Spectrométrie de masse approches pour étudier la structure des protéines et interactions dans lyophilisées Poudres

L’objectif général de cette procédure est de surveiller la structure d’une protéine à haute résolution en utilisant l’échange d’hydrogène et le marquage lytique en chaîne latérale couplé à la spectrométrie de masse. Ceci est accompli en lyophilisant d’abord, la protéine en présence de différents excipients. Dans l’échange d’hydrogène deutérium à l’état solide, la protéine lyophilisée est exposée à la vapeur d’oxyde de deutérium dans un dessiccation scellé sous une humidité relative et une température contrôlées.

Pour le marquage lytique, la protéine est lyophilisée à l’aide d’excipients et d’un agent photoréactif. Le flacon est ensuite irradié avec la lumière UV pour fixer de manière covalente l’agent à la protéine. Pour chaque méthode, les échantillons sont reconstitués et analysés à l’aide d’un spectromètre de masse à la fois à la résolution des protéines intactes et des peptides.

Ces deux méthodes fournissent des informations complémentaires. Les formulations dans lesquelles la structure protéique est fortement conservée montrent une diminution de l’absorption du deutérium et une augmentation du marquage lytique, tandis que celles dont la structure est perturbée montrent une augmentation de l’absorption du deutérium et une diminution du marquage lytique. Le marquage chimique, tel que l’échange d’hydrogène deutérium et la photoréticulation, couplé à l’analyse par spectrométrie de masse, a récemment été adapté pour étudier la structure et les interactions des protéines dans des supports vivants.

Le principal avantage de ces techniques par rapport aux méthodes existantes telles que la spectroscopie CD et FDIR est que la structure et l’environnement des protéines peuvent être sondés avec une haute résolution à l’état solide. Pour commencer, placez 200 millilitres d’oxyde de deutérium dans le compartiment inférieur d’un dessiccation et ajoutez 400 grammes de carbonate de potassium Pour faire une solution saturée, placez la plaque de dessiccation de porcelaine à l’intérieur et fermez hermétiquement la dessiccation. Laissez-le s’équilibrer à cinq degrés Celsius pour atteindre une humidité relative stable proche de 43 %Ensuite, placez les flacons non bouchés contenant des protéines lyophilisées dans le compartiment supérieur de la dessiccature, scellez la dessiccation et incubez à cinq degrés Celsius.

Pour initier la réaction d’échange d’hydrogène deutérium afin de prélever un échantillon, bouchez le flacon immédiatement après l’avoir retiré de la dessiccation, puis éteignez la réaction en congelant instantanément le flacon et l’azote liquide. Conservez le flacon à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’analyse spectrométrique de masse. Utilisez la spectrométrie de masse à haute résolution pour analyser les échantillons afin de minimiser les échanges arrière.

Comment se déroule le système de chromatographie en phase liquide à l’intérieur d’une boîte réfrigérée ? Pour installer l’instrument, connectez d’abord la boucle d’échantillonnage et le piège à protéines à la vanne qui contrôle les processus de dessalage et d’élution. Ensuite, calibrez le système en injectant le mélange de réglage à faible concentration dans le spectromètre de masse et en réglant la plage de rapport masse/charge de 200 à 3 200.

Ensuite, refroidissez le système réfrigéré à une température de fonctionnement stable d’environ zéro degré Celsius. Préparez le tampon de trempe contenant 0,2 % d’acide formique et 5 % de méthanol dans de l’eau et refroidissez-le sur de la glace. Après avoir transféré les échantillons dans de l’azote liquide, retirez soigneusement un flacon et reconstituez l’échantillon en ajoutant deux millilitres de tampon de trempe.

Ensuite, chargez une méthode HPLC et de spectrométrie de masse appropriée. Pour analyser l’échantillon ici, dessalez 20 picomoles de myoglobine dans le piège à protéines pendant 1,7 minutes avec 5 % d’acétylnitrile et 0,1 % d’acide formique. Ensuite, éluez la protéine sur un gradient de 3,3 minutes, en augmentant à 80 % d’acéto nitrile et 0,1 % d’acide formique.

Injectez l’échantillon et collectez les spectres de masse sur une plage de rapport masse/charge de 200 à 3 200. Pour déterminer la masse de la protéine intacte comme référence, utilisez la même méthode avec un échantillon de protéine indûment évalué. Pour l’analyse d’échantillons de myoglobine, réglez la plage de masse de 15 à 18, les kilodaltons, la résolution de masse à un Dalton et le cerf-volant de crête à 90 %Pour l’analyse peptidique, préparez les échantillons en utilisant le même protocole que pour les protéines intactes.

Lorsque les échantillons sont prêts à être analysés, connectez une colonne de pépins immobilisée et une colonne analytique à la valve et remplacez le piège à protéines par un piège à peptides. Calibrez le système pour les peptides a fonctionné pour les protéines intactes, mais en réglant la plage de rapport masse/charge de 100 à 1700, puis refroidissez le système réfrigéré à une température de fonctionnement stable d’environ zéro degré. Une fois le système étalonné, programmez la méthode HPLC et de spectrométrie de masse appropriée.

Ici, digérez 20 picomoles de myoglobine sur la colonne Pepin avec 0,1 % d’acide formique dans l’eau programmez la méthode pour piéger et dessaler les peptides dans le piège à peptides pendant 1,7 minutes avec 10 % d’acétylnitrile et 0,1 % d’acide formique, et pour éluer les peptides en quatre minutes avec un gradient augmentant à 60 % d’acétylnitrile et 0,1 % d’acide formique. Ensuite, injectez l’échantillon et collectez les spectres de masse sur une plage de rapport masse/charge de 100 à 1700. Analyser un échantillon de peptide non daté à l’aide de la spectrométrie de masse en tandem pour identifier les fragments peptiques.

Ensuite, recoupez le fragment déterminé expérimentalement avec les masses prédites générées par le logiciel. Ensuite, réglez la limite de masse à 10 parties par million pour éliminer les masses avec une erreur élevée pour les peptides avec des correspondances. Notez l’état de charge de la séquence peptidique et le temps de rétention.

Utilisez les données peptidiques compilées pour calculer le nombre moyen de deutéros incorporés par fragment peptique À l’aide du logiciel d’analyse de données Tout d’abord, lyophilisez la protéine avec l’excipient et la lucine comme indiqué dans le protocole textuel. Après la préparation des échantillons, allumez un réticulant UV contenant des lampes UV de 365 nanomètres. Laissez les lampes chauffer pendant cinq minutes.

Une fois que les lampes sont chauffées, éteignez-les et placez les flacons non bouchés contenant la formulation à l’intérieur de la chambre de réticulation. Irradiez les échantillons avec une lumière UV pendant 40 minutes et incluez des échantillons sans photoleucine comme contrôle Après l’irradiation, bouchez et stockez les flacons à moins 20 degrés Celsius jusqu’à l’analyse par spectrométrie de masse. Préparez les échantillons pour l’analyse en ajoutant de l’eau distillée de qualité spectrométrie de masse pour obtenir une concentration finale en protéines de deux micromolaires.

Ensuite, analysez les échantillons en utilisant la même méthode de spectrométrie de masse que pour les protéines deutérées intactes. Mais n’utilisez pas le système lc réfrigéré. Acquérir des données de spectrométrie de masse pour un échantillon de protéine non marqué afin de déterminer la masse native de la protéine.

Effectuer l’analyse des données comme pour les échantillons DERATED pour l’analyse du niveau peptidique. Tout d’abord, effectuez un marquage photolithique à l’état solide avec des protéines intactes et stockez-les à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, reconstituez l’échantillon avec un tampon de bicarbonate d’ammonium de 100 millimolaires pour obtenir une concentration finale de protéines de 10 micromolaires.

Mélangez l’échantillon avec de la trypsine dans un rapport de 10 à une molaire de protéines à la trypsine et incubez ce mélange à 60 degrés Celsius pendant 16 heures. Pendant ce temps, connectez la boucle d’échantillonnage, le piège à peptides et la colonne analytique à la vanne du système HPLC. Après avoir digéré la protéine, éteignez la réaction en ajoutant 0,1 % d’acide formique dans l’eau pour obtenir une concentration finale en protéines de deux micromolaires.

Ensuite, programmez le système avec les méthodes HPLC et de spectrométrie de masse. Ici, injectez et dessalez 20 picomoles de myoglobine digérée dans le piège à peptides pendant 1,5 minute avec 5 % d’acéto nitrile et 0,1 % d’acide formique, éluez les peptides en augmentant le gradient sur 22 minutes à 55 % d’acétylnitrile et collectez les spectres de masse sur une plage de 100 à 1700 rapport masse/charge. Utilisez un outil en ligne pour calculer la masse théorique du peptide.

Adduit à la photoleucine avec les nombres de photoleucine précédemment obtenus à partir de l’analyse des protéines intactes. Incluez au moins quatre décolletés manqués. Créez une liste de masse dans Excel pour l’adduit photo leucine peptidique.

Ensuite, faites correspondre la liste de masse théorique avec les masses observées expérimentalement en définissant un point de coupure pour identifier les masses à faible erreur. Lors de l’échange d’hydrogène deutérium, le dépliage de la protéine permet de remplacer l’hydrogène par des protéines de deutérium qui conservent leur structure et sont moins sujettes à l’échange de deutérium. Lorsque la spectrométrie de masse d’échange d’hydrogène deutérium à l’état solide a été réalisée sur des formulations de myoglobine contenant du talose et du sorbitol, la formulation contenant du sorbitol a montré une absorption de deutérium supérieure de 46 %, ce qui suggère que la structure de la myoglobine dans le sorbitol est plus perturbée pendant le processus lytique.

La photoleucine réticule-t-elle vers les chaînes latérales d’acides aminés accessibles. L’analyse par spectrométrie de masse photolytique à l’état solide du sorbitol et des TLO contenant de la myoglobine a montré une plus grande absorption de photo-eine dans la formulation des TLO que dans son homologue. Cela suggère que les chaînes latérales sont restées accessibles dans la formulation des TLO.

L’échange d’hydrogène deutérium et le marquage lytique utilisent tous deux des régions disponibles dans le commerce et des instruments MS facilement disponibles pour caractériser les protéines à l’état solide pour une formulation donnée. Le temps total écoulé entre la préparation de l’échantillon et l’analyse complète des données est inférieur à deux semaines. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir des informations à haute résolution sur la structure des protéines et leur importance dans la conception de formulations de protéines lyophilisées stables.