Name: Os milieu conditionné: Préparation et essais biologiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Apprenez à préparer le milieu conditionné osseux à partir de fragments de mandibule de porc et à tester son activité biologique sur des cellules en culture. Cette méthode permet d'analyser l'expression génique par PCR quantitative.

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Les auteurs tiennent à remercier Catherine Solioz pour son aide habile.

1. Préparation BCM <ol><li> Obtenir mandibules de porcs du boucher local aussi frais que possible. Placez les mandibules sur une surface ferme et libérer un lambeau de pleine épaisseur accordant une attention particulière à ne pas laisser tout tissu doux ou périoste fixé à l&#39;os. Travailler dans un environnement propre, sans la nécessité de travailler sous la hotte à flux. </li><li> Une fois un lambeau de pleine épaisseur est libéré, utiliser un grattoir osseuse pour récolter les éclats d&#39;os du côté buccal. S&#39;il vous plaît noter que le grattoir osseuse doit être forte. Poignée fermement le grattoir osseuse et avec de longs mouvements recueillent l&#39;os. Jeter éclats d&#39;os plus petits que de 1mm. <ol><li> Pour maintenir les éclats d&#39;os natifs, placer directement les éclats d&#39;os dans les plats en plastique de 10 cm de diamètre avec un milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 1% d&#39;antibiotiques et antimycosiques ne pas les laisser se dessécher. </li><li> Pour évaluer l&#39;impact du traitement thermique, éclats d&#39;os soumis à une pasteurisation pendant 30 min à 80 ° C ouautoclave pendant 20 min à 121 ° C. </li><li> Pour évaluer l&#39;impact de la déminéralisation, secouez éclats d&#39;os dans 1 M de HCL pour 4-6 heures à 4 ° C et les laver à plusieurs reprises avec un milieu de culture jusqu&#39;à ce que le pH est neutre. </li></ol></li><li> Placez un total de 5 g de copeaux d&#39;os par 10 ml de DMEM frais complété avec 1% d&#39;antibiotiques et antimycosiques dans un nouveau récipient de plastique. </li><li> Placez les plats en plastique dans une atmosphère humidifiée à 37 ° C pendant 24 heures. Ensuite, la récolte BCM. Centrifugeuse la BCM à 200 g pendant 10 min pour éliminer les débris, filtrer stérile (0,2 nm), et de garder aliquotes congelées à -80 ° C. </li><li> Décongeler le BCM de stock immédiatement avant utilisation et d&#39;éviter les cycles de gel et dégel. </li><li> Pour les expériences indiquées, faire tremper les membranes de collagène avec le milieu BCM ou sans sérum pendant 1 heure à température ambiante. Laver vigoureusement les membranes avec du PBS et les placer dans des plaques 96 puits. Membranes humides sont ensemencées avec des cellules. </li><li> processus de préparation du BCM est résumé dans la figure 1. </li&gt; </ol> 2. Bioassays à base de cellules mésenchymateuses <ol><li> les cellules mésenchymateuses humaines graines (par exemple des cellules osseuses, gingivale et les fibroblastes du ligament parodontal) dans une plaque à 12 puits avec une concentration de 30 000 cellules / cm 2. Pour ensemencer les cellules utilisent un milieu de croissance constitué de DMEM, 10% de sérum de veau foetal et des antibiotiques. Laissez les cellules attachent à la plaque O / N. </li><li> Jeter le milieu de culture et laver les cellules avec PBS préchauffé à 37 ° C. Stimuler les cellules en ajoutant préchauffé milieu de culture sans sérum avec et sans 20% BCM. Placer les cellules dans une atmosphère humidifiée à 37 ° C pendant 24 heures. </li><li> Jeter le milieu de culture, rincer les cellules avec PBS préchauffé et extraire l&#39;ARN selon votre protocole préféré. </li><li> Ajuster la concentration de l&#39;ARN afin d&#39;avoir la même quantité d&#39;ARN dans chaque échantillon. Préparer des ADNc et effectuer une qRT-PCR pour analyser les gènes sélectionnés en utilisant les amorces indiquées dans le tableau 1. NOTE: Ce sont les dilutions de chaque composant: 2x SYBR Green, 20x amorce avant, 20x amorce inverse, 5x eau DD stérile, 5x ADNc. Le qRT-PCR est réalisée en 40 cycles de 95 ° C 15 s et 60 ° C 1 min. </li><li> Calculer les niveaux d&#39;expression relatifs en normalisant la GAPDH de gène de ménage en utilisant la méthode Δ (ACt) où ACt est la cible de CT - CT GAPDH et Δ (ACt) est stimulée ACt - ACt contrôle. </li><li> Après ce contrôle de la qualité, BCM ajouter au milieu de culture pour stimuler tous les types de cellules comprenant des cellules mésenchymateuses, des cellules hématopoïétiques ou des cellules endothéliales. </li></ol>

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<li>Stoecklin-Wasmer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorbable+collagen+membranes+for+periodontal+regeneration%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+dental+research%22%5BJournal%5D)">Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review.</a> Journal of dental research. 92, progress. 773-781 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs ont rien à révéler. Jordi Caballé-Serrano a reçu une bourse de la Fondation de la recherche dentaire et de l&#39;éducation, de Bâle, Suisse.

Support d&#39;os conditionné reflète l&#39;activité libéré de greffons osseux au cours des premiers stades de la régénération osseuse. Le protocole décrit ici peut être adapté à étudier la réponse de différents types de cellules impliquées dans la régénération osseuse. En outre, le protocole peut être utilisé pour préparer un milieu conditionné à partir de transformés os ou des charges. Les méthodes sont faciles à réaliser et de compter sur un concept simple: les facteurs libérés à partir de divers os natif et traitées....

Osseuse autologue est largement utilisé pour combler les défauts qui ont eu lieu à la suite d&#39;une malformation, une chirurgie d&#39;exérèse, la chirurgie traumatologique reconstructive, et avant le placement de l&#39;implant 1,2. Comprendre les principes biologiques de la façon dont les greffons osseux soutenir le processus de consolidation de la greffe est non seulement la clé pour comprendre pourquoi autogreffes sont considérés comme l&#39;étalon-or en chirurgie reconstructive, il est également bionique pour améliorer la conception des substituts osseux 3. Pourtant, la consolidation de la greffe est plus rapide avec de l&#39;os autologue par rapport à 4,5 substituts osseux. Ainsi, il est impératif de révéler les mécanismes moléculaires et cellulaires qui font osseuse autologue si efficace pour soutenir la régénération osseuse. Il ya trois caractéristiques de manuels de autogreffes qui sont considérés pour soutenir le 6,7 de processus de consolidation. Tout d&#39;abord, l&#39;os autologue est ostéoconducteur, fournissant des orientations pour l&#39;os nouvellement formé à croîtredans le défaut. Deuxièmement, l&#39;os autologue est ostéogénique, ce qui signifie qu&#39;il contient des cellules mésenchymateuses qui peuvent se différencier en ostéoblastes 8. Troisièmement, l&#39;os autologue est ostéoinductrice comme des facteurs de croissance comme les protéines morphogénétiques osseuses ensevelis dans la matrice peuvent initier le processus de endochondral ou même intramembranaire formation osseuse 9. Il ya un autre aspect: éclats d&#39;os fraîchement préparés détiennent une fonction paracrine sur la base des observations in vitro avec «milieu de l&#39;os-conditionné&quot; 10-15. De plus l&#39;impact de la myélopoïèse 16 convient de mentionner. Un terme similaire &quot;milieu de la matrice osseuse déminéralisée conditionné&quot; a déjà été inventé en 1996 et soutient le concept global d&#39;une fonction paracrine de l&#39;os, même lorsque traité par déminéralisation 17. Pour nos fins, BCM peut être préparé à partir de porc fraîche mandibules 10,11. Analyses protéomiques de BCM a révélé la composition complexe, y compris effet de la croissanceors et constituants de la matrice extracellulaire 10, étendant également les connaissances actuelles sur le protéasome de l&#39;os ensemble 18,19. Ainsi, BCM devrait refléter l&#39;activité libéré de diverses modifications de greffes osseuses in vitro. Qu&#39;est-ce qui se passe lorsque les cellules mésenchymateuses, par exemple celles qui sont isolées à partir de fragments d&#39;os ou de tissus mous de la bouche, sont exposés à BCM? In vitro, BCM réduit ostéogénique et la différenciation adipocytaire, et provoque une forte augmentation de l&#39;expression de 11 IL11. Génome large microréseau a révélé plusieurs gènes d&#39;être exprimés de manière différentielle dans des cellules mésenchymateuses en réponse à BCM. Parmi ces gènes sont adrénomédulline (ADM), IL11, IL33, la NADPH oxydase 4 (NOX4), des protéoglycanes 4 (PRG4 ou lubricin) et pentraxine 3 (PTX3) 15. BCM obtenu à partir de copeaux d&#39;os autoclave n&#39;a pas réussi à modifier l&#39;expression des gènes respectifs 14. BCM à partir de fragments d&#39;os qui ont subi la pasteurisation et de congélation a pumodifier l&#39;expression des gènes 14. Aussi milieu conditionné de la matrice osseuse déminéralisée (DBM-CM) modifie l&#39;expression du TGF-β gènes régulés 20. Fait intéressant, les membranes de barrière de collagène utilisées pour protéger les copeaux d&#39;os du tissu mou environnant 21,22, adsorbés les parties de BCM qui sont responsables de l&#39;évolution de l&#39;expression du gène 23. la recherche de BCM peut être étendu à d&#39;autres types de cellules impliquées dans la régénération osseuse tels que les ostéoclastes de résorption osseuse et les cellules endothéliales, pour ne nommer que quelques-uns. Globalement, les données d&#39;accumulation in vitro fournissent la base scientifique pour la conception d&#39;une étude préclinique. Le présent protocole est double: d&#39;abord, il montre comment préparer BCM. Deuxièmement, il montre comment tester son activité biologique à base de cellules mésenchymateuses in vitro.

<table><tbody><tr><td>Mandibules de porc</td><td>Grattoir à os Bucher</td><td></td><td></td>local</tr><tr><td></td><td>Hu-Friedy</td><td>PPBUSE2/36</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotiques & Antimicotiques</td><td>All life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Membranes de collagène (Bio-Gide)</td><td>Geistlich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Invitrogen Corporation</td><td>16030074</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen Corporation</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td> Kit d’isolement d’ARN hautement pur</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptor First Kit de synthèse d’ADNc</td><td>Roche</td><td>4379012001</td><td></td></tr><tr><td>Amorces</td><td>Microsynth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR Vert (pour Q-RT-PCR)</td><td>Roche</td><td>4673484001</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Roche</td><td>11666789001</td><td></td></tr></tbody></table>

os milieu conditionné: préparation et essais biologiques

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Greffes osseuses autologues sont largement utilisés dans la chirurgie orale et maxillo-faciale, orthopédie, traumatologie et. Greffes osseuses autologues ne remplacent pas seulement os manquant, ils soutiennent également le processus complexe de la régénération osseuse. Ce comportement favorable des autogreffes est attribuée aux trois caractéristiques: ostéoconductivité, osteogenicity et ostéoinductivité. Cependant, il est un autre aspect: Greffons osseux libérer une multitude de molécules, y compris les facteurs de croissance, qui peuvent cibler des cellules mésenchymateuses impliquées dans la régénération osseuse. Les propriétés paracrines des greffes osseuses peuvent être étudiés in vitro par l&#39;utilisation du support d&#39;os conditionné (BCM). Ici, nous présentons un protocole sur la façon de préparer le milieu de l&#39;os cortical conditionné à partir natif de porc os et l&#39;os qui a subi un traitement thermique ou déminéralisation. Les cellules peuvent être directement exposés à la BCM ou ensemencées sur les biomatériaux, tels que les membranes de collagène, préalablement trempées avec BCM. Nous donnons des exemples pour in vitro bioassays avec des cellules mésenchymateuses sur l&#39;expression des gènes régulés par le TGF-β. Les protocoles présentés devraient inciter à révéler davantage les effets paracrines de greffes osseuses pendant la régénération osseuse et ouvrir un chemin pour la recherche translationnelle dans le vaste domaine de la chirurgie reconstructive.

Os milieu conditionné est préparé à partir de frites fraîches d&#39;os de porc. Aperçu général du processus pour préparer BCM et à utiliser en combinaison avec des biomatériaux BCM est illustré à la figure 1 et la figure 2, respectivement. Lors de la préparation de la BCM, il est important d&#39;obtenir de grandes éclats d&#39;os avec de longs mouvements que les mouvements de courte durée ou de très petits éclats d&#39;os peut affecter la qualité de la BCM finale. Qualité de BCM peut êt...

Nous décrivons ici comment préparer milieu de l&#39;os de la climatisation (BCM) et de tester son activité in vitro.

Os milieu conditionné: Préparation et essais biologiques

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

L’objectif général de cette vidéo est de décrire comment préparer un milieu conditionné à l’os et de tester son activité in vitro. Pour ce faire, on récolte d’abord des éclats d’os sur la mandibule d’un porc à l’aide d’un grattoir à os. La deuxième étape consiste à traiter thermiquement, à déminéraliser ou à ne rien faire sur les éclats d’os avant de les incuber dans un milieu de culture pendant 24 heures.Ensuite, le milieu conditionné à l’os est collecté contenant tous les facteurs libérés par les éclats d’os. La dernière étape consiste à stimuler les cellules avec le milieu conditionné à l’os ou à pré-incuber un biomatériau avec le milieu conditionné à l’os et à y ensemencer des cellules après la période d’incubation. En fin de compte, la PCR quantitative en temps réel est utilisée pour montrer les changements dans l’expression génique des cellules après le traitement.L’utilisation de greffes osseuses autologues, seules ou en combinaison avec d’autres biomatériaux, stimule la régénération osseuse dans les défauts osseux péri-implantaires, et garantit ainsi de bons résultats à long terme. Cette vidéo présente un essai biologique in vitro, qui est utile pour déterminer la réponse génétique des cellules massales aux biomolécules dans l’état osseux. Le moyen d’état osseux peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des traumatismes, maxillo-faciaux et dentaires, par exemple pourquoi l’os autologue est l’objectif de la greffe standard dans la régénération osseuse.La préparation d’un milieu de conditionnement à partir d’os traité, comme l’autogreffe osseuse traitée thermiquement ou la matrice osseuse isée, peut être difficile à normaliser. Par conséquent, il est important d’être précis. Pour commencer, procurez-vous des mandibules de porc fraîches auprès d’un boucher local et placez-les sur une surface ferme.Ensuite, utilisez un périoste pour libérer un lambeau de périoste de pleine épaisseur tout en faisant particulièrement attention à ne laisser aucun des tissus mous attachés à l’os. Une fois le périoste retiré, saisissez fermement le grattoir d’os et utilisez de longs mouvements pour prélever des éclats d’os du côté buccal de la mandibule. Jetez tous les éclats d’os de moins d’un millimètre de longueur.Empêchez les éclats d’os de se dessécher en les recouvrant rapidement d’un milieu de culture dans une boîte de Pétri de 10 centimètres. Une fois qu’un nombre suffisant de copeaux d’os ont été recueillis, préparez un lot de contrôle thermique en pasteurisant cinq grammes de copeaux d’os. Pasteurisez les copeaux en les chauffant pendant 30 minutes à 80 degrés Celsius ou en les autoclave pendant 20 minutes à 121 degrés Celsius.Ensuite, préparez un témoin déminéralisé en ajoutant cinq grammes de copeaux d’os dans une solution molaire d’acide chlorhydrique et en les plaçant sur un agitateur pendant quatre à six heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez les éclats d’os à plusieurs reprises avec un milieu de culture jusqu’à ce qu’un pH neutre atteigne. Placez cinq grammes de copeaux d’os frais et cinq grammes de chacune des préparations de contrôle dans des plats séparés, et ajoutez 10 millilitres de milieu de culture frais dans chaque plat.Ensuite, incubez les échantillons dans une atmosphère humidifiée à 37 degrés Celsius pendant 24 heures afin de créer le milieu conditionné le lendemain. Retirez le support de chaque plat et placez-le dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez le milieu conditionné à l’os à 200 fois la gravité pendant 10 minutes pour éliminer tous les débris.Ensuite, retirez le surnageant et passez-le dans un filtre stérile de 0,2 micron, stockez les quadrilatères Ali congelés à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires. Commencez par ensemencer des cellules mésenchymateuses humaines telles que des cellules osseuses ou des fibroblastes gingivaux et parodontaux dans une plaque de 12 baleines à une concentration de 30 000 cellules par centimètre carré. Couvrez les cellules avec un milieu de croissance et laissez les cellules se fixer à la plaque pendant la nuit du lendemain matin.Jetez le milieu de culture et lavez les cellules avec du PBS préchauffé à 37 degrés Celsius. Ensuite, stimulez les cellules en ajoutant un milieu de culture sans sérum préchauffé avec et sans milieu conditionné à 20 %. Si vous testez également la capacité d’absorption d’un biomatériau, ajoutez le milieu conditionné à l’os, y compris tout témoin, aux tubes contenant le biomatériau d’intérêt, et incubez les tubes à 37 degrés Celsius pendant une heure.Ensuite, rincez vigoureusement le biomatériau avec du PBS préchauffé et ensemencez des cellules mésenchymateuses humaines à une concentration de 30 000 cellules par centimètre carré sur le matériau. Incuber les cellules seules ou celles ensemencées sur les biomatériaux dans une atmosphère humidifiée à 37 degrés cellules CS pendant 24 heures. Ensuite, jetez le milieu de culture.Rincez les cellules avec du PBS préchauffé et extrayez l’ARN des cellules à l’aide d’un protocole d’isolement d’ARN standard. Une fois l’ARN isolé, préparer des échantillons de CD NA de chaque groupe de traitement en commençant par des concentrations égales de l’ARN extrait et en exécutant une réaction de transcriptase inverse sur chaque échantillon. Ensuite, effectuez une PCR quantitative en temps réel sur les échantillons pour rechercher les niveaux de gènes sélectionnés à l’aide des amorces et des conditions énumérées dans le protocole de texte d’accompagnement.Enfin, calculez la qualité du milieu conditionné à l’os en fonction des niveaux d’expression génique relatifs en normalisant les niveaux de seuil de cycle des gènes au gène d’entretien Gabb dh à l’aide de la méthode delta delta CT. Voici quelques résultats typiques montrant les changements dans l’expression génique des fibroblastes buccaux exposés à un milieu conditionné à l’os pendant 24 heures. Deux gènes, l’adrénaline et le trax refoulé, et trois ont tous deux été significativement régulés à la baisse à 40 % des niveaux d’origine, tandis que les interleukines 11 et 33, ainsi que la N-A-D-P-H oxydase quatre et le glycane prote quatre ont tous été régulés à la hausse jusqu’à 200 fois.Il est intéressant de noter que les membranes de barrière de collagène utilisées pour protéger les éclats osseux des tissus mous environnants absorbent une grande partie du milieu conditionné par l’os qui est responsable des changements dans l’expression des gènes. Les membranes de collagène, cependant, n’ont pas réussi à absorber les facteurs qui contrôlent l’expression de l’interleukine 33. Par conséquent, l’expression de l’interleukine 33 n’est pas régulée dans ce contexte.Le protocole décrit ici peut être adapté pour étudier la réponse de différents types de cellules impliquant la régénération osseuse. De plus, le protocole peut être utilisé pour préparer un milieu de conditionnement à partir d’os de traitement et d’autres remplisseurs osseux. La pertinence clinique de cet essai biologique reste incertaine.La réponse cellulaire à la BCM in vivo est probablement plus complexe et comprend un large éventail de gènes et de cellules cibles différentes, étendant ceux présentés ici. Néanmoins, notre bioessai fournit les premières informations sur la composition vraisemblablement complexe des molécules osseuses de RAF et la réponse cellulaire in vitro.

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JoVE Journal

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Cette vidéo démontre l’évaluation de multiples activations de caspases dans des macrophages dérivés de la moelle osseuse par stimulation avec le virus de la grippe. Après la lyse des macrophages, l’inactivation thermique du lysat et la centrifugation, des caspases intracellulaires sont collectées pour une analyse immunologique ultérieure.

Évaluation de l’activation de plusieurs caspases dans les macrophages

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Procédé de génération d’un milieu conditionné par des oligodendrocytes

Le plancher est une structure essentielle des neurones de la moelle épinière en développement, fournissant des signaux diffusibles de progéniteurs et la différenciation. Nous décrivons une méthode pour produire des varangues milieu conditionné, à appliquer au tissu de la moelle épinière frais, et d'évaluer les conséquences sur les protéines d'intérêt par la biochimie.

Culture de tissus isolement de la plaque au sol et la production de milieu conditionné à évaluer les propriétés fonctionnelles des signaux plancher Plate-publié

Ce manuscrit décrit un système modèle ex vivo composé de milieux conditionnés par des organes dérivés des ganglions lymphatiques, des os, des poumons et du cerveau de souris. Ce système modèle peut être utilisé pour identifier et étudier les facteurs solubles dérivés d’organes et leurs effets sur le tropisme des organes et le comportement métastatique des cellules cancéreuses.

Génération des médias et applications Organ-conditionnés pour l&#39;étude Influences spécifiques d&#39;organes sur le cancer du sein métastatique Comportement

Le nombre de nouveaux biomatériaux conçus pour réparer les lésions osseuses importantes est en expansion continue dans le but d’améliorer la guérison osseuse et surmonter les complications associées à la transplantation osseuse. Nous présentons ici une stratégie multidisciplinaire pour les tests de biocompatibilité préclinique de biomatériaux pour la réparation osseuse.

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Ce protocole présente un test d’absorption d’acides aminés radiomarqués, utile pour évaluer la consommation d’acides aminés dans les cellules primaires ou dans les os isolés.

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Le test de flux métabolique cellulaire en temps réel mesure le taux de consommation d’oxygène et le taux d’acidification extracellulaire, qui correspond à la production mitochondriale et glycolytique d’adénosine triphosphate, à l’aide de capteurs de pH et d’oxygène. Le manuscrit explique une méthode pour comprendre l’état énergétique des ostéoblastes et la caractérisation et l’interprétation de l’état bioénergétique cellulaire.

Utilisation d’un analyseur de flux métabolique cellulaire en temps réel pour surveiller la bioénergétique des ostéoblastes

Ce protocole décrit une méthode complète d’évaluation de l’activation des caspases (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 et caspase-11) en réponse à des modèles in vitro et in vivo (chez la souris) d’infection, d’agressions stériles et de cancer pour déterminer l’initiation des voies de mort cellulaire, telles que la pyroptose, l’apoptose, la nécroptose et la panoptose.

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Nous présentons un protocole en deux étapes pour l’isolement de mitochondries de haute qualité qui est compatible avec la découverte et la quantification des protéines à l’échelle du protéome. Notre protocole ne nécessite pas de génie génétique et convient donc à l’étude des mitochondries de toutes les cellules et tissus primaires.

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Os milieu conditionné: Préparation et essais biologiques

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