Développement d'un modèle Colite antigène conduit à étudier la présentation des antigènes par les cellules présentatrices d'antigènes aux cellules T

L’objectif global de ce modèle de colite induite par l’antigène est de déterminer si les phagocytes mononucléaires CX3 et CR1 positifs interagissent avec les lymphocytes T CD4 positifs et les activent au cours de la colite spécifique de l’antigène et si cette expansion des lymphocytes T effecteurs mononucléaires dépendante des phagocytes se produit dans la lamina propria intestinale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies inflammatoires de l’intestin, telles que les types d’interaction qui se produisent entre les cellules présentatrices d’antigènes et les cellules T effectrices dans la lamina propria du côlon. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’étudier l’interaction des cellules immunitaires et les éléments qui conduisent à la pathogénicité des maladies inflammatoires de l’intestin.

Cette méthode utilise le modèle de colite de transfert de lymphocytes T, dans lequel les lymphocytes T CD4 naïfs spécifiques de l’antigène fluorescent rouge sont transférés à l’hôte immunodéficient, exprimant la protéine fluorescente verte dans les cellules mononucléées. Le transfert cellulaire est suivi d’un gavage oral de la bactérie exprimant l’antigène fluorescent bleu. Les événements immunitaires qui se produisent dans la lamina propria intestinale de l’hôte peuvent être surveillés à différents stades du développement de la maladie.

Utilisez des ciseaux de dissection pour ouvrir le côlon longitudinalement et lavez le tissu dans une boîte de Pétri contenant 25 millilitres de PBS pour éliminer tous les débris et le mucus. Coupez le côlon en morceaux de cinq à huit millimètres et placez les fragments obtenus dans 20 millilitres de DPBS frais sans calcium ni magnésium, complétés par dix millimolaires HEPES et cinq millimolaires EDTA. Vortex le tube avec l’échantillon pendant 30 secondes à vitesse maximale.

Ensuite, incubez à 37 degrés Celsius pendant dix minutes en secouant doucement pour retirer l’épithélium. À la fin de l’incubation, Vortex à nouveau pendant 30 secondes. Ensuite, jetez le surnageant contenant les cellules épithéliales.

Transférez les morceaux de tissu dans un nouveau tube contenant 20 millilitres de tampon PBS, HEPES et EDTA frais, et répétez l’incubation avec les étapes de vortex avant et après. Après la troisième répétition, toutes les cellules épithéliales sont retirées et le surnageant est clair. Lavez doucement les fragments de tissu dans du PBS pour éliminer toutes les cellules épithéliales résiduelles.

Coupez les fragments de tissu en morceaux de deux millimètres sur deux et transférez les morceaux pour la digestion dans dix millimètres de milieu RPI, complété par 0,5 milligramme par millilitre de collagénase de type huit et dix unités par millilitre de DNAse un. Vortex les échantillons pendant 30 secondes. Ensuite, incubez les morceaux de tissu à 37 degrés Celsius en secouant pendant 30 à 35 minutes et faites tourbillonner le tube toutes les cinq minutes pendant l’incubation.

Lorsque le tissu est digéré, filtrez la boue résultante à travers une passoire à cellules de 70 microns dans un tube conique de 50 millilitres. Lavez une fois la crépine à cellules et faites tourner la suspension à cellule unique par centrifugation. Enfin, lavez les cellules une fois dans du PBS et centrifugez-les.

Ensuite, déterminez le nombre de cellules viables en excluant le bleu trypan. La protéine cyano-fluorescente productrice de protéine oalbumine e. coli active la production d’interféron gamma dans les cellules OT-II in vitro contrairement à e.

coli qui expriment uniquement la PFC. L’imagerie confocale 3D ex vivo du tissu colique de souris transgéniques exprimant la protéine fluorescente verte, nourries avec des ovules de E. coli PCFP, démontre la présence de la bactérie exprimant la protéine fluorescente dans les cryptes du côlon près des cellules épithéliales intestinales et co-localisée avec les phagocytes intestinaux de l’hôte.

Chez les animaux rouges OT-II, les lymphocytes T CD4 positifs sont caractérisés par leur co-expression de la protéine fluorescente rouge et de V bêta cinq virgule un. Lorsqu’elles sont exposées à des ovules d’E. coli PCFP, les souris transgéniques exprimant la protéine fluorescente verte déficiente en lymphocytes BNT qui ont été transplantées adoptivement avec des lymphocytes T CD62 positifs au ligand CD62 rouge OT-II perdent rapidement du poids et développent des signes cliniques de colite.

Sept jours après le transfert cellulaire, seuls quelques phagocytes de l’hôte ont échantillonné les ovules PCFP d’E. coli et les globules rouges positifs OT-II ne sont pas détectés. 14 jours après le transfert de cellules, les phagocytes de l’hôte qui ont échantillonné l’ovule e.

coli Les ovules PCFP sont situés à proximité des globules rouges positifs OT-II transférés par adoption. Dans les 21 jours suivant le transfert cellulaire, un grand nombre de cellules hôtes ont échantillonné les ovules PCFP d’E. coli et les globules rouges positifs OT-II du donneur, qui se trouvent dispersés dans toute la lamina propria du côlon, sont en contact étroit avec les phagocytes intestinaux de l’hôte.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est exécutée correctement. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la coloration des lymphocytes intestinaux et l’analyse des cytokines sériques peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur l’état d’activation des lymphocytes T CD4 et pour confirmer la gravité de la colite. Après chaque développement, cette technique ouvre la voie à la recherche dans le domaine de l’immunologie pour explorer les petits événements qui conduisent aux maladies inflammatoires de l’intestin dans le modèle murin.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les cellules immunitaires de la lamina propria du côlon pour l’analyse ex vivo en aval.