Développement et reproduction de la souris de laboratoire

Development and Reproduction of the Laboratory Mouse

JoVE Science Education
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

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JoVE Science Education Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

Development and Reproduction of the Laboratory Mouse

4.4: Basic Mouse Care and Maintenance

4.15: Zebrafish Microinjection Techniques

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09:04 min

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April 30, 2023

Overview

La reproduction réussie de la souris de laboratoire (Mus musculus) est essentielle à la création et au maintien d’une colonie d’animaux. De plus, les embryons de souris sont souvent étudiés pour répondre aux questions sur les processus de développement. Une grande variété d’outils génétiques existe maintenant pour réguler l’expression des gènes durant le développement embryonnaire et postnatal de la souris, ce qui peut aider les scientifiques à mieux comprendre les maladies héréditaires affectant le développement humain.

Cette vidéo est une introduction à la reproduction et au développement de la souris. En plus de clarifier la terminologie utilisée pour décrire la progression du développement, cette présentation passe en revue les étapes clés du cycle de vie de la souris. Tout d’abord, les grands événements du développement qui ont lieu in utero sont décrits, avec une attention particulière à l’arrangement unique des premiers embryons de rongeurs. Ensuite, les protocoles d’élevage sont fournis pour les souris postnatales, ou souriceaux, y compris le processus de sevrage, ou le transfert des petits hors de la cage de leur mère. Vu que à ce stade les mâles et les femelles doivent être séparés pour empêcher l’accouplement imprévu, la présentation révèle également comment déterminer le sexe de la souris. Par la suite, des instructions sont données pour contrôler la reproduction de la souris, y compris le dépistage du bouchon de copulation, qui est utile pour minuter avec précision le développement embryonnaire. Enfin, la vidéo met en évidence les stratégies utilisées pour étudier les processus complexes qui régissent le développement de la souris, y compris la création de souris chimériques génétiquement modifiées.

Procedure

Les souris sont des modèles très précieux pour mieux comprendre le développement et les maladies chez l’humain. Parmi les mammifères, les souris ont un taux de fécondité élevé et un développement rapide, ce qui signifie que les colonies peuvent être rapidement agrandies.

Étant donné que le développement à l’intérieur de l’utérus exige certaines structures embryonnaires spécialisées, l’étude de l’embryogenèse dans un modèle de mammifère est d’autant plus pertinente pour le développement humain. Dans cette vidéo, nous allons discuter des étapes de la reproduction et du développement, de la facon d’élever les souris, et des applications de notre connaissance de la croissance et de la reproduction de la souris en laboratoire.

Pour commencer, parlons un peu de la reproduction de la souris. Comme chez les humains, le développement prénatal débute de façon interne, avec la gestation prenant place dans les cornes utérines de la mère, ce qui est appelé « gravide ». Cependant, contrairement à la plupart d’entre nous, les souris portent de nombreux fœtus, avec en moyenne une portée de 10 – 12 souriceaux par période de gestation.

Avant de discuter de façon détaillée du développement de ces petits, nous allons examiner les termes utilisés pour identifier les stades du développement. Le système le plus courant commence au jour embryonnaire zéro, ou E0, le jour de copulation réussie. Après cela, chaque étape est définie par le nombre de jours depuis la fécondation jusqu’au jour de la naissance où la numérotation redémarre au jour postnatal zéro, ou P0.

Puisque les embryons d’une même portée peuvent être à différents stades de développement au même moment, des approches fondées sur la morphologie plutôt que le temps écoulé depuis la fécondation, comme les stades de Theiler, peuvent également être utilisées.

Ensuite, regardons de plus près les changements morphologiques qui se produisent pendant les premières semaines du développement de la souris.

Après la fécondation de l’ovocyte, l’embryon commence sa vie lentement, complétant seulement 4 cycles de division cellulaire dans ses 3 premiers jours. Cependant, à E4 ces cellules se sont multipliées et réorganisées pour former une boule de cellules creuse et compact appelée «blastocyste ». A ce stade, les cellules qui finiront par donner lieu à l’embryon lui-même sont toutes trouvées à l’intérieur d’un amas de cellules souches connu sous le nom de la masse cellulaire interne ou ICM. Les cellules restantes, appelées les cellules du trophoblaste, feront partie du placenta qui fournit l’oxygène et nourrit l’embryon.

Après ce point, le développement des rongeurs est un peu tordu. Chez la plupart des mammifères, les cellules qui donnent lieu à l’embryon forment une structure en forme de disque. En revanche, l’embryon de souris a une configuration en forme de coupe. Les cellules à l’extérieur de cette cuvette forment une couche cellulaire appelée l’endoderme, qui donne lieu à des tissus profonds, tels que la muqueuse de l’appareil digestif. Étrangement, les cellules sur la surface interne de la coupe composent l’ectoderme, qui forme des tissus plus superficiels, comme les cheveux et la peau.

Cette disposition inversée persiste environ jusqu’au huitième jour embryonnaire, lorsque l’embryon se courbe littéralement sur lui-même. A ce moment, quelques autres structures reconnaissables se sont développées, y compris les somites, qui donnent lieu à des tissus comme le muscle squelettique; et les bourgeons des membres, qui deviendront les jambes antérieures et postérieures.

Ensuite les choses progressent rapidement, avec le développement des organes majeurs, tels que les poumons et le tube digestif, qui sont en bonne voie au jour embryonnaire 12. Remarquablement, les embryons sont prêts à survivre en dehors de la mère après seulement 19 à 21 jours de gestation.

Maintenant que vous avez une idée de comment le développement se déroule in utero, nous allons parler de ce qui se passe après la naissance. Les souriceaux nouveau-nés sont minuscules, sans poils, et aveugle.

Durant les premières semaines, les souriceaux peuvent recevoir de la nourriture de n’importe qu’elle femelle en lactation. Puis, environ trois semaines après la naissance, ils sont prêts pour le sevrage, ce qui signifie qu’il est temps de quitter la maison de maman pour leur propre cage!

En vue de contrôler de futurs accouplements, les souriceaux mâles doivent être séparés des femelles à ce niveau. Pour identifier les sexes, examiner la distance entre l’anus et les organes génitaux externes. Chez les femelles, cette distance sera plus courte que chez les mâles.

Pour préparer la nouvelle maison des souriceaux, déposez une couche de litière. Vu qu’ils doivent s’habituer à leur nouvelle piaule, ajoutez un peu de nourriture ramollie avec de l’eau ou un plat de nourriture humide au fond de la cage, en plus de fournir de l’eau.

Les souris deviennent sexuellement matures après quelques semaines de sevrage, avec leur apogée de reproduction en general entre 2 et 9 mois.

Alors, comment pouvons-nous utiliser ces informations pour commencer l’élevage d’une colonie? Tout d’abord, il est important de se rappeler que le comportement de la souris est affecté de façon significative par son rythme circadien; vu qu’elles sont nocturnes, vos souris se reproduisent durant la nuit.

Les phéromones jouent également un rôle important dans le comportement de la souris, il est donc utile de présenter des partenaires potentiels pour qu’ils fassent connaissance. Pour maximiser le nombre de petits nés pendant un cycle de reproduction, il faut mettre ensemble un mâle avec un maximum de 4 femelles.

Pour chronométrer de façon précise le développement embryonnaire, vérifiez au matin s’il y a la présence d’un bouchon de mucus vaginal chez chaque femelle, qui est déposé par le mâle pendant la copulation. Les souris ovulent tous les 4 – 5 jours; donc si vous ne voyez pas de bouchon vaginal, gardez les souris ensemble pour une autre chance. Une fois que vous avez déterminé que certaines des femelles sont enceintes, retirez la souris mâle de la cage, car il peut être une menace pour les nouveau-nés.

Afin d’étudier les processus complexes qui contrôlent le développement des embryons de mammifères, les chercheurs ont mis au point des techniques géniales. Jetons un œil à quelques exemples.

Pour commencer, la cartographie du sort cellulaire est une approche dans laquelle les cellules sont marquées et suivies in vivo pour déterminer comment elles contribuent aux structures spécifiques dans le développement et les tissus adultes.

Ici, l’expression d’une protéine fluorescente est activée dans une petite population de cellules pour suivre la contribution de ces cellules exprimant la protéine dans les tissus du cerveau fœtal et adulte.

Afin de tester le rôle d’un gène spécifique dans le développement, il est utile d’examiner les résultats de sa surexpression. Dans une technique appelée électroporation in utero, l’ADN est livré à l’embryon par micro-injection et ensuite pénètre dans les cellules suite a l’application d’un courant électrique au travers du tissu. Ce qui résulte en l’expression du gène dans des cellules spécifiques, tel que démontré par l’expression de la protéine fluorescente rouge dans le système nerveux central de cet embryon.

Des changements plus permanents à l’expression d’un gène sont réalisés pour créer des souris knock-out, dans lesquelles une part de gène est retirée. Pour créer ces souris, les cellules souches sont isolées à partir d’embryons primitifs et leur génome est modifié. Les cellules modifiées sont transplantées dans un blastocyste, qui est ensuite implanté dans une femelle pour la gestation. Le souriceau résultant sera une chimère composée de cellules normales et de cellules knock-out, et peut être élevé pour générer des souris homozygotes knock-out.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la reproduction et au développement de la souris. Dans cette vidéo, nous avons examiné la reproduction de la souris, le développement prénatal et postnatal, et comment élever des souris. Nous avons également présenté des utilisations intéressantes pour l’étude du développement de la souris au labo. Merci de nous avoir regardés!

Transcript

Mice are extremely valuable model organisms that continue to improve our understanding of human development and disease. Among mammals, mice have a high fecundity and rapid development, meaning that colonies can be quickly expanded.

Since development within the womb requires some specialized embryonic structures, the study of embryogenesis in a mammalian model is also more relevant to humans. In this video, we will discuss the stages of mouse reproduction and development, how to breed mice, and ways to apply mouse reproductive and developmental knowledge in the lab.

First let’s talk a little bit about mouse reproduction. Like humans, early mouse development is internal, with gestation occurring within the uterine horns of the mother, who’s called a “dam.” However, unlike most of us, mice carry many fetuses at once, producing an average litter size of 10 – 12 pups in one gestation period.

Before discussing the development of these pups in more detail, let’s review the terms used to identify the developmental stages. The most common staging system begins at embryonic day zero, or E0, on the day of successful copulation. After that, each stage is defined by the number of days since fertilization right up through the day of birth when the numbering restarts at postnatal day zero, or P0.

Since developmental timing can vary slightly even between embryos of the same litter, alternative approaches based on morphology rather than time post fertilization, like Theiler staging, can also be used.

Next, let’s take a closer look at the morphological changes that occur during those first few weeks of mouse development.

After fertilization of the oocyte, the embryo starts its life slowly, completing only 4 rounds of cell division in its first 3 days. However, by E4 these cells have multiplied and reorganized to form a compacted, hollow ball of cells known as the “blastocyst.” At this stage, the cells that will eventually give rise to the embryo itself are all found within a cluster of stem cells known as the inner cell mass, or ICM. The remaining cells, known as the trophoblast cells, will become part of the placenta that provides oxygen and nutrition to the embryo.

After this point, rodent development gets a little twisted. In most mammals, the cells that give rise to the embryo form a disc-like structure. In contrast, the mouse embryo has a cup-shaped configuration. Cells on the outside of this cup form a cell layer known as the endoderm, which eventually gives rise to deep tissues such as the lining of the digestive tract. Confusingly, the cells on the internal surface of the cup represent the ectoderm, which forms more superficial tissues, like hair and skin.

This inverted layout persists until about embryonic day 8, when the embryo quite literally turns itself around. By this point, a few other recognizable structures have developed, including the somites, which give rise to tissues like the skeletal muscle; and the limb buds, which will form the fore and hind limbs.

Things move pretty quickly from here, with the development of major organ systems, such as the lungs and digestive tract, well under way by embryonic day 12. Remarkably, the embryos are ready to survive outside the mother after only 19 -21 days of gestation.

Now that you have a feel for how development proceeds in utero, let’s talk about what happens after mice give birth. The newborn mice, or pups, are tiny, hairless, and blind.

For the first few weeks of life, the pups can receive nourishment from any available lactating female. Then, about three weeks after birth, they are ready for weaning, meaning it’s time to move out of Mom’s place into a cage of their own!

In order to control future breeding, you’ll need to separate the males and females at this point. To identify the sexes, examine the distance between the anus and external genitalia. In females, this distance will be shorter than in males.

To prepare the pups’ new home, line a cage with a layer of bedding. Since they’re still getting used to the new digs, add some food pellets softened with water or a dish of wet food to the bottom of the cage in addition to providing water.

Mice become sexually mature within a few weeks of weaning, with their peak breeding usually falling between 2 and 9 months of age.

So how do we use this information to start a breeding colony? First, it’s important to remember that a mouse’s behavior is significantly impacted by its circadian rhythm; since they’re nocturnal, your mice will breed at night.

Pheromones also play a big part in mouse behavior, so it’s helpful to “introduce” potential mates to let them get to know each other. To maximize the number of pups born during a breeding cycle, combine one male mouse with up to 4 females.

To precisely time embryo development, return in the morning to check each female mouse for a vaginal mucus plug, which is deposited by the male during copulation. Mice ovulate every 4 – 5 days; so if you don’t see a plug right away, keep the mice together for another chance later that week. Once you’ve determined that some of the females are pregnant, remove the male mouse from the cage, as they can be a threat to the newborn pups.

In order to study the complex processes controlling the development of mammalian embryos, scientists have developed some very cool techniques. Let’s take a look at some examples.

To start, fate mapping is an approach in which cells are marked and tracked in vivo to determine how they contribute to specific structures in developing and adult tissue.

Here, the expression of a fluorescent protein is turned on in a small population of cells to track the contribution of cells expressing the protein to fetal and adult brain tissue.

In order to test the role of a specific gene in development, it is helpful to examine the outcome of its overexpression. In a technique called in utero electroporation, DNA is delivered to the embryo by microinjection and then driven into cells by applying electric current across the tissue. The result is the induction of gene expression in specific cells, as demonstrated by the red fluorescent protein expression in the central nervous system of this embryo.

More permanent changes to gene expression come in the form of knockout mice, in which a portion of a gene is removed. To generate these mice, stem cells are isolated from early embryos and subjected to genome modification. The modified cells are transplanted into a blastocyst, which is then implanted into a female for gestation. The resulting pup will be a “chimera” composed of both normal and knockdown cells, and can be bred to generate homozygous knockout mice.

You’ve just watched JoVE’s overview of mouse reproduction and development. In this video we covered mouse reproduction, prenatal and postnatal development, and how to breed mice. We also discussed some exciting applications for studying mouse development in the lab. Thanks for watching!