Name: Évaluation de létat de fertilisation par la recherche de la morphologie nucléaire du sperme dans la double fécondation de larabidopsise (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 s
Description: Découvrez une méthode d'évaluation de la fécondation chez Arabidopsis par l'analyse de la morphologie nucléaire du sperme. Cette technique permet une collecte rapide de données pour l'analyse fonctionnelle des régulateurs de la fécondation.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par la subvention kaKENHI de la Japan Society for the Promotion of Science (JP17H05832 à T. I.) et par le financement du Programme de promotion de la recherche prioritaire stratégique sur les sciences moléculaires des plantes phytochimiques de l'Université chiba (Japon).

1. Pollinisation artificielle
REMARQUE: Avant de commencer le processus, une paire de forceps no 5 est nécessaire.
<ol><li>Cultivez A. thaliana (Col-0) à 22 oC sous un cycle sombre de 16 h/8 h dans une chambre de croissance. REMARQUE: Couper et enlever la première tige de fleur développée avec des ciseaux pour favoriser le développement des bourgeons axillaires. Les plantes en croissance vigoureuse (2-3 semaines après la coupe de la première tige; hauteur de la plante d'environ 25 cm) sont propices à l'analyse.</li>
	<li>Pour émasculer, enlever le sépale (figure 1B), le pétale (figure 1C) et l'étamine (figure 1D) des bourgeons floraux au stade 118 (figure 1A) à l'aide de 5 forceps. Bud avec des morceaux de pétales vus au sommet est le meilleur. REMARQUE: Utilisez une ligne de marqueur de gamètes femelle sémino-femelle appropriée. Dans ce protocole, nous avons utilisé une plante de type sauvage comme parent femelle.</li>
	<li>Quinze à dix-huit heures après l'émasculation, prenez l'étamine d'une fleur DMP9KD/HTR10-mRFP au stade 138 en pinçant le filament avec des forceps.</li>
	<li>Pour polliniser, tapoter doucement la stigmatisation d'un pistil émasculé plusieurs fois avec une anthère décente.</li>
</ol>2. Préparation de l'Ovule pour l'observation
REMARQUE: Les éléments suivants sont nécessaires : un verre coulissant avec du ruban adhésif recto-verso, des forceps no 5, une aiguille d'injection de 27 G et un microscope à disséquer.
<ol><li>7 à 8 h après la pollinisation (HAP), recueillir le pistil et le placer sur la bande à double face, puis appuyez doucement avec des forceps pour fixer le pistil sur la bande (Figure 2A, A'). REMARQUE: La plupart des ovules dans un pistil reçoivent au moins un tube de pollen 10 HAP9. Si les deux ou l'un des spermatozoïdes du premier tube de pollen ne parviennent pas à féconder, un deuxième tube de pollen serait attiré par l'ovule en raison du système de récupération de fécondation10. Pour analyser la morphologie des noyaux de sperme à partir du premier tube de pollen, il est recommandé de terminer la préparation des ovules par 10 HAP au plus tard.</li>
	<li>Couper les extrémités supérieure et inférieure de l'ovaire à l'aide d'une aiguille d'injection sous un microscope à disséquer (figure2B, B').</li>
	<li>Éteindre la paroi de l'ovaire le long des deux côtés du replum (Figure 2C, C') en déplaçant la pointe de l'aiguille d'injection. REMARQUE: Insérez l'aiguille d'injection à peu de profond soudeur pour empêcher la séparation des ovules du septum.</li>
	<li>Evert la paroi de l'ovaire en utilisant l'aiguille d'injection (Figure 2D, D').</li>
	<li>Pincez la base du septum à laquelle les ovules sont connectés, et soulevez-le soigneusement avec des forceps (Figure 2E).</li>
	<li>Transférer les ovules dans une goutte d'eau sur un verre coulissant, et couvrir délicatement d'un verre de couverture pour observation sous un microscope à fluorescence (Figure 2E, E').</li>
</ol>3. Microscopie
REMARQUE: Dans ce protocole, nous avons utilisé un microscope épifluorescence équipé d'un cube de filtre à fluorescence (voir Tableau des matériaux),d'un appareil photo numérique et du logiciel d'accompagnement.
<ol><li>Acquérir des images d'ovules contenant des noyaux de sperme étiquetés avec mRFP à l'aide d'une lentille objective 20x ou 40x et l'appareil photo numérique équipé.</li>
	<li>Confirmer le nombre de noyaux de sperme étiquetés mRFP dans un sac d'embryons. REMARQUE: Les ovules contenant deux noyaux de sperme étiquetés mRFP peuvent être inclus dans la taille de la population pour l'analyse statistique.</li>
	<li>Confirmer la forme et la position de chaque noyau de sperme étiqueté mRFP dans un sac d'embryon. REMARQUE: Immédiatement après avoir été libéré d'un tube de pollen, une paire de noyaux de sperme condensés mRFP-étiquetés sont localisés entre l'oeuf et la cellule centrale. Un noyau de sperme décondensé mRFP-étiqueté détecté au côté de l'extrémité de chalazal indique la fertilisation centrale de cellules, par exemple. En utilisant une ligne de marqueur de membrane de gamète femelle appropriée, comme indiqué dans la figure supplémentaire 1, si oui ou non le spermatozoïde subit la plasmogamy (après fusion de membrane mais avant karyogamy) peut être surveillé clairement.</li>
</ol>

<ol><li>Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamete+dialogs+in+green+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Gamete dialogs in green lineages.</a> Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).</li>
<li>Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+mechanisms+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization mechanisms in flowering plants.</a> Current Biology. 26, R125-R139 (2016).</li>
<li>Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENERATIVE+CELL+SPECIFIC+1+is+essential+for+angiosperm+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization.</a> Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).</li>
<li>von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+HAP2+%28GCS1%29+is+a+sperm-specific+gene+required+for+pollen+tube+guidance+and+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization.</a> Development. 133, 4761-4769 (2006).</li>
<li>Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamete+attachment+requires+GEX2+for+successful+fertilization+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis.</a> Current Biology. 24, 170-175 (2014).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+male+gamete+membrane+protein+DMP9%2FDAU2+is+required+for+double+fertilization+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants.</a> Development. 145, dev170076(2018).</li>
<li>Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+dynamics+of+HISTONE3+variants+between+the+two+fertilization+products+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants.</a> Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+flower+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li>
<li>Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+recovery+system+is+dependent+on+the+number+of+pollen+grains+for+efficient+reproduction+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signaling+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants.</a> Plant Signaling & Behavior. 8, e23690(2013).</li>
<li>Kasahara, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+recovery+after+defective+sperm+cell+release+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis.</a> Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).</li>
<li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+of+two+sperm+cells+during+double+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 21, 497-502 (2011).</li>
<li>Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gamete+membrane+dynamics+during+double+fertilization+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis.</a> Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

HTR10-mRFP étiquette la chromatine paternelle (c.-à-d., visualise les noyaux de spermatozoïdes), et la dynamique dans la double fécondation ont été rapportés7. Immédiatement après la libération d'un tube de pollen, les noyaux de sperme HTR10-mFP-étiquetés sont toujours condensés. Cependant, chacun des noyaux de sperme est décondensé en fusionnant avec un noyau de gamète femelle fertilisé à la karyogamy trois à quatre heures après fusion de membrane de gamète7. Les spermatoz...

Les plantes à fleurs produisent des graines par double fécondation, un processus qui est directement contrôlé par les interactions entre les protéines localisées sur la membrane plasmatique gamète1,2. Les gamètes mâles de plante de floraison, une paire de spermatozoïdes, se développent dans le pollen. Un tube de pollen qui se développe après la pollinisation fournit une paire de spermatozoïdes aux gamètes femelles, un ovule et une cellule centrale, qui se développent dans un sac d'embryon. Après la rencontre des gamètes mâles et femelles, les protéines sur la surface du gamète favorisent la reconnaissance, l'attachement et la fusion pour compléter la double fécondation. Dans des études antérieures, les protéines mâles de membrane de gamètegenerative CELL SPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)3,4 et GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)5 ont été identifiées comme régulateurs de fertilisation impliqués dans la fusion de gamètes et attachement, respectivement. Nous avons récemment identifié une protéine membranaire spécifique au gamète mâle, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), en tant que régulateur de fertilisation impliqué dans l'interaction gamète. Nous avons constaté qu'une diminution de l'expression de DMP9 a comme conséquence l'inhibition significative de la fertilisation de cellules d'oeuf pendant la double fertilisation dans A. thaliana6.
Comme la double fécondation se produit dans un sac d'embryon, qui est incorporé dans un ovule qui est encore enveloppé avec le tissu d'ovaire, il est difficile d'observer et d'analyser les états des processus de double fécondation. Pour cette raison, il y a encore beaucoup de points peu clairs qui entravent une compréhension complète du mécanisme entier de contrôle de double fertilisation. La mise en place de techniques d'observation pour retracer le comportement des gamètes lors de la double fécondation dans des conditions in vivo est indispensable à l'analyse fonctionnelle des candidats potentiels pour les régulateurs de fécondation. Des études récentes ont donné des lignes de marqueur où les structures sous-cellulaires gamètes sont étiquetées avec des protéines fluorescentes. Dans cet article, nous démontrons un protocole simple et rapide pour observer la double fertilisation qui s'est produite dans un sac d'embryon dérivé des pistils artificiellement pollinisés. L'utilisation de la ligne de marqueurde noyau de cellules de sperme HTR10-mRFP 7, l'état de fertilisation de chaque gamète femelle peut être discriminé sur la base de la morphologie nucléaire de signal de sperme. Notre protocole se concentrant sur un tel changement morphologique des noyaux de sperme à la fertilisation peut obtenir efficacement une quantité suffisante de données pour la preuve statistique. Une ligne DMP9-knockdownavec hTR10-mRFP fond (DMP9KD/HTR10-mRFP) a été utilisé comme plantes mâles pour montrer un modèle de fertilisation unique. Le protocole convient également à l'analyse fonctionnelle d'autres organismes de réglementation de la fertilisation.

<table><tbody><tr><td>BX51</td><td>Olympus</td><td></td><td>Microscope à épifluorescence</td></tr><tr><td>Verre de couverture Verre</td><td>Matsunami</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>DMP9KD/HTR10-mRFP</td><td></td><td></td><td>Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6</td></tr><tr><td>Ruban adhésif</td> <td>double faceNichiban</td><td>NW-15S</td><td>15 mm largeur</td></tr><tr><td>DP72</td><td>Olympus</td><td></td><td>Caméra dégitale</td></tr><tr><td>Pince</td><td>Vigor</td><td></td><td>N° 5 des pinces sont disponibles</td></tr><tr>Chambre<td>de croissance</td><td>Nihonika</td><td>LPH-411PFQDT-SP</td><td></td></tr><<tr><td>em>HTR10-mRFP</td><td></td><td></td><td>Arabidopsis thaliana, écotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. ( 2007)7</td></tr><tr><td>Aiguille d’injection</td><td>Terumo</td><td>NN-2719S</td><td>27 G</td></tr><tr><td>Verre diapositive</td><td>Verre Matsunami</td><td>S9443</td><td></td></tr><tr><td>SZX9</td><td>Olympus</td><td></td><td>Microscope de dissection</td></tr><tr><td>U-MRFPHQ</td><td>Olympus</td><td></td><td>Fluorescence Filter Cube (Excitation : BP535-555, Émission : BA570-625, Miroir dichromatique : DM565)</td></tr><tr><td>UPlanFL N 40x</td><td>Olympus</td><td></td><td>Objectif (NA 1,3),</td></tr><tr><td>UPlanSApo 20x</td> à immersion dans l’huile <td>Objectif Olympus</td><td></td><td>(NA 0,75), sec</td></tr></tbody></table>

Évaluation de l'état de fertilisation par la recherche de la morphologie nucléaire du sperme dans la double fécondation de l'arabidopsise

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Les plantes à fleurs ont un système unique de reproduction sexuelle appelé « double fécondation », dans lequel chacun des spermatozoïdes fusionne précisément avec un ovule ou une cellule centrale. Ainsi, deux événements de fécondation indépendants ont lieu presque simultanément. L'ovule fécondé et la cellule centrale se développent en zygote et endosperme, respectivement. Par conséquent, un contrôle précis de la double fécondation est essentiel pour le développement des semences qui s'ensuit. La double fécondation se produit dans le gamétophyte femelle (sac d'embryon), qui est profondément caché et couvert de tissus épais d'ovule et d'ovaire. Cette construction de tissu de pistil rend l'observation et l'analyse de la double fertilisation tout à fait difficile et a créé la situation actuelle dans laquelle beaucoup de questions concernant le mécanisme de double fertilisation restent sans réponse. Pour l'évaluation fonctionnelle d'un candidat potentiel pour l'organisme de réglementation de la fécondation, l'analyse phénotypique de la fécondation est importante. Pour juger de l'achèvement de la fécondation dans Arabidopsis thaliana, les formes des signaux de fluorescence étiquetant les noyaux de sperme sont utilisés comme indicateurs. Un spermatozoïde qui ne parvient pas à féconder est indiqué par un signal de fluorescence condensé à l'extérieur des gamètes femelles, tandis qu'un spermatozoïde qui féconde avec succès est indiqué par un signal décondensé dû à la karyogamy avec le noyau des gamètes femelles. La méthode décrite ici fournit un outil pour déterminer la fécondation réussie ou échouée dans des conditions in vivo.

Des ovules d'un pistil pollinisé avec DMP9KD/HTR10-mRFP ont été rassemblés à 7-8 HAP et observés.
La plupart des ovules contenaient deux noyaux de sperme décondensés étiquetés mRFP à l'ovule (côté micropylar) et à la cellule centrale (côté de l'extrémité charazal) positions du noyau, respectivement (Figure 3A), indiquant une double fécondation réussie. En outre, des ovules conte...

Nous démontrons une méthode pour déterminer la fertilisation réussie ou échouée sur la base de la morphologie nucléaire de sperme dans la double fertilisation d'Arabidopsis utilisant un microscope d'épifluorescence.

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Ce protocole fournit un moyen d’évaluer la participation d’un certain facteur à la double fécondation de l’arabidopsie. Le statut de fécondation peut être jugé par la morphologie des noyaux de sperme en un coup d’œil, de sorte que l’obtention rapide des données pour l’analyse statistique est possible. Cette méthode est spécifique à l’évaluation du phénotype de fécondation dans Arabidopsis.Il existe encore des régulateurs de fécondation inconnus, même si dans Arabidopsis. Cette méthode serait utile pour l’analyse fonctionnelle des futurs facteurs de fécondation inconnus. Maîtriser l’habileté d’une manipulation rapide et intacte des ovules est important pour le succès de cette analyse.Pour commencer, cultivez Arabidopsis thaliana à 22 degrés Celsius sous une lumière de 16 heures et un cycle sombre de huit heures dans une chambre de croissance. Couper et enlever la première tige de fleur développée avec des ciseaux pour favoriser le développement des bourgeons axillaires. Deux à trois semaines après avoir coupé la première tige, mesurez la hauteur de la plante.Les plantes dont la hauteur est supérieure à 25 centimètres sont considérées comme des plantes en croissance vigoureuse et conviennent à l’analyse. Pour émasculer, recherchez les bourgeons à l’étape 11 avec des morceaux de pétales vus au sommet. Utilisez un nombre cinq forceps pour enlever le sépale, le pétale et l’étamine des boutons floraux.15 à 18 heures après l’émasculation, prendre l’étamine d’une ligne de knockdown DMP9 avec fond de fleur HTR10-mRFP au stade 13 en pinçant le filament avec des forceps. Pour polliniser, tapoter doucement la stigmatisation d’un pistil émasculé à plusieurs reprises avec une anthère déhiscente. Sept à huit heures après la pollinisation, recueillir le pistil et le placer sur le ruban adhésif à double face.Ensuite, appuyez doucement avec des forceps pour fixer le pistil sur la bande. Sous un microscope disséquant, couper les extrémités supérieure et inférieure de l’ovaire à l’aide d’une aiguille d’injection. Déplacez la pointe de l’aiguille d’injection pour trancher la paroi de l’ovaire le long des deux côtés du replum.Couper soigneusement afin de ne pas séparer le funiculus et le tractus de transmission. Evert le mur de l’ovaire. Pincez la base du septum à laquelle les ovules sont reliés, et soulevez-la soigneusement avec des forceps.Transférer les ovules dans une goutte d’eau sur un verre à glissière, et couvrir délicatement d’un verre de couverture pour observation au microscope à fluorescence. Sur un microscope d’épifluorescence équipé d’un cube de filtre à fluorescence, réglez la lentille objective à 20x ou 40x. Acquérir des images des ovules contenant des noyaux de sperme étiquetés avec mRFP.Confirmer le nombre de noyaux de sperme étiquetés mRFP dans un sac embryonnaire. Confirmer la forme et la position de chaque noyau de sperme étiqueté mRFP dans un sac embryonnaire. Dans cette étude, les phénotypes de fertilisation ont été jugés par morphologie nucléaire de signal de sperme dans l’ovule.La plupart des ovules contenaient deux noyaux de sperme décondensés étiquetés mRFP du côté micropylaire des ovocytes et du côté central de l’extrémité charazale des cellules. Cela indique une double fécondation réussie. En outre, des ovules contenant un noyau de sperme décondensé étiqueté mRFP au noyau central de cellules plus un noyau condensé de sperme mRFP-étiqueté à l’extérieur du cellule d’oeuf ont été observés, indiquant la fertilisation simple.Dans le cas d’une double fécondation infructueuse, deux noyaux de sperme condensés étiquetés mRFP ont été observés à la limite de l’ovule et de la cellule centrale. Dans l’analyse utilisant la ligne de knockdown de DMP9 avec l’arrière-plan du pollen de HTR10-mRFP, des ovules contenant un noyau condensé de sperme mRFP-étiqueté ou trois noyaux de sperme mRFP-étiquetés ou plus ont été rarement observés. En combinaison avec l’utilisation de lignées de marqueurs femelles, l’état de fécondation plus précis peut être analysé.Par exemple, le statut de fécondation après la fusion des gamete et avant la karyogamie peut être jugé. Oui, le processus de fécondation est divisé en plusieurs étapes. Les questions auxquelles chaque organisme de réglementation de la fécondation a participé et à quelles étapes peut être répondue grâce à cette méthode améliorée.Il fournirait un aperçu plus approfondi de la reproduction sexuelle de la plante.

evaluation-fertilization-state-tracing-sperm-nuclear-morphology

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

L'imprinting est un phénomène dans l'usine et la reproduction des mammifères. Méthylation de l'ADN joue un rôle important dans les mécanismes de l'empreinte. Isoler l'endosperme et la détermination du statut de méthylation de gènes soumis à empreinte dans...

Détermination de méthylation de l&#39;ADN des gènes soumis à empreinte dans les Arabidopsis Endosperme

Une quête fondamentale en biologie cellulaire est de définir les mécanismes qui sous-tendent l'identité des organites qui rendent les cellules eucaryotes. Nous proposons ici une méthode pour identifier les gènes responsables de l'intégrité morphologique et fonctionnelle des organites de plantes en utilisant la microscopie à fluorescence et des outils de séquençage de prochaine génération.

Fluorescence microscopie dépistage et séquençage de prochaine génération: des outils utiles pour l&#39;identification des gènes impliqués dans des organites intégrité

Nous rapportons une méthode simple et efficace pour isoler les embryons aux premiers stades de développement...

Isolation efficace et rapide des embryons à un stade précoce de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Graines

Nous fournissons ici un protocole efficace et fiable pour immunologique, hybridation fluorescente in situ, la coloration de l'ADN suivie quantitative, imagerie à haute résolution dans des ovules d'Arabidopsis thaliana l'ensemble du montage. Cette méthode a été utilisée avec succès pour analyser des modifications de la chromatine nucléaire et de l'architecture.

Une méthode efficace pour quantitative, analyse unicellulaire de la chromatine Modification et architecture nucléaire dans l&#39;ensemble du montage ovules dans<em&gt; Arabidopsis</em

Ce protocole décrit une méthode permettant d’observer l’embryogenèse chez Arabidopsis via clairance ovule, suivie par l’inspection de la formation embryonnaire sous un microscope.

Une méthode de caractérisation de l’embryogenèse chez Arabidopsis

Ce manuscrit décrit une in vitro ovule méthode de culture qui permet l’imagerie de cellules vivantes des Arabidopsis zygotes et des embryons. Cette méthode est utilisée pour visualiser la dynamique intracellulaire au cours de la polarisation du zygote et la spécification des cellules sort dans le développement des embryons.

In Vitro Culture de l’ovule pour vivre-cellule d’imagerie du Zygote polarisation et structuration d’embryon chez Arabidopsis thaliana

Dans ce protocole, nous décrivent des techniques pour la dissection appropriée d’Arabidopsis fleurs et siliques, quelques techniques de base de compensation et sélectionné les procédures pour les observations d’entier-montent des structures reproductrices de coloration.

Entier-Montez de compensation et la coloration des Siliques et organes fleur Arabidopsis

Ici, nous décrivons une amélioration de la méthode semi-in vitro (SIV) pour observer le guidage et la réception du tube pollinique chez Arabidopsis thaliana, ce qui augmente la réceptivité des ovules. La méthode SIV cum septum à haut débit peut être couplée à des lignées marqueurs gamétophytes et à des biocapteurs génétiquement codés pour surveiller le processus dynamique de fécondation.

Imagerie en direct de la réception du tube pollinique d’Arabidopsis et de la double fécondation à l’aide de la méthode semi-in vitro cum septum

Une méthode améliorée pour mesurer les profils d’hydratation du pollen chez Arabidopsis thaliana est décrite ici. La nouvelle méthode offre une résolution plus élevée, est non invasive et est hautement reproductible. Le protocole représente un nouvel outil pour une dissection plus fine des processus qui régulent les premiers stades de la pollinisation.

Un essai biologique in vivo à haute résolution sur l’hydratation du pollen à grain unique pour Arabidopsis thaliana

Ce protocole décrit la préparation d’échantillons intacts de la couche de cellules de l’endosperme dans les graines d’Arabidopsis thaliana . La méthode ne nécessite que l’équipement de laboratoire courant, tel qu’une aiguille d’injection et des pinces de précision, et permet l’imagerie fluorescente haute résolution de cellules vivantes de cellules endospermiennes dans les graines en développement et matures.

Préparation de tissu intact pour l’analyse microscopique de la couche de cellules de l’endosperme dans des graines d’Arabidopsis en développement et matures

Le mouvement des chromosomes au cours de la prophase méiotique est un phénomène mal compris qui est fondamental pour la formation des spores. Ce protocole décrit une méthode pour acquérir, analyser et quantifier les mouvements du centromère au cours de la prophase méiotique chez les méiocytes mâles d’Arabidopsis thaliana .

Caractérisation par imagerie en direct des mouvements du centromère au cours de la prophase méiotique mâle chez Arabidopsis thaliana

Découvrez une méthode d'évaluation de la fécondation chez Arabidopsis par l'analyse de la morphologie nucléaire du sperme. Cette technique permet une collecte rapide de données pour l'analyse fonctionnelle des régulateurs de la fécondation.

Évaluation de létat de fertilisation par la recherche de la morphologie nucléaire du sperme dans la double fécondation de larabidopsise (Vidéo) | JoVE Journal

Évaluation de l'état de fertilisation par la recherche de la morphologie nucléaire du sperme dans la double fécondation de l'arabidopsise

Explorer plus de vidéos