Évaluation de l'état de fertilisation par la recherche de la morphologie nucléaire du sperme dans la double fécondation de l'arabidopsise

Nous démontrons une méthode pour déterminer la fertilisation réussie ou échouée sur la base de la morphologie nucléaire de sperme dans la double fertilisation d'Arabidopsis utilisant un microscope d'épifluorescence.

Ce protocole fournit un moyen d’évaluer la participation d’un certain facteur à la double fécondation de l’arabidopsie. Le statut de fécondation peut être jugé par la morphologie des noyaux de sperme en un coup d’œil, de sorte que l’obtention rapide des données pour l’analyse statistique est possible. Cette méthode est spécifique à l’évaluation du phénotype de fécondation dans Arabidopsis.

Il existe encore des régulateurs de fécondation inconnus, même si dans Arabidopsis. Cette méthode serait utile pour l’analyse fonctionnelle des futurs facteurs de fécondation inconnus. Maîtriser l’habileté d’une manipulation rapide et intacte des ovules est important pour le succès de cette analyse.

Pour commencer, cultivez Arabidopsis thaliana à 22 degrés Celsius sous une lumière de 16 heures et un cycle sombre de huit heures dans une chambre de croissance. Couper et enlever la première tige de fleur développée avec des ciseaux pour favoriser le développement des bourgeons axillaires. Deux à trois semaines après avoir coupé la première tige, mesurez la hauteur de la plante.

Les plantes dont la hauteur est supérieure à 25 centimètres sont considérées comme des plantes en croissance vigoureuse et conviennent à l’analyse. Pour émasculer, recherchez les bourgeons à l’étape 11 avec des morceaux de pétales vus au sommet. Utilisez un nombre cinq forceps pour enlever le sépale, le pétale et l’étamine des boutons floraux.

15 à 18 heures après l’émasculation, prendre l’étamine d’une ligne de knockdown DMP9 avec fond de fleur HTR10-mRFP au stade 13 en pinçant le filament avec des forceps. Pour polliniser, tapoter doucement la stigmatisation d’un pistil émasculé à plusieurs reprises avec une anthère déhiscente. Sept à huit heures après la pollinisation, recueillir le pistil et le placer sur le ruban adhésif à double face.

Ensuite, appuyez doucement avec des forceps pour fixer le pistil sur la bande. Sous un microscope disséquant, couper les extrémités supérieure et inférieure de l’ovaire à l’aide d’une aiguille d’injection. Déplacez la pointe de l’aiguille d’injection pour trancher la paroi de l’ovaire le long des deux côtés du replum.

Couper soigneusement afin de ne pas séparer le funiculus et le tractus de transmission. Evert le mur de l’ovaire. Pincez la base du septum à laquelle les ovules sont reliés, et soulevez-la soigneusement avec des forceps.

Transférer les ovules dans une goutte d’eau sur un verre à glissière, et couvrir délicatement d’un verre de couverture pour observation au microscope à fluorescence. Sur un microscope d’épifluorescence équipé d’un cube de filtre à fluorescence, réglez la lentille objective à 20x ou 40x. Acquérir des images des ovules contenant des noyaux de sperme étiquetés avec mRFP.

Confirmer le nombre de noyaux de sperme étiquetés mRFP dans un sac embryonnaire. Confirmer la forme et la position de chaque noyau de sperme étiqueté mRFP dans un sac embryonnaire. Dans cette étude, les phénotypes de fertilisation ont été jugés par morphologie nucléaire de signal de sperme dans l’ovule.

La plupart des ovules contenaient deux noyaux de sperme décondensés étiquetés mRFP du côté micropylaire des ovocytes et du côté central de l’extrémité charazale des cellules. Cela indique une double fécondation réussie. En outre, des ovules contenant un noyau de sperme décondensé étiqueté mRFP au noyau central de cellules plus un noyau condensé de sperme mRFP-étiqueté à l’extérieur du cellule d’oeuf ont été observés, indiquant la fertilisation simple.

Dans le cas d’une double fécondation infructueuse, deux noyaux de sperme condensés étiquetés mRFP ont été observés à la limite de l’ovule et de la cellule centrale. Dans l’analyse utilisant la ligne de knockdown de DMP9 avec l’arrière-plan du pollen de HTR10-mRFP, des ovules contenant un noyau condensé de sperme mRFP-étiqueté ou trois noyaux de sperme mRFP-étiquetés ou plus ont été rarement observés. En combinaison avec l’utilisation de lignées de marqueurs femelles, l’état de fécondation plus précis peut être analysé.

Par exemple, le statut de fécondation après la fusion des gamete et avant la karyogamie peut être jugé. Oui, le processus de fécondation est divisé en plusieurs étapes. Les questions auxquelles chaque organisme de réglementation de la fécondation a participé et à quelles étapes peut être répondue grâce à cette méthode améliorée.

Il fournirait un aperçu plus approfondi de la reproduction sexuelle de la plante.