Une méthode de sélection aptamères Structure commutation Appliqué à un colorimétrique Or nanoparticules Assay

L’objectif global de l’expérience suivante est de générer des apti de commutation de structure pour l’intégration en tant qu’éléments de reconnaissance sur des plates-formes de détection qui fonctionnent en signalant un changement de confirmation de l’aptamère lors de la liaison de la cible. Ceci est réalisé en ajoutant une sonde de capture biotinylée et une bibliothèque d’ADN complémentaire à des billes magnétiques enrobées de streptocoque tabin pour immobiliser la bibliothèque d’ADN à la surface de la bille. Ensuite, un aimant est appliqué à la solution pour séparer les séquences de liaison des séquences non liantes restant sur les billes.

Les séquences retenues sont ensuite purifiées et amplifiées pour le prochain tour de sélection. Après quelques tours de sélection, une étape de sélection négative est ajoutée au processus. Après plusieurs cycles de sélection, l’aptr sélectionné démontre un changement structurel lors de la liaison de la cible sur la base d’un test de détection de cible de nanoparticules d’or.

L’avantage de cette technique par rapport aux techniques existantes comme la cellule X basée sur la solution, c’est qu’il n’est pas nécessaire d’immobiliser la cible sur un support solide. Les implications de cette technique sont donc dans l’évaluation du risque de l’état physiologique d’un individu, et cela est dû au fait que le cortisol est un indicateur de stress, ce qui peut conduire à l’évaluation des problèmes de santé. Utilisez toujours des solutions d’ADN fraîchement préparées pour ce protocole, en particulier pour la cible et le contrôle.

La préparation de l’ADN nécessite une attention particulière. Transférez une aliquote de 100 microlitres de la bibliothèque d’ADN dans un tube de thermocycleur et chauffez-la à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes dans un mélangeur thermique. Transférez ensuite le tube dans de la glace jusqu’à ce qu’il soit nécessaire avant d’utiliser cet ADN, déterminez sa concentration exacte sur un spectrophotomètre.

Ensuite, préparez les billes magnétiques, les billes magnétiques codées par vortex strept et transférez 400 microlitres d’entre elles dans un nouveau micro tube à centrifuger. Placez ce tube sur l’aimant pendant deux minutes et retirez le surnageant, puis lavez les billes. Ajoutez 400 microlitres de tampon de liaison et vortexez-les pour terminer le lavage.

Utilisez un aimant pour séparer les perles et jeter le surnageant. Répétez ce processus de lavage trois fois. Ensuite, immobilisez la sonde de capture sur les billes magnétiques.

Commencez par Resus en suspendant les billes et 400 microlitres de tampon de liaison avec une sonde de capture de 50 micromolaires. Ensuite, incubez les billes pendant 10 minutes en les agitant doucement à température ambiante. Pour retirer la sonde de capture libre, lavez les billes trois fois de plus comme auparavant, en utilisant 400 microlitres de tampon de liaison par lavage.

Après les trois lavages, ajoutez 400 microlitres supplémentaires de tampon et collectez 100 microlitres de solution de billes pour les étapes restantes tout en conservant le reste à quatre degrés Celsius. Le reste peut être utilisé pour les tours de sélection subséquents pendant une période pouvant aller jusqu’à trois semaines. Lorsque plus de billes sont nécessaires, elles peuvent être préparées avec des sondes plus longues pour une plus grande rigueur dans ce schéma de sélection.

Par exemple, des sondes plus longues ont été utilisées après la 13e ronde, après laquelle un enrichissement significatif a été obtenu en utilisant d’autres rigueurs. Lorsque vous utilisez des billes retirées du stockage, commencez par laver l’aliquote de travail deux fois, en utilisant 200 microlitres de tampon de liaison par lavage. Sinon, les perles fraîchement faites sont déjà propres.

Ajoutez maintenant 100 microlitres d’ADN snap cool aux perles et incubez-les pendant une demi-heure à température ambiante avec une légère agitation. Après l’incubation, isolez les billes avant de jeter le surnageant. Calculez la concentration d’ADN contenue pour déterminer la quantité d’ADN liée aux billes.

Ensuite, lavez les perles trois fois avec 200 microlitres de tampon de liaison. Laissez le tampon de liaison laver les perles en les agitant doucement pendant cinq minutes à chaque fois. Préparez ensuite la molécule cible dans un tampon de liaison à 100 micromolaires et mettez à nouveau en suspension les billes dans 200 microlitres de cette préparation, la molécule cible.

Dans ce cas, le cortisol est généralement très concentré au premier tour de sélection. Incuber les billes avec la cible pendant une demi-heure en agitant doucement dans les conditions ambiantes. Après l’incubation, conservez le snat contenant les séquences visées par la cible.

Après chaque autre cycle d’enrichissement, prélever un échantillon du surnageant final pour surveiller le processus. Retirer le cortisol du surnageant par dialyse. Cela peut être ignoré si la molécule cible n’interfère pas avec la mesure de l’absorbance de l’ADN à 260 nanomètres après chaque tour, amplifiez l’ADN de liaison cible par PCR en utilisant le surnageant collecté à partir de l’étape de sélection positive comme modèle.

Effectuez toujours un petit test PCR pour déterminer le nombre optimal d’amplifications. Prélevez des échantillons de 10 microlitres après chaque cycle et comparez-les à une échelle de 25 paires de bases. Ici, la bibliothèque doit fonctionner à 85 paires de bases sur des produits amplifiés après le 10e cycle, donc moins de cycles doivent être utilisés.

Ce résultat peut varier d’un tour à l’autre, de sorte qu’un test est toujours nécessaire. Effectuez ensuite une PCR à grande échelle en utilisant le nombre de cycles sélectionné à l’aide de huit tubes à bandelettes. Amplifiez six à huit millilitres de mélange réactionnel pour obtenir la quantité requise d’amplicon pour le prochain tour de sélection, qui se situe entre un et 2,5 nanomoles d’ADN.

Vérifiez un échantillon des produits PCR à l’aide d’un gel. Convertissez ensuite la majeure partie des produits en ADN simple brin à l’aide de billes recouvertes de streptocoques non magnétiques. Chargez 300 microlitres de billes dans une petite colonne bloquée par fritz.

Ensuite, à l’aide d’une seringue à verrouillage de leurre, lavez doucement les billes avec cinq millilitres de tampon de liaison. Lorsque vous changez la solution pour laver la colonne, retirez la seringue de la colonne et retirez le piston de la seringue. Cela permet d’éviter de perturber inutilement les billes.

Créez et lavez suffisamment de colonnes de billes pour un millilitre de produit PCR par colonne. Faites passer un produit PCR à travers les colonnes en exerçant une légère pression. Les produits de l’ADN seront retenus par les billes attachées par leurs brins antisens.

Ensuite, lavez les colonnes liées à l’ADN avec cinq millilitres de tampon de liaison pour éliminer tous les composants de la PCR, ne laissant que l’ADN du pool de liaison pour déshybrider l’ADN de la colonne ajouter 0,5 millilitre d’hydroxyde de sodium de 0,2 molaire. Ensuite, dessalez l’ADN simple brin dans l’eit à l’aide d’une colonne de dessalage préparée avec de l’eau sans nucléases. Jeter les 0,5 millilitres initiaux de coulée.

Passez ensuite un millilitre d’eau sans nucléases dans la colonne pour recueillir l’ADN dessalé. Mesurez l’absorbance de l’ADN collecté et préparez-le pour le prochain tour de sélection. Comme décrit dans le protocole textuel, l’ADN simple brin collecté est maintenant rajouté à une aliquote de billes fraîchement préparée avec une sonde de capture.

Le deuxième tour de sélection est similaire au premier avec une concentration de cortisol plus faible. Cependant, à partir du troisième tour, incorporez une étape de sélection négative avant la sélection positive. Pour le premier tour de sélection négative, ajoutez 200 microlitres d’une micromolaire de progestérone dans un tampon de liaison aux billes.

Il est structurellement similaire mais distinct du cortisol. Dans les tours suivants, augmentez la concentration de progestérone après avoir doucement secoué le mélange pendant une demi-heure à température ambiante. Jetez le supinat et lavez les perles deux fois à l’aide de 200 microlitres de tampon de liaison.

Procédez ensuite à la sélection positive. Comme décrit précédemment au fur et à mesure de l’avancement des tours, la concentration du substrat a varié pour affecter la rigueur du processus de sélection. Les détails sont discutés dans le protocole textuel.

Ensuite, suivez le protocole textuel pour effectuer le dosage des nanoparticules d’or pour la détection du cortisol. Cette lecture métrique de couleur rapide et simple repose sur un changement structurel de l’aptamère lors de la liaison de la cible. Ainsi, il fournit une métrique pour évaluer la capacité de la méthode à sélectionner des abers avec des propriétés de commutation de structure.

Un autre avantage du dosage des nanoparticules d’or est qu’il amplifie un signal de sorte qu’un aptamère d’affinité micromolaire commun aux petites molécules peut être détecté à des niveaux inférieurs de plusieurs ordres de grandeur à la constante de dissociation. Le protocole de sélection suivant a été utilisé pour isoler les abers spécifiques au cortisol. La dialyse et la surveillance de l’enrichissement ont été utilisées pour montrer une élution accrue de la molécule cible après les étapes de sélection ultérieures.

Une diminution de l’élution a été observée lorsque moins de molécule cible et des sondes de capture plus longues ont été utilisées dans les étapes finales. Le séquençage de nouvelle génération a été utilisé pour analyser l’ADN éludé après plusieurs cycles différents. Au début de la sixième ronde de sélection, un faible pourcentage de séquences avaient augmenté le nombre de copies, qui a été classé dans 20 bacs après 13 rondes.

Un pourcentage beaucoup plus important des abers étaient en nombre élevé. Puis en rendant le processus de sélection plus strict. Lors des tours 14 et 15, près de la moitié des abers sélectionnés se trouvaient au premier rang de la fréquence du nombre de copies.

Il y avait environ 3000 séquences uniques en 30 000 exécutions à ce moment-là. Le PA sélectionné a été incubé avec des nanoparticules d’or, suivi de l’ajout d’une cible ou, à titre de comparaison, de substrats de contrôle. Ce test a montré que l’AP avait plus de spécificité au cortisol qu’à l’acide colique ou à la tentative de cette procédure.

Il est important de contrôler la rigueur de la sélection à chaque tour ainsi que d’optimiser le nombre de cycles de PCR. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de sélectionner une structure de commutation AP et d’effectuer un test de détection de nanoparticules d’or.