation. Puis poursuivre avec la coloration immunohistochimique.Commencez par incuber les lames dans l'anticorps primaire d'intérêt. Appliquez des aliquots de 100 microlitres d'anticorps dilué dans du PBS contenant 0,2 % de Tween sur chaque lame. Transférez les lames dans une chambre humide et incubez-les à quatre degrés Celsius pendant 12 à 24 heures.Laver les lames dans un bain de PBT pendant deux à quatre heures avec agitation douce à température ambiante. Ensuite, ajouter 100 microlitres d'anticorps secondaire dilué au 1/200 dans du PBS avec 0,2 % entre 20 et incuber les lames pendant 24 heures à quatre degrés Celsius. Un bain d'une heure dans le PBT avec agitation douce suffit pour éliminer l'anticorps secondaire non lié des lames.Ensuite, contre-colorer l'ADN avec une solution de 10 microgrammes par millilitre d'iodure de propidium dans du PBS. Laisser le coloration se poursuivre pendant 15 minutes, puis laver les lames avec du PBT en agitant doucement pendant 15 minutes à température ambiante. Monter ensuite les lames avec un milieu anti-fade enrichi de 10 microgrammes par millilitre d'iodure de propidium.Après avoir laissé reposer pendant une heure, observer les lames au microscope confocal à l’aide d’un objectif à immersion en glycérol de 63 x. Lors de l’acquisition des images, il est essentiel de maintenir les paramètres de balayage identiques entre les échantillons afin de permettre une quantification comparative, et d’utiliser un mode de détection linéaire. Par la suite, reconstruire les images en série en structures tridimensionnelles, délimiter chaque noyau d’intérêt et utiliser un logiciel de traitement d’images 3D pour quantifier les signaux.Grâce à ce protocole fiable de préparation à grande échelle, les échantillons entiers conserveront leur structure tridimensionnelle. Les structures subcellulaires deviennent visibles avec un haut niveau de détail, comme on peut l'observer avec la chromatine. Lors de la coloration de l'ADN, l'hétérochromatine apparaît sous forme de foyers brillants et bien définis, sans nécessiter d'application de déconvolution.Ce protocole permet une immunomarquage parallèle à l’aide de plusieurs anticorps en un seul cycle. Par exemple, la marque pérmissive associée à la chromatine U, la triméthyllysine quatre de l’histone H trois, et la marque associée à l’hétérochromatine, la monométhyllysine 27 de l’histone H trois, ont toutes deux été détectées dans une même expérience sur des lames répliquées distinctes afin d’analyser la dynamique de la chromatine. Une autre technique compatible est l’hybridation in situ fluorescente ou FISH (fluorescent in situ hybridization) ciblant l’ARN ribosomique 45 S.Les répétitions d'ADN ont été utilisées pour définir les régions d'organisation nucléaire. La sonde a été marquée directement avec l'Alexa 488, et l'ADN a été contre-coloré pour l'analyse d'identification. Il est très important de tester différentes dilutions d'anticorps et différents temps d'incubation afin de déterminer les conditions permettant d'obtenir un signal robuste et homogène avec un fond aussi faible que possible, ainsi qu'une faible concentration d'anticorps.Étant donné que cette méthode permet une excellente préservation du tissu et une perméabilisation optimale pour l'analyse en cellule unique de l'organisation de la chromatine, elle ouvre la voie aux chercheurs en biologie cellulaire végétale ou en épigénétique végétale pour étudier l'organisation nucléaire ou subcellulaire au niveau de la cellule unique et dans le contexte de l'organisme entier.

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