Livraison efficace de gènes dans les Territoires du SNC multiples à l'aide In Utero L'électroporation

L’objectif global de cette procédure est de modifier l’expression des gènes dans le système nerveux central embryonnaire des neurones. Ceci est accompli en obtenant d’abord des femelles enceintes chronométrées et en les préparant à la chirurgie. Les cornes utérines sont ensuite exposées en générant une incision abdominale.

Une fois les embryons exposés, l’ADN est injecté dans le ventricule latéral, le troisième ventricule ou l’espace sous-rétinien. La dernière étape de la procédure consiste à appliquer un courant électrique à l’embryon à travers la paroi utérine, en orientant les électrodes de sorte que le pôle positif soit placé sur le site de transfection préféré. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la prolifération, la migration et la différenciation des neuroprogéniteurs dans le kelon mourant et la rétine par microscopie à immunofluorescence.

Le principal avantage de cette technique ou des méthodes existantes, comme la dégénérescence des souris transgéniques, est qu’elle est rapide, permet des études à plus haut débit et a un coût inférieur. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement neuronal, telles que les gènes qui régulent le progéniteur neural, la prolifération cellulaire, la spécification du destin cellulaire, la différenciation neuronale et la migration cellulaire. Les implications de cette technique peuvent s’étendre vers une meilleure compréhension des voies génétiques qui ont souligné les défauts dans le développement du SNC, dont beaucoup entraînent des troubles cognitifs et sont des troubles du comportement chez l’homme.

Cette technique peut également être appliquée à d’autres systèmes organiques tels que le système nerveux périphérique en développement, le cœur et le placenta. Il peut également être appliqué pour étudier des modèles de maladies chez la souris ainsi que d’autres organismes modèles tels que le poussin et le xip. En général, le principal obstacle au succès pour les individus novices dans cette technique est la survie de l’embryon.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons eu besoin d’un moyen rapide de manipuler l’expression des gènes dans l’embryon, le télencéphale et la rétine. Nous avons développé cette technique dans notre laboratoire en modifiant la technique initialement décrite par Sal, publiée dans la revue Developmental Biology en 2001. Nous avons également travaillé avec un laboratoire de crash pour établir ce protocole dans le dilon en développement.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes d’injection et d’électroporation sont difficiles à apprendre car elles nécessitent une manipulation très soigneuse des embryons et les sites d’injection peuvent parfois être très petits. Exemple, l’espace sous-rétinien Démontrant la procédure aujourd’hui sera Rajiv, un post-doctorant du laboratoire Sherman pour commencer à nettoyer et à stériliser tous les outils chirurgicaux. Ensuite, remplissez les seringues avec une solution saline et une solution de sonnerie lactée et placez-les sur un coussin chauffant pour les réchauffer dans la zone chirurgicale.

Stérilisez un coussin chauffant avec de l’éthanol à 70 %, puis couvrez-le d’un coussin de gaze stérilisé et non mou. Réglez le coussin chauffant à 37 degrés Celsius. Placez l’animal dans une petite chambre d’anesthésie et anesthésiez-le en délivrant 5 % de fluor avec de l’oxygène à raison d’un litre par minute à travers un vaporisateur.

S’assurer de collecter l’huile d’échappement de fluor à l’aide d’un système de nettoyage. Une fois que la respiration de l’animal est profonde et régulière, retirez-le de la chambre. Utilisez les réflexes de pincement des orteils et de clignement des yeux.

Pour assurer une anesthésie complète. Placez l’animal anesthésié sur son ventre et utilisez un tube respiratoire pour délivrer 2,25 % de glace de fluor pendant la chirurgie. Injecter de la buprénorphine à une concentration de 0,1 milligramme par kilogramme de poids corporel par voie sous-cutanée au niveau de la nuque.

Continuez à surveiller la respiration de l’animal et ajustez le débit de fluor si nécessaire. Ensuite, collez du ruban adhésif sur la poitrine de l’animal anesthésié et vérifiez à nouveau s’il y a une réponse de rétraction en pinçant le pied arrière avec une pince émoussée. À l’aide d’un coton-tige stérile, étalez une épaisse couche de crème sur l’abdomen en veillant à ce que le sous-poil soit complètement enduit.

Laissez la crème agir pendant environ trois minutes et vérifiez par intermittence l’épilation. À l’aide d’un écouvillon stérile, mouillez un tampon de gaze stérile avec de l’eau stérile et essuyez les poils de l’abdomen. Ensuite, stérilisez le site d’incision avec de la chlorhexidine et plus d’eau.

Séchez l’abdomen avec de la gaze propre et stérile. Répétez cette étape avec de l’éthanol à 70 % en utilisant de la gaze de coton fraîchement stérilisée. Préparez-vous à la chirurgie en enfilant des vêtements chirurgicaux pour exposer les cornes utérines.

Tout d’abord, localisez l’alba linéaire comme la ligne faible sous la peau sur la ligne médiane À l’aide d’une pince, éloignez la peau de la paroi abdominale et coupez une petite incision droite du milieu de l’abdomen vers le bas avec des ciseaux de peau à l’aide de pinces incurvées et de ciseaux. Répétez le processus avec le péritoine. Saisissez le péritoine avec la pince.

Retirez-vous, puis faites une incision juste assez grande pour tirer l’utérus à travers. Placez de la gaze stérile avec une petite fente verticale sur l’incision et humidifiez-la avec une solution saline stérile chaude. Ensuite, glissez la pince dans l’incision et localisez l’utérus qui maintient l’incision ouverte avec la pince.

Saisissez l’utérus entre le premier et le deuxième embryon visible et tirez les deux côtés des cornes utérines sur la gaze. Comptez le nombre d’embryons en notant toute résorption ou les embryons de petite taille. Afin de préparer le nombre correct d’injections d’ADN, mouillez les cornes utérines avec une solution saline et remettez soigneusement une corne utérine dans l’abdomen.

Pour détester les aiguilles chirurgicales, utilisez une pipette tirée vers le haut avec un embout buccal attaché pour aspirer 10 microlitres de trois milligrammes par millilitre. Une solution d’ADN sans endotoxines contenant du colorant vert de méthyle et expulse l’ADN dans une aiguille chirurgicale. Montez la première aiguille remplie sur le micromanipulateur.

Tenez-vous attaché à l’injecteur en commençant par l’embryon le plus proche de l’ovaire. À l’aide d’une pince circulaire, tournez doucement l’embryon à l’intérieur de la décidue afin qu’il soit positionné face vers l’avant, ce qui permet aux injections de se produire dans un rouleau ROS dans la direction cordale. Utilisation d’une source lumineuse à fibre optique pour identifier la ligne médiane du cerveau embryonnaire.

Notez les grands ventricules latéraux flanqués dans les régions rostrales. Maintenez l’embryon en place à l’aide d’une pince incurvée et positionnez l’aiguille chirurgicale remplie au-dessus de l’utérus de sorte que l’angle d’entrée dans le cerveau soit d’environ 45 degrés. D’un mouvement rapide et régulier, tournez le cadran du micromanipulateur pour insérer la pointe de l’aiguille à travers la paroi de l’utérus et dans le ventricule latéral du cerveau embryonnaire.

Ensuite, appuyez sur le coussinet plantaire du micro-injecteur. Pour injecter la solution d’ADN, une injection réussie est facilement visualisée en répandant le colorant vert de méthyle dans les ventricules cérébraux embryonnaires. Maintenant que l’ADN a été injecté, tirez lentement l’aiguille vers le haut pour la retirer sans provoquer de casse.

Placez l’embryon injecté sur la gaze stérile et mouillez-le abondamment avec une solution saline chaude. Saisissez l’utérus avec le pôle positif de l’électrode de palette placée sur le site de transfection souhaité. Ensuite, délivrez cinq impulsions électriques carrées de 40 à 50 volts et 50 millisecondes à raison d’une impulsion par seconde.

Couvrez l’embryon injecté et électro-évalué avec de la gaze humide protectrice, puis continuez pour injecter l’embryon suivant. Une fois l’injection et l’électroérosion de tous les embryons souhaités dans la corne utérine, repoussez-la soigneusement dans la cavité corporelle. Retirez la deuxième corne utérine pour commencer l’injection et l’électroporation des embryons restants.

Une fois que tous les embryons sont de retour à l’intérieur de l’utérus, ajoutez deux à trois millilitres de solution saline chaude dans la cavité abdominale, puis retirez la gaze de l’abdomen pour révéler les côtés du péritoine. Utilisez une ligne de soie tressée noire pour suturer le péritoine en ancrant la ligne sur le péritoine le plus proche du sternum et en procédant à la couture en s’éloignant de l’ancre. Assurez-vous que toutes les sutures sont bien serrées et qu’aucun organe sous-jacent ou peau n’est cousu dans le péritoine.

Coupez la ligne de suture restante et jetez-la. Tirez la peau fermée sur la ligne de suture avec une pince à l’aide d’agrafes de fermeture de la peau. Coupez la peau en prenant soin de ne pas agrafer la ligne de suture en dessous ou de tirer la peau trop serrée.

Une fois terminé, assurez-vous que les agrafes sont bien serrées en appuyant doucement ensemble avec l’outil de suture ici, A-P-C-I-G deux vecteurs d’expression pilotant l’expression de la GFP a été électroporé dans le néocortex en développement à E 12. Au fur et à mesure que le développement néocortical progresse, les progéniteurs apicaux se différencient en progéniteurs basaux secondaires ou en neurones post-mitotiques et continuent d’exprimer la GFP. Ces cellules neurales peuvent ensuite être analysées pour l’expression de marqueurs typiques du sous-type neural indiqué en rouge.

Dans cette vue vénale d’un cerveau antérieur d’un embryon électroporé en E 12 et disséqué en E 14, le site électroporé est indiqué par l’épifluorescence verte en E 14. L’expression de la GFP est observée dans le thalamus, le pré thalamus et l’hypothalamus, indiquant que les territoires liques mourants ont été transfectés avec succès. La boîte de tableau de bord marque l’emplacement de la section à travers une zone ventriculaire.

Un examen plus approfondi de la zone ventriculaire montre la migration des cellules GFP hors de la zone ventriculaire et dans la zone du manteau. Là où les noyaux hypothalamiques se formeront, la rétine embryonnaire est également facilement électroporée, comme le montre cette coupe coronale, par un E 16,5 I électroporé avec PCIC à E 15,5. Ici, l’accumulation de cellules m cherry positives est spécifique à la couche externe de neuroblastes et n’est pas observée dans les cellules ganglionnaires rétiniennes B rrn trois B positives dans la couche de cellules ganglionnaires Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 minutes si aucune complication inattendue ne survient.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’utiliser des techniques stériles appropriées, une main ferme lors de la manipulation des embryons et d’avoir tout le matériel nécessaire prêt avant de mettre la femme enceinte sous anesthésie. À la suite de cette procédure, les embryons électro-tressés peuvent être autorisés à vivre jusqu’à l’âge adulte, après quoi d’autres méthodes telles que des tests comportementaux et fonctionnels peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires relatives à la façon dont la manipulation de certains gènes de l’embryon affecte la fonction neuronale chez l’adulte. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du développement du SNC pour explorer la fonction des gènes in vivo chez la souris.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’introduire de l’ADN étranger dans le tube neural embryonnaire. Plus précisément, nous vous montrons comment préparer une femme enceinte à la chirurgie. Exposez l’utérus, injectez de l’ADN et électrolysez l’embryon.

N’oubliez pas que travailler avec du fluor peut être dangereux et que des précautions telles qu’un système de nettoyage doivent être prises lors de l’exécution de cette procédure.