Mesure de granulocytes et de monocytes phagocytose et oxydative Activité Burst dans le sang humain

L’objectif global de ce test est de mesurer la phagocytose des granulocytes et des monocytes et l’activité oxydative dans le sang total. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie, telles que comment une intervention diététique particulière affecte-t-elle la réponse immunitaire à l’exercice. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’un test simple et direct qui peut être facilement modifié pour tenir compte des ressources de laboratoire disponibles et des intérêts de recherche.

Nous avons utilisé cette mesure de la fonction immunitaire innée au cours des deux dernières décennies dans bon nombre de nos essais d’exercice, et nous partagerons certaines de ces données plus tard dans la vidéo. Avant de commencer la procédure, utilisez un analyseur d’hématologie pour effectuer une numération globulaire complète avec analyse différentielle des globules blancs sur les échantillons de sang selon les instructions du fabricant. Notez le nombre de globules blancs en cellules par millilitre et les valeurs en pourcentage de neutrophiles et de monocytes pour les échantillons.

Ensuite, pour chaque tube expérimental et de contrôle, utilisez une pointe de pipette de grande longueur pour transférer 100 microlitres de chaque échantillon de sang entier du tube de prélèvement sanguin d’héparine de lithium au fond d’un tube de 12 x 75 millimètres correctement étiqueté. Lorsque tout le sang a été transféré, ajoutez 10 microlitres de la solution de travail HE dans les tubes étiquetés à l’encre rouge et un H, y compris le tube de contrôle HE. Débouchez les tubes.

Vortex brièvement les échantillons et transférez les tubes dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius dans une grille métallique ouverte avec une légère secousse toutes les cinq minutes. Après 15 minutes, transférez rapidement la grille et les tubes dans un bain d’eau glacée pendant 12 minutes en secouant doucement toutes les cinq minutes. À la fin de l’incubation, ajouter le volume approprié de solution de travail de S. aureus non étiqueté dans les tubes étiquetés à l’encre rouge et avec un H, y compris le tube témoin HE.

Vortex brièvement les tubes avec les capuchons. Ajoutez ensuite le volume approprié de solution de travail de S.aureus étiquetée FITC dans les tubes étiquetés avec de l’encre noire et un F, y compris le tube de contrôle FITC, et faites brièvement vortex les échantillons. Ensuite, incubez tous les tubes dans le bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes en secouant toutes les cinq minutes suivies d’un refroidissement d’une minute dans l’eau glacée.

Après avoir placé les échantillons à température ambiante, utilisez une pipette à répétition pour ajouter 100 microlitres de solution de trempe glacée à tous les tubes et vortex les échantillons. Remettez les échantillons dans le bain de glace. Au bout d’une minute, utilisez la pipette à répétition pour ajouter un millimètre de PBS glacé dans chacun des tubes.

Ensuite, faites vortex les tubes et ajoutez deux millilitres supplémentaires de PBS aux échantillons. Maintenant, centrifugez les cellules et aspirez le surnageant. À l’aide de la pipette à répéteur, ajoutez 50 microlitres de FBS glacé dans les tubes.

Après le vortex, transférez tous les tubes dans un carrousel. Utilisez un poste de préparation automatisé à la lyse cellulaire pour lyser les globules rouges et fixer les globules blancs selon les instructions du fabricant. Pour analyser les résultats du test par cytométrie en flux, ouvrez le logiciel d’acquisition du système de cytométrie en flux et créez un nouveau protocole.

Choisissez FITC pour le paramètre FL1 pour le test de phagocytose et HE pour le paramètre FL2 pour le test d’activité de sursaut oxydatif. Créez un graphique de points de dispersion vers l’avant ou vers les côtés, un histogramme FL1 et un histogramme FL2. Créez ensuite des régions polygonales pour les populations de globules blancs, de granulocytes et de monocytes sur le graphique de dispersion avant ou latéral et créez des régions linéaires sur les histogrammes.

Analysez maintenant l’échantillon de contrôle négatif uniquement dans le sang, suivi des échantillons de contrôle positif HE et FITC, en examinant les histogrammes et en ajustant les tensions du tube photomultiplicateur des canaux FITC et PE si nécessaire. Lancez ensuite l’acquisition des données pour les échantillons de contrôle. Après une période d’équilibrage de 15 minutes, chargez les échantillons expérimentaux dans le carrousel selon l’ordre indiqué sur la liste de travail et correspondant à l’analyse de l’échantillon d’étude.

Pour évaluer l’activité phagocytaire des échantillons, consolidez d’abord tous les fichiers de données des échantillons marqués F et du mode liste de contrôle dans un seul dossier, puis faites glisser les fichiers dans l’espace échantillon du logiciel d’analyse par cytométrie en flux. Double-cliquez sur un échantillon de contrôle et utilisez le sélecteur de porte polygonale pour définir une porte pour la population totale de globules blancs, en prenant soin d’inclure toutes les cellules sur les bords du graphique. Étiquetez cette porte WBC.

Double-cliquez sur la porte WBC et utilisez le sélecteur de porte elliptique pour définir la porte des lymphocytes. Étiquetez la porte en conséquence et faites glisser le pourcentage de données de la porte sur le côté afin que les cellules soient facilement visibles. Utilisez ensuite le sélecteur de porte polygonale pour définir la porte des granulocytes et la porte des monocytes.

Étiquetez chaque porte en conséquence et faites glisser le pourcentage de données de la porte sur le côté. Double-cliquez sur l’échantillon de contrôle FITC suivi de la porte des granulocytes et utilisez les menus déroulants pour définir l’axe X sur FL1 et l’axe Y sur la diffusion latérale, ou SS. Utilisez le sélecteur de porte carrée pour définir une porte négative de phagocytose et une porte positive de phagocytose. Mettre en évidence la porte positive de phagocytose de la population de granulocytes.

Cliquez ensuite sur Espace de travail et Ajouter une statistique. Mettez en surbrillance Geometric Mean (Moyenne géométrique) et FL1 (FL1) pour générer l’intensité de fluorescence des granulocytes positifs à la phagocytose, puis cliquez sur Add (Ajouter). Choisissez ensuite la fréquence de la statistique parent et cliquez sur Ajouter pour générer le pourcentage de granulocytes dont la phagocytose est positive.

Pour appliquer ces paramètres à tous les échantillons d’étude, mettez en surbrillance tous les points de contrôle et statistiques créés dans l’échantillon de contrôle FITC et faites-les glisser dans la zone Tous les échantillons du panneau de groupe. Enregistrez le travail en tant que fichier WSP dans le même dossier que celui qui contient le dossier de données en mode liste. Cliquez maintenant sur le premier échantillon expérimental de l’ensemble de données et confirmez que la porte des globules blancs s’adapte correctement à la distribution cellulaire sur chacun des échantillons, en ajustant les bords de la porte si nécessaire.

Cliquez maintenant sur la porte des globules blancs dans le premier échantillon expérimental et confirmez que les portes des granulocytes, des monocytes et des lymphocytes correspondent à la distribution cellulaire sur chacun des échantillons, en ajustant les portes si nécessaire. Après avoir enregistré le fichier, cliquez sur l’icône de l’éditeur de tableau et faites glisser chaque statistique d’intérêt dans le tableau. Cliquez sur Créer une table pour afficher les données dans un format de feuille de calcul et enregistrer le travail sous forme de fichier XLSX.

Répétez ensuite l’analyse pour les échantillons d’activité d’activité de rafale oxydative marqués H et les fichiers de données en mode liste de contrôle, comme nous venons de le démontrer. Comme démontré dans cette expérience représentative, la phagocytose médiée par les granulocytes de S. aureus est augmentée immédiatement et 1,5 heure après une course à vélo de 75 kilomètres, revenant à la normale le lendemain matin. L’activité oxydative des granulocytes est diminuée pendant au moins 21 heures après ce niveau d’activité.

De plus, il existe une corrélation modeste entre la phagocytose des granulocytes et les taux sériques de protéine C-réactive, comme observé dans cette analyse de 106 femmes en surpoids ou obèses, indiquant qu’une phagocytose élevée des granulocytes et des monocytes chez les sujets au repos peut être indicative d’une inflammation systémique. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée pour environ 30 échantillons en sept heures si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de refroidir complètement les échantillons avant d’ajouter les bactéries afin de minimiser toute variabilité inexpliquée entre les échantillons.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes, comme la quantification des cytokines, peuvent être effectuées pour déterminer l’effet de votre intervention sur la réponse inflammatoire. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie pour explorer les effets d’une variété de changements de mode de vie et de la fonction immunitaire innée chez l’homme. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer la phagocytose des granulocytes et des monocytes et l’activité du sursaut oxydatif avec un cytomètre en flux.

N’oubliez pas que travailler avec du sang humain peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port de l’EPI approprié, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.