Os milieu conditionné: Préparation et essais biologiques

L’objectif général de cette vidéo est de décrire comment préparer un milieu conditionné à l’os et de tester son activité in vitro. Pour ce faire, on récolte d’abord des éclats d’os sur la mandibule d’un porc à l’aide d’un grattoir à os. La deuxième étape consiste à traiter thermiquement, à déminéraliser ou à ne rien faire sur les éclats d’os avant de les incuber dans un milieu de culture pendant 24 heures.

Ensuite, le milieu conditionné à l’os est collecté contenant tous les facteurs libérés par les éclats d’os. La dernière étape consiste à stimuler les cellules avec le milieu conditionné à l’os ou à pré-incuber un biomatériau avec le milieu conditionné à l’os et à y ensemencer des cellules après la période d’incubation. En fin de compte, la PCR quantitative en temps réel est utilisée pour montrer les changements dans l’expression génique des cellules après le traitement.

L’utilisation de greffes osseuses autologues, seules ou en combinaison avec d’autres biomatériaux, stimule la régénération osseuse dans les défauts osseux péri-implantaires, et garantit ainsi de bons résultats à long terme. Cette vidéo présente un essai biologique in vitro, qui est utile pour déterminer la réponse génétique des cellules massales aux biomolécules dans l’état osseux. Le moyen d’état osseux peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des traumatismes, maxillo-faciaux et dentaires, par exemple pourquoi l’os autologue est l’objectif de la greffe standard dans la régénération osseuse.

La préparation d’un milieu de conditionnement à partir d’os traité, comme l’autogreffe osseuse traitée thermiquement ou la matrice osseuse isée, peut être difficile à normaliser. Par conséquent, il est important d’être précis. Pour commencer, procurez-vous des mandibules de porc fraîches auprès d’un boucher local et placez-les sur une surface ferme.

Ensuite, utilisez un périoste pour libérer un lambeau de périoste de pleine épaisseur tout en faisant particulièrement attention à ne laisser aucun des tissus mous attachés à l’os. Une fois le périoste retiré, saisissez fermement le grattoir d’os et utilisez de longs mouvements pour prélever des éclats d’os du côté buccal de la mandibule. Jetez tous les éclats d’os de moins d’un millimètre de longueur.

Empêchez les éclats d’os de se dessécher en les recouvrant rapidement d’un milieu de culture dans une boîte de Pétri de 10 centimètres. Une fois qu’un nombre suffisant de copeaux d’os ont été recueillis, préparez un lot de contrôle thermique en pasteurisant cinq grammes de copeaux d’os. Pasteurisez les copeaux en les chauffant pendant 30 minutes à 80 degrés Celsius ou en les autoclave pendant 20 minutes à 121 degrés Celsius.

Ensuite, préparez un témoin déminéralisé en ajoutant cinq grammes de copeaux d’os dans une solution molaire d’acide chlorhydrique et en les plaçant sur un agitateur pendant quatre à six heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez les éclats d’os à plusieurs reprises avec un milieu de culture jusqu’à ce qu’un pH neutre atteigne. Placez cinq grammes de copeaux d’os frais et cinq grammes de chacune des préparations de contrôle dans des plats séparés, et ajoutez 10 millilitres de milieu de culture frais dans chaque plat.

Ensuite, incubez les échantillons dans une atmosphère humidifiée à 37 degrés Celsius pendant 24 heures afin de créer le milieu conditionné le lendemain. Retirez le support de chaque plat et placez-le dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez le milieu conditionné à l’os à 200 fois la gravité pendant 10 minutes pour éliminer tous les débris.

Ensuite, retirez le surnageant et passez-le dans un filtre stérile de 0,2 micron, stockez les quadrilatères Ali congelés à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires. Commencez par ensemencer des cellules mésenchymateuses humaines telles que des cellules osseuses ou des fibroblastes gingivaux et parodontaux dans une plaque de 12 baleines à une concentration de 30 000 cellules par centimètre carré. Couvrez les cellules avec un milieu de croissance et laissez les cellules se fixer à la plaque pendant la nuit du lendemain matin.

Jetez le milieu de culture et lavez les cellules avec du PBS préchauffé à 37 degrés Celsius. Ensuite, stimulez les cellules en ajoutant un milieu de culture sans sérum préchauffé avec et sans milieu conditionné à 20 %. Si vous testez également la capacité d’absorption d’un biomatériau, ajoutez le milieu conditionné à l’os, y compris tout témoin, aux tubes contenant le biomatériau d’intérêt, et incubez les tubes à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Ensuite, rincez vigoureusement le biomatériau avec du PBS préchauffé et ensemencez des cellules mésenchymateuses humaines à une concentration de 30 000 cellules par centimètre carré sur le matériau. Incuber les cellules seules ou celles ensemencées sur les biomatériaux dans une atmosphère humidifiée à 37 degrés cellules CS pendant 24 heures. Ensuite, jetez le milieu de culture.

Rincez les cellules avec du PBS préchauffé et extrayez l’ARN des cellules à l’aide d’un protocole d’isolement d’ARN standard. Une fois l’ARN isolé, préparer des échantillons de CD NA de chaque groupe de traitement en commençant par des concentrations égales de l’ARN extrait et en exécutant une réaction de transcriptase inverse sur chaque échantillon. Ensuite, effectuez une PCR quantitative en temps réel sur les échantillons pour rechercher les niveaux de gènes sélectionnés à l’aide des amorces et des conditions énumérées dans le protocole de texte d’accompagnement.

Enfin, calculez la qualité du milieu conditionné à l’os en fonction des niveaux d’expression génique relatifs en normalisant les niveaux de seuil de cycle des gènes au gène d’entretien Gabb dh à l’aide de la méthode delta delta CT. Voici quelques résultats typiques montrant les changements dans l’expression génique des fibroblastes buccaux exposés à un milieu conditionné à l’os pendant 24 heures. Deux gènes, l’adrénaline et le trax refoulé, et trois ont tous deux été significativement régulés à la baisse à 40 % des niveaux d’origine, tandis que les interleukines 11 et 33, ainsi que la N-A-D-P-H oxydase quatre et le glycane prote quatre ont tous été régulés à la hausse jusqu’à 200 fois.

Il est intéressant de noter que les membranes de barrière de collagène utilisées pour protéger les éclats osseux des tissus mous environnants absorbent une grande partie du milieu conditionné par l’os qui est responsable des changements dans l’expression des gènes. Les membranes de collagène, cependant, n’ont pas réussi à absorber les facteurs qui contrôlent l’expression de l’interleukine 33. Par conséquent, l’expression de l’interleukine 33 n’est pas régulée dans ce contexte.

Le protocole décrit ici peut être adapté pour étudier la réponse de différents types de cellules impliquant la régénération osseuse. De plus, le protocole peut être utilisé pour préparer un milieu de conditionnement à partir d’os de traitement et d’autres remplisseurs osseux. La pertinence clinique de cet essai biologique reste incertaine.

La réponse cellulaire à la BCM in vivo est probablement plus complexe et comprend un large éventail de gènes et de cellules cibles différentes, étendant ceux présentés ici. Néanmoins, notre bioessai fournit les premières informations sur la composition vraisemblablement complexe des molécules osseuses de RAF et la réponse cellulaire in vitro.