Name: Livraison efficace de gènes dans les Territoires du SNC multiples à laide In Utero Lélectroporation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: Découvrez l'électroporation in utero pour la livraison de gènes dans le système nerveux central embryonnaire. Cette méthode permet d'étudier la prolifération et la différenciation des progéniteurs neuronaux.

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Les auteurs tiennent à remercier Eva Hadzimova, Pierre Mattar et Christopher Kovach pour leur travail initial dans l&#39;établissement en matière de technologie d&#39;électroporation in utero dans le laboratoire de CS. Ce travail a été financé par un Institut canadien de recherche en santé du Canada (IRSC) subvention (44 094 MOP) et Fighting Blindness IRSC / Fondation (FFB) Subvention d&#39;équipe émergente (00933-000) pour CS et une enfance de l&#39;Alberta Hospital Research Foundation Grant à DMK. RD a été soutenue par une bourse des IRSC Hope Canada, RC est soutenu par une bourse d&#39;études FFB et LML a été soutenu par une subvention de formation des IRSC en génétique et développement de l&#39;enfant.

<ol><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155-162 (2002).</li>
<li>Langevin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validating+in+utero+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+gene+regulatory+elements+in+the+murine+telencephalon.+Dev+Dyn+236%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Validating in utero electroporation for the rapid analysis of gene regulatory elements in the murine telencephalon. Dev Dyn 236.</a> , 1273-1286 (2007).</li>
<li>Mattar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+helix-loop-helix+transcription+factors+cooperate+to+specify+a+cortical+projection+neuron+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic helix-loop-helix transcription factors cooperate to specify a cortical projection neuron identity.</a> Mol Cell Biol. 28, 1456-1469 (2008).</li>
<li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mech Dev. 121, 1137-1143 (2004).</li>
<li>Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).</li>
<li>Kataoka, A., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+controls+regional+identity+in+the+developing+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus.</a> Development. 135, 2873-2881 (2008).</li>
<li>Vue, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+signaling+controls+thalamic+progenitor+identity+and+nuclei+specification+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice.</a> J Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).</li>
<li>Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+axonal+projections+from+mammillary+bodies+in+Pax6+mutant+mice%3A+possible+roles+of+Netrin-1+and+Slit+2+in+mammillary+projections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections.</a> J Neurosci Res. 87, 1620-1633 (2009).</li>
<li>Buffo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+the+transcription+factor+Olig2+in+response+to+brain+injuries%3A+implications+for+neuronal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of the transcription factor Olig2 in response to brain injuries: implications for neuronal repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18183-18188 (2005).</li>
</ol>

In utero électroporation peut être utilisée pour analyser une grande variété de processus de développement. Par exemple, la transfection de gènes rapporteurs tels que la GFP, mCherry ou la phosphatase alcaline peut être utilisé pour effectuer le traçage et la lignée des expériences de la migration neuronale. Alternativement, la recombinase Cre peut être transitoirement exprimé d&#39;éliminer sélectivement un allèle floxés dans un espace et / ou temporellement contrôlée manière. Par ailleurs, shRNA ou dominant n...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom de réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Catégorie </th></tr><tr><td> Ciseaux fins </td><td> Beaux-Sciences Tools Inc </td><td> 14078-10 </td><td> Outils chirurgicale </td></tr><tr><td> Ciseaux Iris, incurvé </td><td> Beaux-Sciences Tools Inc </td><td> 14061-10 </td><td> Outils chirurgicale </td></tr><tr><td> Olsen Hegar-Porte-aiguille Ex-Délicate </td><td> Beaux-Sciences Tools Inc </td><td> 12002-12 </td><td> Outils chirurgicale </td></tr><tr><td> Anneau forceps, 9mm </td><td> Beaux-Sciences Tools Inc </td><td> 11103-09 </td><td> Outils chirurgicale </td></tr><tr><td> Eye vinaigrette Pince </td><td> Beaux-Sciences Tools Inc </td><td> 11051-10 </td><td> Outils chirurgicale </td></tr><tr><td> Dumont # 7 DMX Pince </td><td> Beaux-Sciences Tools Inc </td><td> 11271-30 </td><td> Outils chirurgicale </td></tr><tr><td> Dumont # 5 DMX Pince </td><td> Beaux-Sciences Tools Inc </td><td> 11251-30 </td><td> Outils chirurgicale </td></tr><tr><td> Tissue-pince Adson </td><td> Beaux-Sciences Tools Inc </td><td> 11027-12 </td><td> Outils chirurgicale </td></tr><tr><td> Applicateur clip Reflex </td><td> Instrument de précision du monde </td><td> 500343 </td><td> Outils chirurgicale </td></tr><tr><td> Cuillère perforée, 15 mm de diamètre </td><td> Beaux-Sciences Tools Inc </td><td> 10370-18 </td><td> Outils chirurgicale </td></tr><tr><td> Décapant Autoclip </td><td> Mikron </td><td> 427637 </td><td> Outils chirurgicale </td></tr><tr><td> Black Silk tressé Suture </td><td> Ethicon Inc </td><td> K871 </td><td> Outils chirurgicale </td></tr><tr><td> Reflex Peau Fermeture clips inox plaies acier </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> 500346 </td><td> Outils chirurgicale </td></tr><tr><td> ECM 830 Système Place électroporation vague </td><td> VWR-Canlab </td><td> 58018-004 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Brucelles w / Variable Gap Round 2 électrodes 5mm plaque de platine </td><td> Protech International Inc </td><td> CUY650P5 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Brucelles w / Variable Gap Round 2 électrodes 7mm plaque de platine </td><td> Protech International Inc </td><td> CUY650P7 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Eppendorf FemtoJet microinjecteur </td><td> VWR Canlab </td><td> CA62111-488 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Pédale de commande pour les Eppendorf FemtoJet microinjecteur </td><td> VWR Canlab </td><td> CAACCESS (divers) </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Bransonic Modèle nettoyeur à ultrasons 1510R-SRD </td><td> VWR Canlab </td><td> CA33995-534 du CPN-952-118 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Sutter P97 micropipette Puller </td><td> Sutter Instrument, Carsen Group Inc </td><td> P-97 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Micropipettes - borosilicaté avec filament OD: 1mm, ID: 0,78 mm, longueur 10 cm </td><td> Instrument Sutter </td><td> BF100-78-10 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> 3-Axis Manipulateur grossier </td><td> Carl Zeiss Canada Inc </td><td> M-152 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Dispositif de maintien magnétique pour micromanipulateur </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> M1 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Plaque de base en acier pour micromanipulateur </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> 5052 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Titulaire Micropipette </td><td> World PrInstruments écision </td><td> MPH3 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Micropipette Poignée </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> 5444 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Stéréomicroscope </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Vaporisateur pour l&#39;isoflurane anesthésie </td><td> Porter Instruments Company </td><td> MODÈLE 100-F </td><td> Instruments </td></tr><tr><td> Metriclean2 solution à faible moussant pour sonication outils chirurgicaux </td><td> Metrex Research Corporation </td><td> 10-8100 </td><td> Réactifs chirurgicale </td></tr><tr><td> Gentamicine 40mg/ml dans 0,2 g de méthylène jet d&#39;antibiotiques bleue après la suture </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1264 </td><td> Réactifs chirurgicale </td></tr><tr><td> Germex pour stériliser des instruments chirurgicaux </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN 00141569 # </td><td> Réactifs chirurgicale </td></tr><tr><td> Pommade ophtalmique BNP </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN 00516414 # </td><td> Réactifs chirurgicale </td></tr><tr><td> Nair ® </td><td> Distribué par Church &amp; Dwight Co., Inc </td><td> disponibles dans le commerce </td><td> Réactifs chirurgicale </td></tr><tr><td> Stanhexidine nettoyant la peau 4% p / v </td><td> Laboratoires Omega Inc </td><td> 01938983 </td><td> Réactifs chirurgicale </td></tr><tr><td> La buprénorphine (Temgésic) antalgique </td><td> Schering-Plough </td><td> 531-535 </td><td> Réactifs chirurgicale </td></tr><tr><td> Sulfamides &quot;25&quot; sulfaméthazine antibiotique oral </td><td> Professional Veterinary Laboratories </td><td> DIN 00308218 # </td><td> Réactifs chirurgicale </td></tr><tr><td> Solution de Ringer lactate </td><td> Corporation Baxter </td><td> # 0061085 DIN </td><td> Réactifs chirurgicale </td></tr><tr><td> Saline - chlorure de sodium à 0,9% </td><td> B-Braun Medical Inc </td><td> DIN 01924303 # </td><td> Réactifs chirurgicale </td></tr><tr><td> Anesthésique par inhalation - L&#39;isoflurane USP </td><td> Partenaires Pharmaceutiques du Canada Inc </td><td> DIN 02237518 # </td><td> Réactifs chirurgicale </td></tr><tr><td> Fast Green FCF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F7252 </td><td> Réactifs chirurgicale </td></tr></tbody></table>

livraison efficace de gènes dans les territoires du snc multiples à l&#39;aide in utero l&#39;électroporation

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

La capacité de manipuler l&#39;expression des gènes est la pierre angulaire de la journée embryologie moderne expérimentale, ce qui conduit à l&#39;élucidation des multiples voies de développement. Plusieurs puissants et bien établis technologies transgéniques sont disponibles pour manipuler les niveaux de l&#39;expression des gènes chez la souris, permettant la génération des deux perte et le gain de fonction des modèles. Cependant, la génération de souris transgéniques est à la fois coûteux et fastidieux. D&#39;autres méthodes de manipulation génétique ont donc été largement sollicités. In utero électroporation est une méthode de transfert de gènes dans les embryons de souris 1,2 que nous avons réussi à adapter 3,4 vivre. Il est largement basé sur le succès de l&#39;électroporation in ovo dans les technologies qui sont couramment utilisés dans chiches 5. Brièvement, l&#39;ADN est injecté dans les ventricules du cerveau ouverte développement et l&#39;application d&#39;un courant électrique provoque la formation de pores transitoires dans les membranes cellulaires, permettant l&#39;absorption de l&#39;ADN dans la cellule. Dans nos mains, les embryons peuvent être efficacement électroporées dès le jour embryonnaire (E) 11,5, tandis que le ciblage des jeunes embryons exigerait une guidée par échographie protocole de micro-injection, comme décrit précédemment 6. Inversement, E15.5 est la dernière étape, nous pouvons facilement électroporation, en raison de l&#39;apparition de la pariétale et la différenciation des os frontal, ce qui entrave la microinjection dans le cerveau. En revanche, la rétine est accessible par la fin de l&#39;embryogenèse. Les embryons peuvent être recueillies à aucun moment pendant toute la période embryonnaire ou postnatale précoce. L&#39;injection d&#39;un journaliste de la construction facilite l&#39;identification des cellules transfectées. À ce jour, électroporation in utero a été plus largement utilisé pour l&#39;analyse du développement du néocortex 1,2,3,4. Des études plus récentes ont ciblé la rétine et le thalamus embryonnaire 7,8,9 10,11,12. Ici, nous présentons une modification dans le protocole d&#39;électroporation in utero qui peut être facilement adaptée pour cibler les différents domaines du système nerveux central embryonnaire. Nous fournir la preuve que en utilisant cette technique, nous pouvons cibler le télencéphale embryonnaire, diencéphale et la rétine. Les résultats représentatifs sont présentés, montrant d&#39;abord l&#39;utilisation de cette technique pour introduire des constructions d&#39;expression d&#39;ADN dans les ventricules latéraux, nous permettant de suivre la maturation progénitrices, la différenciation et la migration dans le télencéphale embryonnaire. Nous montrons également que cette technique peut être utilisée pour cibler l&#39;ADN dans les territoires environnants diencéphalique le ventricule 3 ème, permettant les routes migratoires de différencier les neurones en noyaux diencéphalique à surveiller. Enfin, nous montrons que l&#39;utilisation de micromanipulateurs nous permet d&#39;introduire précisément constructions d&#39;ADN dans les zones cibles légères, y compris l&#39;espace sous-rétinien, nous permettant d&#39;analyser les effets de la manipulation de l&#39;expression des gènes sur le développement de la rétine.

Électroporation in utero permet la livraison rapide dans un gène spatialement et temporellement contrôlée manière le développement du système nerveux central (SNC). Nous décrivons ici un très adaptables dans le protocole d&#39;électroporation in utero qui peut être utilisé pour livrer des constructions d&#39;expression dans de multiples domaines du SNC embryonnaire, y compris le télencéphale, diencéphale et la rétine.

Livraison efficace de gènes dans les Territoires du SNC multiples à l&#39;aide In Utero L&#39;électroporation

La capacité de manipuler l'expression génique est la pierre angulaire de l'embryologie expérimentale moderne, ayant permis l'élucidation de multiples processus de développement...

L'objectif général de cette procédure est de modifier l'expression génique dans le système nerveux central embryonnaire des neurones. Cela est réalisé en obtenant d'abord des femelles gestantes à journées contrôlées et en les préparant pour une intervention chirurgicale. Les cornes utérines sont ensuite exposées en pratiquant une incision abdominale.Une fois les embryons exposés, de l'ADN est injecté dans le ventricule latéral, le troisième ventricule ou l'espace sous-rétinien. La dernière étape de la procédure consiste à appliquer un courant électrique à l'embryon à travers la paroi utérine, en orientant les électrodes plates de manière à ce que le pôle positif soit placé au-dessus du site de transfection souhaité. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la prolifération, la migration et la différenciation des progéniteurs neuronaux dans le cerveau en développement et la rétine par microscopie d'immunofluorescence.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la dégénérescence chez les souris transgéniques, réside dans sa rapidité, sa capacité à permettre des études à haut débit et son coût réduit. Cette méthode peut

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L’électroporation double in utero permet de cibler les populations cellulaires qui sont séparées spatialement et temporellement. Cette technique est utile pour visualiser les interactions entre ces populations cellulaires à l’aide de protéines fluorescentes dans des conditions normales, mais aussi après des expériences fonctionnelles pour perturber les gènes d’intérêt.

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