Peinture chromosomique 2D et 3D chez les moustiques du paludisme

L’objectif global de cette procédure est de produire suffisamment d’amplicon d’ADN à partir d’un seul bras de chromosome polytan micro disséqué pour l’utiliser directement pour des expériences sur les poissons. Ceci est accompli en préparant d’abord des courges de chromosomes polytaniques sur des lames de membrane spécialement conçues pour la micro-dissection. La deuxième étape de la procédure consiste à isoler et à capturer des bras de chromosomes polytaniques individuels par microdissection laser.

La troisième étape consiste à isoler l’ADN de l’échantillon micro-disséqué et à amplifier l’ADN à l’aide de deux cycles d’amplification du génome entier. Les dernières étapes consistent à étiqueter l’ADN amplifié et à l’utiliser dans des expériences sur les poissons. En fin de compte, les résultats peuvent produire de l’ADN marqué par fluorescence abondante pour une région d’intérêt.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les poissons avec des clones arrière ou des fragments de PCR, est que de grandes parties des chromosomes peuvent être peintes par fluorescence avec ces sondes marquées. De plus, il n’est pas nécessaire de connaître une séquence pour les peintures chromosomiques, car elles sont isolées mécaniquement des bras chromosomiques intacts. Isolez d’abord les chromosomes, dans ce cas, des ovaires d’environ cinq moustiques fixés dans une solution fraîche de bruit de voiture.

Une fois qu’une bonne propagation chromosomique est confirmée, les chromosomes sont aplatis par dénaturation, suivie d’une incubation froide pendant la nuit. Le lendemain, les chromosomes sont déshydratés et lavés pour les préparer à la microdissection. Assurez-vous de nettoyer l’endoscope de microdissection avec de l’éthanol et de stériliser les gants et les tubes avec des UV.

Ensuite, microdiscissez les chromosomes à la suite d’une vidéo secondaire fournie dans le protocole texte. Collectez l’ADN à l’aide d’un kit de cogénération avec une modification pour accueillir un tube inversé. Poursuivez avec une purification en colonne et une élution dans l’eau.

Il existe deux voies pour l’amplification du génome entier d’un seul bras chromosomique. La racine ley g fournit un rendement initialement plus important, mais nécessite une traduction NIC pour marquer l’ADN. La racine plex du génome présente l’avantage de permettre plusieurs cycles de réplication ainsi que le marquage direct des sondes du résultat final.

Assurez-vous d’utiliser les conditions les plus stériles possibles, car l’amplification des contaminants est très probable. Pour la racine du génome plex Tout d’abord, laissez le kit WGA quatre à cellule unique produire le premier lot d’ADN amplifié. Deuxièmement, purifiez l’ADN à l’aide du kit de nettoyage et de concentration du génome.

N’oubliez pas d’éluer l’ADN de lavage à l’aide d’eau et non de tampon TE. Troisièmement, réifiez l’ADN et quatrièmement, étiquetez-le pour les poissons les deux étapes. Utilisez le kit d’amplification WGA à trois répétitions.

Le marquage de l’ADN nécessite l’utilisation d’un mélange spécial de DNTP qui incorpore un rapport spécifique de nucléotides ainsi que le DUTP marqué. Lors de l’exécution du kit de renforcement, root a d’abord utilisé son kit WGA à cellule unique en utilisant de l’eau fraîchement stérilisée et a récemment fabriqué un tampon D deux. Ensuite, suivez le protocole de traduction de la carte réseau pour étiqueter l’ADN amplifié.

Assurez-vous de vérifier la taille du fragment d’ADN sur un gel. Les fragments doivent être d’environ 200 à 500 paires de bases. Pour finir, l’une ou l’autre racine d’éthanol précipite l’ADN du marquage et centrifuge l’échantillon à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ensuite, séchez à l’air libre le granulé récupéré et ajoutez 40 microlitres de tampon d’hybridation. Une fois séchées à l’avance, préparez des lames avec des parois carrées de vernis à ongles sur lesquelles reposeront les lamelles, afin que les noyaux ne soient pas écrasés par la lamelle. Maintenant, disséquez les ovaires frais des moustiques femelles demi-graves de Christopher stade.

Transférez les ovaires dans un tube avec 150 à 250 microlitres de tampon, un toin à plus 0,5 % dans le tube. Utilisez une grosse aiguille de dissection pour détruire les membranes folliculaires. Ensuite, faites tourbillonner le tube pendant cinq à 10 minutes pour perturber davantage les follicules.

Grattez tous les gros morceaux folliculaires et centrifugez le tube pendant 30 secondes à basse vitesse, environ 500 tr/min. Transférez les surnageants dans un nouveau tube et ajoutez 100 microlitres de tampon A dans le tube d’origine contenant les follicules brisés. Maintenant, répétez les étapes d’isolement nucléaire sur les follicules brisés jusqu’à ce que le tissu visible ne soit plus que de petites particules.

Rassemblez tous les supernat dans le même tube car ils contiendront tous principalement des noyaux. Ensuite, faites pivoter le tube contenant le supernat et le tube contenant le tissu restant, qui est traité comme une sauvegarde. Jetez le supernat et ajoutez 200 microlitres de tampon A avec 0,1 % de Triton tourbillonnant vigoureusement les tubes jusqu’à ce que les pastilles soient brisées, puis incubez les échantillons pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Le lendemain, centrifugez les tubes pendant cinq minutes à 10 000 tr/min, retirez les surnageants et ajoutez 200 microlitres d’aldéhyde paraforme à 4 % dans du PBS. Ensuite, incubez les tubes dans un thermomélangeur pendant 30 minutes, en les mélangeant à 450 tr/min. Retirez le fixateur en le tournant pendant cinq minutes à 5 000 tr/min, puis jetez-le des super noms.

Ajoutez ensuite le tampon A avec 0,1 % de Triton et incubez les tubes pendant cinq minutes dans un mélangeur thermique à 450 tr/min centrifugeuse, les cellules de lavage pendant cinq minutes supplémentaires. À 5 000 tr/min, faites chauffer la sonde étiquetée à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules sont granulées, remplacez les super noms par au moins 20 microlitres de sonde marquée.

Ne vous inquiétez pas de sa concentration. Ensuite, dénaturez l’ADN à 95 degrés Celsius dans le mélangeur thermique à 450 tr/min pendant 10 minutes et poursuivez la dénaturation à 80 degrés Celsius pendant 15 minutes avec un mélange soutenu. Ensuite, baissez la température à 37 degrés Celsius et laissez l’échantillon se mélanger toute la nuit.

Le lendemain, récupérez les noyaux en les centrifugeant pendant cinq minutes. À 5 000 tr/min 2, 655 G.Remplacez le SUPERNAT par un lavage de tampon, contenant 0,1 % de tritton. Laissez les cellules se laver pendant cinq minutes en agitant à environ 500 tr/min à température ambiante.

Retirez le lavage avec une autre centrifugation et répétez le processus de lavage deux fois de plus. Après avoir retiré le troisième lavage, remettez directement les noyaux en suspension en une goutte d’anti-décoloration prolongée avec DPI. Terminez en transférant les noyaux avec soin, en évitant les bulles sur une lame préparée et appliquez une lamelle de génome plex et ee.

Les kits WGA unicellulaires ont tous deux été utilisés comme décrit sur les tissus des moustiques. L’ADN résultant a été comparé par électrophorèse sur gel. De toute évidence, le rendement variait considérablement et cela a également été confirmé par la spectroscopie.

L’étude Fish a été réalisée à l’aide de cinq sondes pour micro-disséqué sur les chromosomes polytaniques des moustiques. Quatre alarmes autosomes ont été étiquetées avec trois fluoro quatre à l’aide du kit WGA three. Les trois chromosomes R sont marqués en fluorescéine verte.

Le chromosome trois L est dans un mélange de rouge et de jaune. Les deux chromosomes R sont en jaune et les deux chromosomes L sont en rouge. Le chromosome X a été marqué en orange à l’aide de la traduction NIC du matériel ley G et d’une expérience distincte pour établir la correspondance entre les parties chromatiques e des bras chromosomiques polytaniques et mitotiques.

Les peintures chromosomiques ont été hybridées en chromosomes interphases. Les deux bras R sont étiquetés en vert. Le bras trois R est en rose et le bras en trois L est étiqueté en orange.

La chromatine est colorée en bleu par DPI Des chromosomes de prophase ont été observés. Le chromosome X a une étiquette rouge correspondant aux 18 chromosomes de métaphase de la sonde S-R-D-N-A Pro qui ont été observés ensuite. Des chromosomes en métaphase ont également été trouvés.

Les régions colorées en bleu vif correspondent à l’hétérochromatine pour visualiser l’organisation 3D d’un seul bras de chromosome polytan dans le noyau cellulaire. Le poisson entier a été réalisé sur la souche sue. Les territoires du bras chromosomique des cellules nourricières de l’ovaire du moustique sont clairement visibles sur les chromosomes polytans.

De même, des territoires distincts du bras chromosomique sont clairement visibles dans les noyaux à l’interface. Lors de cette procédure, il est important d’effectuer toutes les étapes en tenant compte des risques de contamination. Il est très facile de contaminer les échantillons, ce qui entraîne un faible rendement d’amplification de l’ADN prévu.