Développement d'un modèle Colite antigène conduit à étudier la présentation des antigènes par les cellules présentatrices d'antigènes aux cellules T

L'objectif général de ce modèle de colite induite par un antigène est de déterminer si les phagocytes mononucléés positifs pour CX3CR1 interagissent avec et activent les lymphocytes T CD4 positifs au cours d'une colite spécifique à l'antigène, et si cette expansion des lymphocytes T effecteurs dépendante des phagocytes mononucléés se produit au sein de la lame propre intestinale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies inflammatoires de l'intestin, telles que les types d'interactions qui se produisent entre les cellules présentatrices d'antigènes et les lymphocytes T effecteurs dans la lame propre colique. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'étudier les interactions entre cellules immunitaires ainsi que les éléments menant à la pathogénicité des maladies inflammatoires de l'intestin.

Cette méthode utilise le modèle de colite par transfert de cellules T, dans lequel des cellules T CD4 naïves spécifiques de l'antigène, marquées par une fluorescence rouge, sont transférées chez un hôte immunodéficient exprimant la protéine fluorescente verte dans les cellules mononucléées. Le transfert cellulaire est suivi par une administration orale par sonde de bactéries exprimant un antigène marqué d'une fluorescence bleue. Les événements immunitaires se produisant dans la lame propria intestinale des hôtes peuvent être suivis à divers stades du développement de la maladie.

Utilisez des ciseaux de dissection pour ouvrir le côlon longitudinalement et lavez le tissu dans une boîte de Pétri contenant 25 millilitres de PBS afin d'éliminer tous débris et mucus. Coupez le côlon en morceaux de cinq à huit millimètres et placez les fragments obtenus dans 20 millilitres de DPBS frais sans calcium ni magnésium, supplémenté avec 10 millimolaire de HEPES et 5 millimolaire d'EDTA. Agitez le tube contenant l'échantillon au vortex pendant 30 secondes à vitesse maximale.

Ensuite, incuber à 37 degrés Celsius pendant dix minutes avec agitation douce pour éliminer l'épithélium. À la fin de l'incubation, vortexer à nouveau pendant 30 secondes. Puis, éliminer le surnageant contenant les cellules épithéliales.

Transférez les morceaux de tissu dans un nouveau tube contenant 20 millilitres de tampon PBS, HEPES et EDTA frais, puis répétez l'incubation avec les étapes de vortexage avant et après. Après la troisième répétition, toutes les cellules épithéliales sont éliminées et le surnageant est clair. Lavez délicatement les fragments de tissu au PBS pour éliminer toute cellule épithéliale résiduelle.

Couper les fragments de tissu en morceaux de deux millimètres sur deux millimètres et transférer les morceaux dans dix millimètres de milieu RPI pour la digestion, supplémenté avec 0,5 milligramme par millilitre de collagénase de type huit et dix unités par millilitre de DNase un. Vortexer les échantillons pendant 30 secondes. Ensuite, incuber les morceaux de tissu à 37 degrés Celsius sous agitation pendant 30 à 35 minutes et vortexer le tube toutes les cinq minutes pendant l'incubation.

Lorsque le tissu est digéré, filtrer la suspension obtenue à l’aide d’un tamis cellulaire de 70 microns dans un tube conique de 50 millilitres. Rincer une fois le tamis cellulaire et centrifuger pour récupérer le culot de la suspension de cellules isolées. Enfin, laver les cellules une fois dans du PBS et centrifuger.

Ensuite, déterminez le nombre de cellules viables par exclusion au bleu de trypan. La protéine de fluorescence cyan produisant l'ovalbumine chez E. coli active la production d'interféron gamma dans les cellules OT-II in vitro, contrairement à E.

coli exprimant uniquement le CFP. L'imagerie confocale 3D ex vivo du tissu colique de souris transgéniques exprimant la protéine fluorescente verte, nourries avec des œufs de E. coli PCFP, démontre la présence de bactéries exprimant la protéine fluorescente à l'intérieur des cryptes coliques près des cellules épithéliales intestinales et co-localisées avec les phagocytes intestinaux de l'hôte.

Dans les animaux rouges OT-II, les cellules T CD4 positives sont caractérisées par leur co-expression de la protéine fluorescente rouge et du V bêta cinq virgule un. Lorsqu'elles sont exposées à l'ovalbumine E. coli PCFP, les souris transgéniques déficientes en lymphocytes BNT et exprimant la protéine fluorescente verte, qui ont reçu une transplantation adoptive de cellules T CD4 positives OT-II rouges et positives pour le ligand CD62, perdent rapidement du poids corporel et développent des signes cliniques de colite.

Sept jours après le transfert des cellules, seuls quelques phagocytes de l'hôte ont prélevé des ova E. coli PCFP et aucune cellule OT-II rouge positive n'est détectée. Quatorze jours après le transfert des cellules, les phagocytes de l'hôte ayant prélevé l'E.

Les ovules PCFP d'E. coli se trouvent en étroite proximité avec les cellules OT-II rouges positives transférées de façon adoptive. À 21 jours après le transfert cellulaire, un grand nombre de cellules hôtes ont capté les ovules PCFP d'E. coli et les cellules donneuses OT-II rouges positives, qui sont réparties dans toute la lame propria colique et sont en contact étroit avec les phagocytes intestinaux de l'hôte.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est correctement exécutée. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que la coloration des lymphocytes intestinaux et l'analyse des cytokines sériques, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant l'état d'activation des cellules T CD4 et de confirmer la gravité de la colite. À chaque avancée, cette technique ouvre la voie à des recherches dans le domaine de l'immunologie pour explorer les petits événements menant à la maladie inflammatoire de l'intestin dans le modèle murin.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler les cellules immunitaires de la lame propre colique pour une analyse ex vivo en aval.