In vitro caractérisation fonctionnelle de la souris colorectal afférente Endings

L’objectif général de l’expérience suivante est de caractériser fonctionnellement les terminaisons nerveuses afférentes extrinsèques dans le co-rectum de souris in vitro. Ceci est réalisé en prélevant le nerf colorectal et le nerf pelvien ou lombaire attaché Splunk neck en continu et en plaçant le tissu dans une chambre d’enregistrement in vitro Comme deuxième étape, le tronc du nerf pelvien ou lombaire Splunk neck est divisé en filaments fins afin que des enregistrements électrophysiologiques à fibre unique puissent être réalisés à partir d’axones nerveux individuels. Ensuite, les terminaisons nerveuses colorectales individuelles sont identifiées par stimulation électrique non biaisée des champs réceptifs et classées fonctionnellement en fonction des profils de réponse à trois stimuli mécaniques distincts.

De plus, les réponses aux produits chimiques appliqués sur les terminaisons nerveuses peuvent être testées en isolant le champ récepteur avec un morceau de tube en laiton et en remplaçant la solution par la solution contenant le produit chimique ou le mélange de produits chimiques. Les résultats montrent que le colorectal de souris est innervé par cinq classes différentes de mécano-sensibles. De plus, environ 25 % des ens colorectaux sont des nocicepteurs mécaniquement insensibles ou silencieux.

Cette méthode est utilisée par nous et par d’autres pour étudier l’innervation sensorielle du colorectal. Nous sommes intéressés à utiliser cette approche de recherche parce que de nombreux troubles gastro-intestinaux sont associés à une sensibilisation ou à une modification de l’excitabilité de l’innervation sensorielle. Notre intérêt à comprendre les mécanismes de sensibilisation est lié à notre désir d’aider à développer des stratégies thérapeutiques qui pourraient ensuite être utiles pour moduler la douleur et l’inconfort qui sont généralement associés à ces troubles gastro-intestinaux, tels que le syndrome du côlon irritable.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la dissection tissulaire et les étapes de fendage des nerfs sont très difficiles à maîtriser. Les nerfs innovent. Le colorectal distal peut être facilement endommagé lors de la dissection.

Ainsi, une dissection minutieuse et des étapes de séparation sont vraiment essentielles pour ceux qui veulent reproduire cette expérience. Immédiatement après l’euthanasie d’une souris, exsanguez-la, ouvrez la chambre thoracique, perforez l’oreillette droite et plongez la carcasse de la souris et environ un demi-litre de solution glacée de Creb. Ensuite, retirez soigneusement tous les viscères sauf le côlon et les organes pelviens.

Ensuite, transectez le corps de la souris à environ T 12 légèrement au-dessus du diaphragme thoracique et transférez la moitié du corps dans une chambre de dissection contenant une solution de bulles glacées. Sous un stéréoscope, retirez la vessie et les organes reproducteurs en transectant à leurs jonctions avec l’urètre. De plus, retirez l’aorte descendante jusqu’à ce qu’elle bifurque dans les artères iliaques communes.

Maintenant, libérez les nerfs du cou du splathe pelvien ou lombaire des tissus environnants. Suivez les nerfs de l’extérieur de la crête iliaque jusqu’à leur point d’entrée dans la colonne vertébrale. Les nerfs pelviens entrent dans la colonne vertébrale L six et S une colonne vertébrale et les nerfs lombaires entrent dans T 13 et L une démontrée.

Voici la dissection des nerfs pelviens gauche et droit. Ensuite, coupez la synthèse pubienne et coupez les articulations acétabulaires droite et gauche. Retirez ensuite l’os iliaque Après avoir retiré l’iliaque, disséquez le colorectal distal avec le nerf attaché Libre.

Le nerf attaché du muscle environnant et du tissu conjonctif. Le nerf est sensible aux dommages mécaniques. Nous sommes libérés de ses tissus environnants, il faut donc prendre soin d’éviter de tirer ou de pincer le nerf.

Transférez ensuite le colorectal avec le nerf attaché dans la chambre tissulaire. Ouvrez le colorectal longitudinalement le long du bord anti-mésentérique et positionnez la muqueuse colorectale vers le haut. Ensuite, étendez le nerf dans le compartiment d’enregistrement, qui est relié au compartiment de la baignoire par un trou de souris et une porte.

Positionnez le tronc nerveux sur un petit miroir en verre. Le miroir est hydrophile et le nerf va y adhérer. Maintenant, à côté du compartiment d’enregistrement, épinglez le bord mésentérique du colorectal.

Maintenant, fusionnez un compartiment de bain avec une solution Creb oxygénée chaude et remplissez le compartiment d’enregistrement avec de l’huile minérale pour terminer la configuration. Fixez la longueur anti-mésentérique du colorectal à un râteau de crochets reliés à un actionneur de force sous le stéréomicroscope à fort grossissement. Retirez soigneusement la gaine nerveuse du nerf isolé du cou du sillage pelvien ou lombaire à l’aide d’une pince fine.

Taquinez le tronc nerveux en cinq à huit faisceaux nerveux d’environ 100 microns d’épaisseur chacun. Mettez maintenant l’électrode de référence en contact avec la solution de Krebs dans la chambre tissulaire. Ensuite, positionnez séquentiellement les faisceaux nerveux individuels sur l’électrode d’enregistrement pour évoquer les potentiels d’action des ens.

Caressez doucement la surface colorectale à l’aide d’un pinceau doux. Identifiez ainsi le ou les faisceaux nerveux qui innervent le côlon. Maintenant, à l’aide d’une paire d’aiguilles de calibre 30, divisez davantage le faisceau nerveux en filaments de 10 microns d’épaisseur et placez l’un des filaments sur l’électrode d’enregistrement.

Cette étape exige un haut niveau de coordination œil-main et de dextérité. Ensuite, pour exciter électriquement les terminaisons nerveuses afférentes, positionnez l’électrode concentrique à pointe ronde perpendiculairement à la surface de la muqueuse et stimulez à une intensité supérieure au seuil. Cela produit un courant réparti sur un rayon de deux millimètres.

Pour trouver des terminaisons réceptives, déplacez systématiquement l’électrode par pas de 1,5 millimètre le long de la longueur et de la largeur du cône rectum aplati. Lorsqu’une terminaison afférente est excitée, ajustez la position de l’électrode et l’intensité du stimulus pour identifier le champ récepteur qui nécessite le moins d’intensité de stimulus pour répondre. Si le seuil de stimulus est supérieur à trois milliampères, jetez cette terminaison nerveuse et passez à l’étude d’un autre filament nerveux.

Calculez maintenant la vitesse de conduction à partir de la distance entre l’électrode de stimulation au niveau du champ récepteur et le site d’enregistrement, et à partir du délai de conduction entre l’artefact de stimulus et les débuts du potentiel d’action. Après avoir localisé un champ récepteur par stimulus électrique, appliquez trois stimuli mécaniques. Tout d’abord, appliquez un stimulus de sonde en appuyant sur l’extrémité d’un von fray calibré, comme un monofilament de nylon, perpendiculairement vers le champ récepteur sur le colorectal aplati.

Utilisez des monofilaments qui produisent une force de 0,4 gramme et d’un gramme. Deuxièmement, produisez un stimulus de caresse en caressant doucement la muqueuse colorectale avec un fin brin de filament de nylon produisant une force de 10 milligrammes pour générer une petite contrainte de cisaillement de surface au champ réceptif. Troisièmement, effectuez l’étirement circonférentiel à l’aide d’un actionneur de force contrôlé par ordinateur.

Faites-lui délivrer une force étirée par rampe dans une direction circonférentielle le long du bord anti-mésentérique du colorectal. Classez maintenant le SNE comme muqueuse séreuse, muqueuse musculaire musculaire, ou MIAA, afférente insensible à la mécanique. Sur la base des résultats des trois tests.

Commencez par enregistrer une réponse de base à un stimulus mécanique comme dans la section précédente par un sondage mécanique circonférentiel, d’étirement ou perpendiculaire pour tester la sensibilité chimique. Enduire d’abord le bord inférieur d’un morceau de tube en laiton ou en acier inoxydable de pétrole et le placer sur le champ récepteur sur le colorectal. Aspirez maintenant la solution Krebs de l’intérieur du tube et remplacez la solution par 170 microlitres de solution de test.

Laissez la tubulure en place pendant trois à cinq minutes tout en surveillant les réponses dans l’afférence. Immédiatement après avoir retiré la tubulure dans les quatre à six minutes, testez la réponse afférente au même stimulus mécanique que dans la réponse de base. Après 15 minutes ou plus, les réactifs peuvent être considérés comme lavés.

Ensuite, le stimulus mécanique est à nouveau appliqué. Pour comparer avec les fourmis de base, un nerf disséqué a été stimulé pour trouver un champ réceptif. Le champ récepteur a été identifié par une réponse de potentiel d’action utilisant le délai de conduction du potentiel d’action.

La vitesse de conduction calculée était de 43 mètres par seconde, ce qui est bien dans la gamme d’une fibre C non myélinisée. Après avoir identifié le champ réceptif, il a été sondé perpendiculairement par des monofilaments de von fray portatifs, et également caressé doucement par un fin filament de nylon tenu à la main. Les réponses AFR au palpage ont également été évaluées par un actionneur de force contrôlé par ordinateur qui délivre au même site sur le colorectal une série de forces mécaniques précisément chronométrées et reproductibles.

De même, l’étirement circonférentiel du colorectal a été fourni par le même effort d’actionneur. Les réponses peuvent être distinguées en fonction des réponses à l’exploration, à la caresse et à l’étirement d’une afférence sensible à l’étirement qui ont été évoquées par trois étirements circonférentiels consécutifs séparés de cinq minutes. Les nombres de pointes ont été épinglés uniformément et affichés sous forme de fonctions de réponse au stimulus, révélant une reproductibilité élevée et à la fois l’amplitude de la réponse et le seuil de réponse.

Ensuite, des produits chimiques ont été appliqués. L’activation directe de ens s’est produite après l’application d’une solution hypertonique acide après l’application d’une soupe inflammatoire sur une afférente mécaniquement insensible. Aucune activation de la fin ne s’est produite, mais l’acquisition de la ménosensibilité était apparente.

Une afférente sensible à l’étirement et ménosensible a également été sensibilisée à l’étirement mécanique du champ récepteur après l’application d’une soupe inflammatoire. Une fois maîtrisé, il faut généralement trois à quatre heures pour terminer la dissection tissulaire et réaliser l’enregistrement d’une seule fibre. Une expérience typique prend une journée entière du début à la fin. Après avoir vu cette vidéo, vous devriez comprendre comment enlever et récolter chirurgicalement le colorectal avec les nerfs attachés.

Ensuite, être capable d’enregistrer à partir de fibres Ahern uniques dans le nerf pelvien ou le nerf de la planche lombaire, en innervant le côlon à l’aide d’une stratégie de recherche électrique impartiale. Vous devriez alors être en mesure d’identifier les terminaisons réceptives dans le corectum et de les tester pour la sensibilité mécano ainsi que la sensibilité à la chimiothérapie en appliquant des produits chimiques directement sur les terminaisons réceptives. Cette préparation est une préparation puissante qui vous permet d’étudier les mécanismes physiopathologiques ainsi que les questions physiologiques de base chez le colorectal.