Basée sur l'image de cytométrie en flux Technique pour évaluer les changements de granulocytes Fonction In Vitro

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer la fonction des granulocytes selon une approche à deux paramètres. Ceci est accompli en incubant d’abord des granulocytes à partir d’échantillons de sang de patients avec des bioparticules et un réactif pour visualiser l’explosion oxydative. Dans la deuxième étape, la phagocytose post-incubation est bloquée, puis les récepteurs de surface cellulaire d’intérêt sont marqués pour permettre une identification positive des granulocytes.

En fin de compte, les sous-ensembles de granulocytes activés peuvent être identifiés et isolés par cytométrie en flux basée sur l’image. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’immunologie nutritionnelle ou clinique, telles que la façon dont les habitudes alimentaires et les pratiques nutritionnelles contribuent aux altérations et à la fonction des granulocytes. La démonstration de cette procédure sera assurée par Eric Prado, un doctorant de mon laboratoire.

Lors de la décongélation de l’échantillon de sang périphérique, les bioparticules SIU et la DHE à température ambiante et l’éthyle malamed dans un bain à 37 degrés Celsius B, lorsque les réactifs ont décongelé, ajoutent 20 microlitres de bioparticules SSUS à quatre tubes individuels de 1,2 millilitre dans une hotte stérile. Ajoutez ensuite 40 microlitres de DHE décongelé dans chaque tube contenant les bioparticules, et tapotez doucement les tubes sur la paillasse pour recueillir le réactif au fond des tubes. Après avoir ajouté 100 microlitres de sang total mélangé dans chaque tube, retirez tout sang contaminant le long du bord intérieur des tubes à l’aide d’un applicateur à embout de coton et mélangez le sang et les réactifs avec une pipette électronique réglée pour trois cycles.

Après le troisième cycle, placez tous les tubes dans un seau à glace à l’abri de la lumière. Ensuite, incubez les tubes pendant 10, 20 ou 40 minutes dans un bain rapide à 37 degrés Celsius, en commençant par le tube de 40 minutes pour vous assurer que toutes les incubations se terminent en même temps. A la fin des incubations, distribuer 15 microlitres d’éthyl malamed dans chacun des tubes.

Après 30 minutes, incubez les cellules avec 10 microlitres chacun des anticorps appropriés. Après une heure, incubez davantage les cellules dans 750 microlitres de solution de poux de globules rouges fix. Après une autre heure, l’incubation centrifuge les cellules et aspire sous vide le surnageant, laissant un volume de fluide résiduel de 100 microlitres au-dessus de la pastille de cellule.

Ajoutez maintenant 10 microlitres de sept A à 5 microlitres de PBS fraîchement dilués, 50 microlitres de PBS et 25 microlitres de billes d’étalonnage à chaque échantillon. Ensuite, bouchez les tubes, enveloppez-les dans du papier d’aluminium et conservez-les à quatre degrés Celsius. Lorsque le cytomètre en flux basé sur l’image est prêt, exécutez chaque tube d’échantillon en collectant un minimum de 3000 événements de site ULU à l’aide de paramètres prédéfinis pour analyser les échantillons.

Utilisez l’assistant de compensation logicielle automatisé du logiciel IDEA pour appliquer une matrice de compensation aux fichiers d’image brute et pour créer des fichiers d’image compensés. Ensuite, chargez les fichiers CIF individuels dans le logiciel IDEA et générez les graphiques suivants pour identifier les sous-ensembles de granulocytes pour chaque échantillon de patient. En utilisant le contrôle non stimulé comme étalon de référence, utilisez d’abord l’histogramme de la racine carrée moyenne du gradient de fond clair pour établir les portes initiales et identifier les cellules considérées comme étant nettes.

Ensuite, pour séparer les cellules singulet des débris et des doublets, créez un diagramme à points du rapport d’aspect en fond clair par rapport à la zone en fond clair. Une fois qu’une population de cellules propres a été identifiée, établissez un diagramme à points de CD 45 en fonction de CD 66 B.To identifiez positivement les granulocytes CD 66 B positifs de CD 45. Enfin, créez un graphique à points de l’intensité des détails lumineux pour l’aureus par rapport à l’intensité des détails lumineux pour l’éclat oxydatif.

Pour identifier les sous-ensembles des granulocytes activés collectant les images en fond clair dans les canaux un et neuf, les bioparticules dans le canal trois, la DHE dans le canal quatre, les sept a a d dans le canal cinq, le CD 66 B dans le canal 11 et le CD 45 dans le canal 12, une superposition de deux couleurs peut également être générée représentant des événements combinés de DHE et de bioparticules. À l’aide de la cytométrie en flux basée sur l’image, une population homogène de granulocytes activés peut être séparée en trois sous-ensembles d’activation différents. Avec cette méthode, le moyen le plus efficace de résoudre les trois sous-ensembles est de tracer l’intensité des détails brillants pour la phagocytose en fonction de l’éclat oxydatif.

L’utilisation ultérieure de l’assistant de colocalisation dans le logiciel IDEAS permet de quantifier la présence simultanée de la phagocytose et de l’explosion oxydative des granulocytes, signe distinctif d’une activation élevée. De plus, dans cette expérience, la période d’incubation de 40 minutes a montré le plus grand pourcentage de granulocytes hautement actifs. Ainsi, l’inclusion d’au moins trois périodes d’incubation dans le protocole facilite la détermination de la manière dont un traitement clinique donné peut modifier l’état d’activation temporelle des granulocytes.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que les tests multiplex basés sur des billes peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires. Par exemple, comment la production de chimiokines GRANULOCYTES dans le supinate change-t-elle après l’exposition à des bioparticules ?