Préparation de tissu intact pour l’analyse microscopique de la couche de cellules de l’endosperme dans des graines d’Arabidopsis en développement et matures

Ce protocole décrit la préparation d’échantillons intacts de la couche de cellules de l’endosperme dans les graines d’Arabidopsis thaliana . La méthode ne nécessite que l’équipement de laboratoire courant, tel qu’une aiguille d’injection et des pinces de précision, et permet l’imagerie fluorescente haute résolution de cellules vivantes de cellules endospermiennes dans les graines en développement et matures.

L’un de nos domaines de recherche est la science des semences. Notre objectif est de répondre à la question de savoir comment l’endosperme contribue à la germination des graines. Un essai in vitro appelé essai d’inhibition de la croissance des graines a révélé l’importance physiologique de l’endosperme dans la germination des graines. Les graines d’Arabidopsis sont assez petites et l’emplacement de la couche cellulaire de l’endosperme se trouve sous les testa, qui sont les cellules. Il est difficile de préparer des échantillons d’endosperme sans fixation chimique. L’analyse précédente de l’analyse de l’endosperme a utilisé des échantillons fixés chimiquement, de sorte qu’ils n’ont pas pu observer le mouvement des protéines de l’organisme. Notre protocole permet l’imagerie cellulaire de la dynamique des cellules de l’endosperme. Notre protocole peut être réalisé à l’aide d’un équipement de laboratoire standard et permet une compréhension plus approfondie de l’événement intercellulaire et des mécanismes moléculaires, ainsi que de la fonction régulière de l’endosperme.

[Narrateur] Pour commencer, cultivez les plantes Arabidopsis sur du sol ou de la laine de roche jusqu’au stade de la floraison. Marquez les fleurs complètement ouvertes avec des fils colorés pour indiquer zéro jour après la floraison. Sélectionnez les siliques de 12 à 16 jours après la floraison pour la procédure suivante. À l’aide de ciseaux fins, coupez les siliques en développement marquées au niveau du pédicelle et recueillez-les dans des tubes de 1,5 millilitre. Préparez un papier filtre humide pour la dissection afin d’éviter la dessiccation et placez l’échantillon sous un stéréomicroscope. À l’aide de deux pinces, l’une avec des pointes épaisses pour tenir et l’autre avec des pointes pointues pour déchirer. Fendez une valve du replum. Ensuite, à l’aide de la pince avec les pointes fermées, ramassez doucement les graines en développement des siliques pour éviter de les endommager. En utilisant une aiguille d’injection de calibre 27, créez une cicatrice d’environ 0,1 à 0,2 millimètre sur le testa et l’endosperme entourant l’embryon. Tenez la graine à l’aide d’une pince sans l’écraser et faites la cicatrice à la jonction des cotylédons et radicale. Maintenant, poussez l’embryon en pinçant la graine avec une pince, en prenant soin de ne pas écraser l’enveloppe de la graine et en conservant sa forme ronde. Insérez l’aiguille d’injection dans l’enveloppe de semence vide au niveau de la cicatrice et percez-la de l’intérieur vers l’extérieur. Ensuite, maintenez l’aiguille en place et utilisez une pince à pointe fermée pour gratter la surface du Testa. Coupez ensuite un côté de l’enveloppe de graines pour lui permettre de s’ouvrir. Maintenant, à l’aide d’une pince à pointe pointue, ouvrez l’enveloppe de graines en une feuille. L’échantillon isolé doit maintenant être une feuille bicouche composée d’endosperme et de Testa. Placez les graines sèches d’Arabidopsis dans un tube de 1,5 millilitre et ajoutez-y un millilitre d’eau distillée doublement. Conservez les graines pendant au moins 40 minutes à température ambiante. Préparez un papier filtre humide sur la platine du stéréomicroscope pour la dissection et à l’aide d’une micro-pipette de 1000 microlitres, transférez les graines imbibées sur le papier filtre humide. Placez maintenant l’échantillon sous un stéréomicroscope. À l’aide d’une aiguille d’injection, faites une cicatrice d’environ 0,2 millimètre sur le testa et l’endosperme entourant l’embryon. Tenez la graine avec une pince sans l’écraser, et ciblez la jonction entre le cotylédon et le radical pour la cicatrice. Maintenant, poussez l’embryon après avoir pincé la graine avec une pince. Évitez d’écraser l’enveloppe de graines vide et conservez sa forme ronde. À l’aide d’une aiguille d’injection, coupez les côtés supérieur et inférieur de l’enveloppe de semence vide pour lui donner une forme cylindrique. Ensuite, coupez l’enveloppe cylindrique de la graine le long de son axe central pour la diviser en deux morceaux. Les résultats devraient être des feuilles bicouches faites d’endosperme et de testa. Placez les échantillons d’endosperme isolés sous forme de feuilles sur une lame de verre et montez-les dans l’eau. Enfin, placez délicatement une lamelle sur l’échantillon en vous assurant que la couche d’endosperme est tournée vers le haut vers la lamelle. Utilisez du vernis à ongles ou de la graisse pour sceller les bords de la lamelle et prévenir la dessiccation avant d’observer l’échantillon au microscope. De nombreuses cellules de l’endosperme et leurs structures intracellulaires ont été visualisées avec succès à partir de graines récoltées 14 jours après la floraison en utilisant le protocole de préparation établi. Des photocorps ont été détectés à l’intérieur du noyau des cellules endospermiennes, exprimant PHYB-GFP sous lumière blanche, confirmant leur présence et leur localisation nucléaire. Les cellules de l’endosperme ont montré une formation réversible du photocorps lors de l’alternance de l’exposition à la lumière rouge et rouge lointaine, confirmant la photoréversibilité et l’activité biologique du PHYB jusqu’à 4,5 heures après la dissection. Une imagerie fluorescente en time-lapse des mitochondries dans des cellules endospermiennes intactes après trois heures d’inhibition des graines a été réalisée et un mouvement mitochondrial a été détecté. Une motilité mitochondriale plus dynamique a été observée dans les cellules de l’endosperme après un jour d’inhibition des graines, indiquant une activité croissante au fil du temps.