Étiquetage spécifique de la séquence des acides nucléiques et des protéines avec Methyltransferases et le cofacteur Analogues

ADN et les protéines sont-séquence spécifiquement étiquetés avec une affinité ou groupes rapporteurs fluorescents à l'aide ADN ou de protéines méthyltransférases et analogues de cofacteur synthétiques. En fonction de la spécificité du cofacteur des enzymes, aziridine ou doubles analogues de cofacteurs activés sont utilisés pour l'étiquetage d'une ou deux étapes.

L’objectif général des expériences suivantes est de marquer spécifiquement l’ADN et les protéines à l’aide de méthyltransférases, qui transfèrent naturellement le groupe méthyle activé et le cofacteur Sile l méthionine appelé aome à D-N-A-R-N-A. Protéines ou petites biomolécules. Une étape de marquage est réalisée en remplaçant le cofacteur naturel omit par des cofacteurs d’aine synthétiques qui modifient le cours de la réaction conduisant au couplage enzymatique de l’ensemble du cofacteur et donc au marquage covalent de la séquence de substrat Le marquage spécifique induit par la méthyl transférase de l’ADN est démontré avec l’ADN méthyltransférase spécifique de l’adine, M-B-S-E-C, qui couple le cofacteur six BAZ d’Aine biotinylé à la séquence de reconnaissance A-G-C-G-A-T conduisant à la séquence, spécifiquement biotinylée, le transfert dirigé de l’ADN méthyltransférase des groupes activés est l’utilisation de la protéine de marquage et est démontré à l’aide de l’ensemble de MTA sept neuf, qui transfère un groupe pro pargo de C huit oin à la lysine quatre de l’histone H trois.

Le résidu de lysine alkylée est marqué chimiquement par un fluor modifié azi à l’aide d’une chimie click catalysée par le cuivre, conduisant ainsi à une protéine spécifiquement marquée. L’un des avantages de l’utilisation des méthamphétamine transférases pour le marquage est qu’elles ont le potentiel de cibler directement les substrats natifs. Je démontrerai cela par l’exaltation bioTE spécifique à la séquence du plasmide, l’ADN méthamphétamine transférase, la modification des protéines catalysée avec le cofacteur analogue zin et permet l’introduction d’une grande variété de groupes rapporteurs en deux étapes.

Je le démontrerai par le marquage par fluorescence de la protéine hisone H trois et par la démonstration des résultats du marquage de H trois avec de la biotine. De plus, les analogues de fonctionnement des cofacteurs activés peuvent être facilement synthétisés en chargeant Sail, el homocystéine, le produit du cofacteur après le transfert de groupe méthyle avec divers alcools activés. Les analogues synthétiques des cofacteurs sont purifiés par HPLC en phase inverse, et dans certains cas, il est même possible de séparer l’épi Mars au soufre.

L’ADN souriant est un marquage de l’ADN induit par une méthyltransférase spécifique à une séquence. Ici, le concept est démontré par le marquage de l’ADN plasmidique PB 3 22 avec six cofacteurs BAZ Aine et l’ADN adine spécifique méthyl transférase. M-B-S-E-C un commence par hacher les six BAZ à 20 degrés Celsius.

Une fois pensé, réparez le mélange réactionnel sur de la glace. Il comprend un microgramme de plasmide, 60 micromolaires de six BAZ et 10 équivalents de M-B-S-E-C un. Séquence de reconnaissance HER sur l’ADN en tampon de modification.

Assurez-vous d’ajouter les six BAZ et M-B-S-E-C en dernier. Assurez-vous qu’il n’y a pas d’EAM lié à la méthamphétamine transférase que vous utilisez, car le cofacteur naturel bloquera l’étiquetage. Commandes React For.

Remplacez les MTA par de l’eau pour visualiser toute modification non spécifique des cofacteurs et ajoutez de l’eau au lieu du cofacteur pour tester le cofacteur naturel dans le concentré d’enzymes. Maintenant, mélangez doucement les réactions avec une pipette et incubez-les à 55 degrés Celsius pendant une heure. Vers la fin de l’incubation, réparez un mélange d’endonucléases sur de la glace en ajoutant 10 microlitres de 10 x tachymètre recombinant, un tampon à 80 microlitres d’eau, puis en ajoutant 3,3 microlitres d’endonucléase recombinante et une endonucléase de restriction.

Après l’incubation, tirez les réactions avec un tour rapide, puis vérifiez la modification de l’ADN de chacune. Ajoutez deux microlitres de 10 x tak, un tampon et 28 microlitres du mélange d’endonucléases. Mélangez les réactions avec un pipetage doux.

Maintenant, incubez les réactions à 65 degrés Celsius pendant une demi-heure. Lorsque les réactions sont terminées, tirez la solution avec une rotation rapide et collectez 25 microlitres de réactions dans de nouveaux tubes. À ces aliquotes, ajoutez 2,4 microlitres de streptocoque TTR en tampon à un millimolaire par monomère d’adine streptococcique.

Maintenant, incubez cette réaction pendant une heure à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, ajoutez cinq microlitres de tampon de chargement aux réactions terminées et versez 10 microlitres sur un gel agros à 1 % à 80 volts pendant environ une heure. Visualisez ensuite les bandes mt A est l’abréviation de méthyl transférase transfert dirigé des groupes activés.

Dans cette démonstration, la méthyltransférase est définie sept, neuf et a activé le cofacteur C huit. Oin sont utilisés pour marquer la lysine quatre de son histone H trois. Après décongélation des composants sur des mélanges réactionnels de réparation de glace de 20 microlitres, la solution d’essai contient un tampon de modification de 10 micromolaires de l’histone H trois et des 10 dernières micromolaires de méthyltransférases ajoutées plus 600 micromolaires de cofacteur.

Effectuez un contrôle enzymatique en remplaçant le C eight ON par de l’eau désionisée. Faites également un contrôle de cofacteur pour visualiser les modifications non spécifiques en incluant 60 millimolaires d’ADO rencontrés pour rivaliser avec les cofacteurs synthétiques. Mélangez maintenant les réactions avec un pesage lent du tuyau et vérifiez leur pH avec des bandelettes de test. Les analogues de cofacteurs activés à double titre sont stockés dans des conditions C.

Par conséquent, le pH de votre solution réactionnelle peut changer en ajoutant du cofacteur si nécessaire à de petites quantités de 50 millimolaires d’hydroxyde de sodium pour ajuster le pH. Incuber maintenant les réactions à 37 degrés Celsius pendant deux heures pendant la réparation de l’incubation. Un gel de polyacrylamide SDS à 12 % juste avant la fin de l’incubation, faites 20 microlitres de mélange à cinq x clic contenant trois millimolaires de sulfate de cuivre, trois millimolaires de ligand T-H-P-T-A 250 millimolaires, un appât de sodium ACO et six millimolaires d’azoture de Tamara.

À la fin de l’incubation, ajoutez cinq microlitres de mélange à clic à chaque réaction et mélangez les réactions lentement par caresses. Protégez les réactions de la lumière à l’aide d’une feuille d’aluminium et incubez-les à 20 degrés Celsius pendant une heure. Au bout d’une heure, éliminez l’excès de chloroforme en précipitant les protéines.

Ajoutez 75 microlitres de méthanol, 18,7 microlitres de chloroforme et 50 microlitres d’eau à chaque réaction et vortexez-les brièvement après chaque ajout. Après avoir préparé chaque tube, faites-les tourner à 16 000 G pendant cinq minutes. Supprimez la phase supérieure de la séparation sans perturber la couche d’interface, qui contient les protéines.

Ajoutez maintenant 56,3 microlitres de méthanols, la phase inférieure et le vortex. Ensuite, essorez-le pour granuler la protéine et jetez le supinate. Ajoutez ensuite 56,3 microlitres de méthanol.

Encore une fois, vortex. Répétez l’essorage et récupérez les granulés. Laissez sécher les granulés dans leurs tubes, débouchés et recouverts de papier non pelucheux.

Plus tard, dissoudre les protéines dans 20 microlitres de tampon de chargement SDS avec un colorant de chargement. Rincez les parois du tube avec le tampon pour recueillir la pastille. Ensuite, incubez les tubes à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Une fois que les tubes ont été mis à température ambiante, passez-les brièvement pour extraire leur contenu et visualiser les protéines par page SDS. Fonctionne à 120 volts pendant environ 90 minutes. La réaction de sourire a été réalisée avec l’ADN méthyltransférase M-B-S-E-C one, qui modifie le deuxième résidu adénine dans la séquence A-T-C-G-A-T double brin et a un site de reconnaissance sur le plasmide PBR 3 2 2, qui est marqué en rouge pour tester le marquage du plasmide.

PB 3 2 2 a été contesté avec la restriction recombinante ENDONUCLEASE T one, qui a sept sites sur PB 3 22 marqués en vert, dont l’un est inclus dans le site M-B-S-E-C one. Lors de l’étiquetage, ce site doit être protégé contre le clivage dans le gel. Cela s’est confirmé.

Un nouveau fragment avec 683 paires de bases est apparu, démontrant qu’il y avait un marquage au site M-B-S-E-C one. Cela ne se voit que dans la voie d’essai, qui est la voie trois. La spécificité de la réaction de marquage a été démontrée par le décalage de l’électromobilité.

Lors de l’ajout de streptoco-adine, l’électromobilité du fragment de la paire de bases 683 marqué à la biotine a été retardée. Alors que la mobilité des fragments sans le site M-B-S-E-C one était inchangée, ou un marquage en deux étapes des substrats de méthyl transférase avec des analogues à huit oh mis activés en double. L’histone H trois lysine quatre méthyl transférase a donné sept neuf, et le petit cofacteur C huit ON a été utilisé.

L’électrophorèse sur gel a été utilisée pour la détection par fluorescence uniquement sur la voie de dosage. La première voie a montré une bande fluorescente correspondant à l’histone H trois, indiquant que la chaîne latérale du cofacteur a été spécifiquement transférée et que la protéine modifiée a été marquée avec la Tamara Flora.Four. La coloration ESI sert de contrôle de charge.

Toutes les voies ont montré la même quantité de protéines. Les substrats de méthyltransférase peuvent également être marqués par des réactions de biotine avec une biotine dérivée de l’azi. Au lieu d’un Fluor, on a effectué un dosage Western avec de la peroxydase de raifort.

Un étiquetage conjugué d’Aden réussi et spécifique a été constaté après avoir regardé cette vidéo. Vous devez avoir une bonne compréhension de la façon d’étiqueter l’ADN et la séquence de protéines, en particulier avec du texte d’affinité, de la force fluor ou d’autres étiquettes. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que d’autres métaux et leurs analogues sont sensibles à la température.

Manipulez-les toujours sur de la glace et conservez-les à moins 20 degrés Celsius. J’ai synthétisé double activé. D’autres analogues de MET avec le groupe rapporteur étaient déjà intégrés dans la chaîne latérale et les utilisaient pour marquer spécifiquement l’ADN en une seule étape.

Je suis particulièrement enthousiaste à l’idée de combiner différentes enzymes et groupes de rapports pour la cartographie de l’ADN à l’aide de techniques de molécules uniques. Le sourire et l’ECN sont très flexibles, et presque tous les groupes chimiques peuvent être transférés non seulement à l’ADN et aux protéines, mais aussi à l’ARN et aux petits en utilisant des transferts de méthamphétamine appropriés.