En comparant l'affinité des protéines de liaison en utilisant GTPase Compétition dosages

L'objectif général de cette procédure est de comparer les affinités relatives des partenaires de liaison des protéines pour les GTPases de la famille Row dans des conditions de chargement en nucléotide soigneusement contrôlées. Cela est réalisé en premier lieu par la purification de partenaires de liaison compétitifs présumés, chacun marqué avec la même étiquette, par exemple, la protéine fluorescente verte ou GFP. La deuxième étape consiste à purifier la GTPA d'intérêt.

Par exemple, RAC1 est chargé avec le nucléotide approprié afin d'atteindre l'état de signalisation souhaité de la GTPath. Ensuite, la GTPath chargée en nucléotide est incubée avec une quantité fixe d'un partenaire compétiteur de liaison et des quantités croissantes d'un autre partenaire compétiteur de liaison, afin d'obtenir une courbe de titrage d'interaction. La dernière étape consiste à séparer les protéines liées à la GTPath immobilisée par immunotransfert (western blot) et à sonder la membrane pour détecter la marque GFP partagée par les deux partenaires d'interaction.

En fin de compte, le Western blot est utilisé pour identifier les concentrations relatives auxquelles des quantités similaires de chaque partenaire de liaison marqué par la GFP sont capturées par la GTPase. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la co-précipitation, est que les propriétés de liaison protéique de la GTPase sont déterminées par le nucléotide lié dans la cellule. Le nucléotide lié étant labile, l'interprétation des données de liaison protéique devient difficile.

Commencez cette procédure par la purification de la protéine G tpa marquée par un marqueur GST et par l'expression des protéines de liaison à gtpa, comme décrit dans le protocole écrit. Rincez les flacons de cellules transfectées avec du tampon salin phosphate ou PBS et laissez égoutter le flacon pendant cinq minutes. Aspirez le liquide libre, puis grattez les cellules dans 500 microlitres de tampon de lyse et transférez-les dans un tube microfuge. Mélangez les cellules pour les lyser par retournement à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.

Pendant la lyse, lavez deux lots de 40 microlitres de billes GFP trap trois fois avec du tampon de lyse frais en centrifugeant les billes à 2 700 ×g pendant deux minutes entre chaque lavage. Après la lyse, clarifiez les lysats par centrifugation à 21 000 ×g pendant 10 minutes.

Transférez le lysat clarifié de chacune des protéines compétitrices vers des billes GFP trap préalablement lavées. Incubez pendant deux heures afin de permettre la liaison des protéines de fusion GFP, en mélangeant par retournement à quatre degrés Celsius. Lavez les billes GFP trap chargées deux fois dans le tampon de lyse et deux fois dans le tampon de compétition.

Sédimenter les billes dans le tampon de liaison à 2 700 ×g pendant deux minutes entre chaque lavage. Éluer les protéines de fusion GFP en ajoutant 40 microlitres de glycine 0,2 M et en pipetant haut et bas pendant 30 secondes ; sédimenter immédiatement les billes à 21 000 ×g pendant 60 secondes, puis transférer le liquide dans un nouveau tube de centrifugation contenant quatre microlitres de Tris HCl 1 M. Effectuer cette étape rapidement afin de limiter les dommages à la protéine purifiée. Analyser un microlitre de chaque protéine purifiée par immunotransfert et sonder avec un anticorps anti-GFP pour déterminer le rendement relatif, en utilisant un système de transfert quantitatif selon le protocole du fabricant.

Égaliser la concentration molaire des protéines par ajout de tampon de liaison compétitive. Prélever 90 microlitres des billes GST préparées du rack un et laver trois fois avec le tampon de chargement en nucléotide en utilisant un séparateur de particules magnétiques pour précipiter les billes à chaque étape. Aspirer le tampon des billes et ajouter 100 microlitres de tampon de chargement en nucléotide selon que le chargement avec G-D-P-G-T-P ou sans nucléotide est requis.

Pour l'expérience de compétition, ajouter 12 microlitres de GDP à 100 millimolaire, 12 microlitres de GTP gamma S à 10 millimolaire ou aucun nucléotide à 60 microlitres de billes GST-RACK1 pour les contrôles de chargement en nucléotide. Répartir les billes restantes en trois aliquots de 10 microlitres et ajouter 2 microlitres de GDP à 100 millimolaire, 2 microlitres de GTP gamma S à 10 millimolaire ou aucun nucléotide à chaque tube. Incuber les mélanges de billes pendant 30 minutes à 30 degrés Celsius sous agitation.

Stabiliser le rack contenant les nucléotides en ajoutant un molaire de chlorure de magnésium au mélange expérimental et aux mélanges témoins afin d'effectuer la liaison compétitive. Préparer six tubes microfuge, chacun contenant 200 microlitres de tampon de liaison compétitive.

Chaque tube doit également contenir 10 microlitres du support chargé en nucléotides, une bille et cinq microlitres du support. Ajouter à chaque tube 0, 1, 2, 0,55, 10 ou 20 microlitres du support contenant une protéine de liaison A en tant que protéine de liaison constante, et une protéine de liaison B en tant que protéine de liaison variable. Ces volumes supposent des concentrations stock approximativement égales des protéines de liaison constante et variable, et pourraient nécessiter un ajustement.

Compléter le volume total du mélange de liaison à 235 microlitres en ajoutant le tampon de liaison compétitive. Ensuite, préparer un tube de microcentrifugation contenant 200 microlitres du tampon de compétition. Ajouter 10 microlitres de nucléotide expérimental chargé sur le rack, une perle et 10 microlitres de protéine de liaison A du rack un. Puis préparer les tubes témoins G-D-P-G-T-P gamma S et sans nucléotide comme décrit dans le protocole écrit.

Incuber les tubes pendant deux heures en mélangeant par retournement à quatre degrés Celsius après l'incubation. Laver les billes trois fois avec le tampon de liaison compétitif. Enfin, éluer les protéines liées dans 20 microlitres de tampon d'échantillonnage réducteur.

Le western blot quantitatif de la marque GFP des protéines GFP RCC deux et GFP Corona dans un domaine C-propulseur purifiées révèle que la protéine de la bande supérieure, GFP RCC deux, est 1,4 fois plus abondante que celle de la bande inférieure et doit donc être diluée afin d'obtenir un rapport molaire un pour un pour l'expérience de compétition. Une expérience témoin démontre que l'état de chargement en nucléotide de rack un détermine la spécificité de liaison, en titrant des volumes croissants de GFP RCC deux contre un volume fixe de GFP Corona dans un domaine C-propulseur à concentration équimolaire, suivie d'un immunotransfert. Les protéines qui se lient à rack un permettent de visualiser le changement relatif de protéine liée en traçant les intensités des bandes GFP pour les deux compétiteurs sur le même graphique, et en identifiant le point d'intersection des droites, ce qui permet de déterminer le volume de protéine de liaison variable à l'équilibre.

Cependant, il faut faire attention à ce que des problèmes tels que l'interaction entre les concurrents ou un excès d'appât GTPa ne compromettent pas l'expérience. Une augmentation d'un concurrent sans perte de l'autre, comme indiqué ici, signale un problème lors de la réalisation de cette procédure. Il est important de vérifier qu'il existe une relation réciproque entre l'abondance des partenaires de liaison concurrents.

Il existe plusieurs problèmes qui peuvent fausser les résultats et qui peuvent être résolus dès lors qu'ils sont identifiés par l'analyse des données.