Name: En comparant laffinité des protéines de liaison en utilisant GTPase Compétition dosages (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Apprenez à comparer les affinités de liaison des partenaires protéiques pour les GTPases de la famille Rho, notamment Rac1, en utilisant des conditions de chargement nucléotidique contrôlées et le Western blot.

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1. Purification de GTPase de la TPS-étiqueté <ol><li> Culture un E. coli comme BL21 transformées par pGEX-Rac1 O / N à 37 ° C, en agitant à 220 rpm, dans 500 ml de milieu de autoinduction (25 mM Na 2 HPO 4, 25 mM KH 2 PO 4, 50 mM NH 4 Cl, 5 mM de Na 2 SO 4, MgSO 4 2 mM, CaCl2 2 mM, 0,5% de glycerol, 0,05% de glucose, 0,2% de lactose, 5 g de tryptone, 2,5 g d&#39;extrait de levure, 100 pg / ml d&#39;ampicilline). </li><li> Récolte de bactéries par centrifugation pendant 10 min à 10 000 xg, 4 ° C. </li><li> Remettre en suspension culot bactérien dans 20 ml de réactif d&#39;extraction de protéine, inhibiteur de la protéase 1x et incuber pendant 20 min à température ambiante avec inversion. </li><li> Clarifier le lysat par centrifugation à 40 000 g pendant 30 min. </li><li> Ajouter 2 ml de billes magnétiques de glutathion, lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS: 10 mM de Na 2 HPO 4, 1,8 mM de KH 2 PO 4, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM). </li><li> Incuber pendant 2 h, le mélange par inversion à 4 ° C. </li><li> Laver les billes de protéine chargée par quatre fois avec 10 ml de PBS, en utilisant un trieur de particules magnétiques afin de précipiter les billes à chaque étape. </li><li> Billes dans deux ml de PBS et les remettre en suspension la protéine magasin chargé à -80 ° C dans 100 ul de parties aliquotes jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 2. Expression de protéines de liaison à GTPase <ol><li> La veille de l&#39;expérience, des plasmides transfecter codant la protéine fluorescente verte (GFP) -tagged versions de chaque protéine GTPase-contraignant dans un 75-cm 2 ballon séparé de HEK293T comme suit. Pour la validation des nucléotides chargement, transfect GFP-tagged TrioD1 dans un troisième de 75 cm 2 flacon de HEK293T. <ol><li> Diluer polyethylamine à 1 mg / ml dans 100 ul de NaCl 150 mM stérile. </li><li> Ajouter 27 ul polyethylamine diluée à 223 ul réduits médias sériques. </li><li> Ajouter ADN plasmidique de 12 ug à 250 pi réduits médias sériques. </li><li> Incuber chaque tube pendant 2 minutes à température ambiante. </li&gt; <li> Combinez le polyethylamine et l&#39;ADN se mêle dans un seul tube et vortex pendant 2 min. </li><li> Incuber pendant 15-20 min à température ambiante. </li><li> Remplacez le support de croissance (milieu Eagle modifié Dulbecco, 10% de sérum fœtal bovin, 2 mM de L-glutamine, pas d&#39;antibiotiques) sur 90% de confluence HEK293T avec 5 ml de milieu de croissance frais. </li><li> Ajouter le mélange combiné polyethylamine / ADN à incuber la fiole et O / N à 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol></li></ol> 3. Purification des protéines de liaison à GTPase <ol><li> Rincer flacons de cellules transfectées dans du PBS et égoutter flacon pendant 5 minutes, aspirer le liquide libre. </li><li> Racler les cellules dans 500 ul de tampon de lyse (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1% de Nonidet P-40, 1x inhibiteur de protease) en tube de microcentrifugation. </li><li> Lyse des cellules par mélange par inversion à 4 ° C pendant 30 min. </li><li> Au cours de lyse, laver deux lots de 40 ul perles GFP-Trap trois fois avec le tampon de lyse frais, perles sédimentation à 2700 g pendant 2 min entre les lavages. </li><li> Clarifier les lysats par centrifugation à 21 000 xg pendant 10 min. </li><li> Transfert précisé lysat de chacune des protéines de concurrents pour séparer les perles lavées GFP-trap et permettent protéines GFP-fusion pour lier pendant 2 heures, le mélange par inversion à 4 ° C. Gardez lysat de cellules GFP-TrioD1 sur la glace. </li><li> Laver chargés perles GFP-Trap deux fois dans 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 50 mM de NaCl, 0,7% (p / v) Nonidet P-40 et deux fois dans 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), mM MgCl 20 2 , sédimentation perles à 2700 g pendant 2 min entre les lavages. </li><li> Éluer les protéines de fusion GFP-40 ul en ajoutant 0,2 M de glycine (pH 2,5) et aspiration et refoulement pendant 30 sec. Immédiatement perles sédiments à 21 000 g pendant 60 s et le liquide de transfert à un nouveau tube de centrifugeuse contenant 4 pi 1 M Tris-HCl (pH 10,4). Le faire rapidement pour limiter les dommages à la protéine purifiée. </li><li> Analyser 1 pi de chaque protéine purifiée par Western blot et la sonde avec un anticorps anti-GFP pour déterminer le rendement relatif en utilisant un Blott quantitativeing système selon le protocole du fabricant. En variante, la détermination des concentrations de protéines par l&#39;acide (BCA) bicinchoninique dosage mais cela introduit des erreurs si les protéines ne réagissent pas avec le dosage d&#39;une manière identique ou il ya protéines contaminantes. </li><li> Égaliser la concentration molaire de la protéine par l&#39;addition de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl2. </li></ol> 4. Nucleotide chargement de GTPase <ol><li> Décongeler une aliquote de billes magnétiques TPS-Rac1, préparés à l&#39;étape 1. </li><li> Prendre 90 pl de billes de GST-Rac1 et laver trois fois avec 20 mM de Tris-HCl (pH 7,6), NaCl 25 mM, DTT 0,1 mM, EDTA 4 mM, en utilisant un trieur de particules magnétiques afin de précipiter les billes à chaque étape. </li><li> Aspirer à partir du tampon de perles et ajouter 100 ul de 20 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM de NaCl, 0,1 mM de DTT, 4 mM d&#39;EDTA. </li><li> Selon que le PIB, GTP ou non nucléotidique chargement est nécessaire pour l&#39;expérience de la concurrence, ajouter 12 ul PIB 100 mM, 12 mM ul gu 10anosine 5 &#39;- [γ-thio] triphosphate (GTPyS) ou pas de nucléotides à 60 pi perles TPS-Rac1. </li><li> Pour les contrôles nucléotidique de chargement, les billes restantes divisé en trois aliquotes de 10 ul et ajouter 2 ul de 100 mM de PIB, 2 ul de 10 mM de GTPyS non nucléotidique ou de chaque tube. </li><li> Incuber les mélanges de billes pendant 30 min à 30 ° C avec agitation. </li><li> Stabiliser nucléotidique liée Rac1 par addition de 1 M de MgCl2: 3 pi du mélange à expérimental (étape 4.4), 0,5 pi à chacun des mélanges de commande (étape 4.5). </li></ol> 5. Concurrence contraignant. <ol><li> Mettre en place 6 microtubes, contenant chacun: 200 ul de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl2 10 ul expérimentales perles de Rac1 nucléotidiques chargé de l&#39;étape (4.7) 5 ul de protéine Rac1 liaison A (protéine de liaison constant) </li><li> Pour chaque tube, ajouter 0, 1, 2,5, 5, 10 ou 20 ul de protéine B de liaison à Rac1 (protéine de liaison variable). Ces volumes supposent unnviron concentrations d&#39;achat d&#39;actions égales des protéines de liaison constants et variables et peuvent avoir besoin d&#39;être ajustée. <ol><li> Ajustez les volumes de protéines de liaison A et B, si il ya de grandes différences dans les affinités de liaison des deux protéines et cela devrait être déterminées empiriquement à travers les répétitions expérimentales. Porter au volume total du mélange de liaison à 235 ul par addition de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl2. </li></ol></li><li> Mettre en place un tube de centrifugeuse contenant: 200 ul de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl2 10 ul expérimentales perles de Rac1 nucléotidiques chargé de l&#39;étape (4.7) 10 pi de protéine Rac1 liaison A (protéine de liaison constant) </li><li> Mettre en place le PIB, GTPyS et pas de tubes de contrôle de nucléotides: 200 ul de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl2 10 pi de billes de Rac1 de contrôle chargés dans l&#39;étape 4.5 avec le PIB, GTPyS ou non nucléotidique et stabilisées dans l&#39;étape 4.7. 180 pi HEK293T GFP-TrioD1 lysat préparé comme dans l&#39;étape 3.6 4 ul de MgCl2 1 M </li><li> Incuber le mélange pendant 2 heures, le mélange par inversion à 4 ° C. </li><li> Laver les billes trois fois avec 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl2. </li><li> Éluer les protéines liées dans 20 pi de tampon d&#39;échantillon réducteurs (50 mM Tris-HCl (pH 7), 5% de SDS, 20% de glycerol, 0,02 mg / ml de bleu de bromophénol, 5% β-mercaptoethanol). </li></ol> 6. Analyse de la concurrence <ol><li> Résoudre 10 ul de la protéine liée (étape 5.6) par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodécyl sodium (SDS-PAGE) et transfert de Western. </li><li> Incuber la membrane à 4 ° CO / N en anticorps anti-GFP dilué 1/1000 dans un tampon bloquant dilué dans du PBS 1x à, 0,1% de Tween-20 pour détecter à la fois des protéines de liaison marquées GTPase. </li><li> Laver trois fois la membrane pendant 10 minutes avec du PBS, 0,1% de Tween-20. </li><li> Incuber la membrane pendant 30 minutes à température ambiante dans 800 DyLight conjugué anti-lapin secanticorps secon-, dilué à 1 / 10.000 en tampon de blocage dilué dans du PBS 1x à, 0,1% de Tween-20. </li><li> Laver trois fois la membrane pendant 10 minutes avec du PBS, 0,1% de Tween-20. </li><li> Analyser la membrane en utilisant un système d&#39;imagerie infrarouge, en utilisant le logiciel pour mesurer l&#39;intensité des bandes selon le protocole du fabricant. </li><li> Tracer l&#39;intensité de chaque bande de protéine par rapport au volume du concurrent variable (Protein B). </li><li> Diviser le volume de concurrent variable au point où les lignes se croisent sur le volume d&#39;concurrent constant (protéine A, 5 pi) pour déterminer le rapport de concurrent à laquelle l&#39;équilibre est atteint. </li><li> Pour la validation de l&#39;état de chargement de nucleotides, des membranes de sonde pour p21-activated kinase 1 (PAK1) (un effecteur) et GFP-TrioD1 (a FEM), comme décrit dans les étapes 6.1-6.6. </li></ol>

<ol><li>Burridge, K., Rho Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+Rac+take+center+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">and Rac take center stage.</a> Cell. 116 (2), 167-179 (2004).</li>
<li>Raftopoulou, M., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+Rho+GTPases+lead+the+way%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration: Rho GTPases lead the way.</a> Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).</li>
<li>Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GEF+means+go%3A+turning+on+RHO+GTPases+with+guanine+nucleotide-exchange+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (2), 167-180 (2005).</li>
<li>Worthylake, D. K., Rossman, K. L., Crystal Sondek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((structure+of+Rac1+in+complex+with+the+guanine+nucleotide+exchange+region+of+Tiam1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">structure of Rac1 in complex with the guanine nucleotide exchange region of Tiam1.</a> Nature. 408 (6813), 682-688 (2000).</li>
<li>Scheffzek, K., Ahmadian, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPase+activating+proteins%3A+structural+and+functional+insights+18+years+after+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">GTPase activating proteins: structural and functional insights 18 years after discovery.</a> Cell Mol Life Sci. 62 (24), 3014-3038 (2005).</li>
<li>Del Pozo,, A, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+regulate+GTP-Rac+localized+effector+interactions+through+dissociation+of+Rho-GDI%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrins regulate GTP-Rac localized effector interactions through dissociation of Rho-GDI.</a> Nat Cell Biol. 4 (3), 232-239 (2002).</li>
<li>Williamson, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronin-1C+and+RCC2+guide+mesenchymal+migration+by+trafficking+Rac1+and+controlling+GEF+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Coronin-1C and RCC2 guide mesenchymal migration by trafficking Rac1 and controlling GEF exposure.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4292-4307 (2014).</li>
<li>Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+the+extracellular+matrix+regulates+the+coupling+of+the+small+GTPase+Rac+to+its+effector+PAK%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK.</a> Embo J. 19 (9), 2008-2014 (2000).</li>
<li>Van Rijssel, J., Hoogenboezem, M., Wester, L., Hordijk, P. L., Van Buul, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+DH-PH+domain+of+Trio+induces+cell+spreading+and+migration+by+regulating+lamellipodia+dynamics+in+a+Rac1-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS%22%5BJournal%5D)">The N-terminal DH-PH domain of Trio induces cell spreading and migration by regulating lamellipodia dynamics in a Rac1-dependent fashion.</a> PLoS. 7 (1), e29912(2012).</li>
<li>Self, A. J., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intrinsic+nucleotide+exchange+and+GTP+hydrolysis+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Measurement of intrinsic nucleotide exchange and GTP hydrolysis rates.</a> Methods Enzymol. 256, 67-76 (1995).</li>
</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Ce protocole décrit une méthode permettant de comparer les affinités relatives de paires de petites protéines de liaison à la GTPase. Les étapes clés sont la préparation des protéines de liaison à la GTPase purifiées et la charge nucléotidique de la GTPase. L’utilisation de protéines de liaison à la GTPase avec la même étiquette GFP permet de déterminer avec précision les concentrations auxquelles des quantités similaires de chaque concurrent se lient. L’utilisation de GTPase recombinante chargée de nucléotides permet d’interroger les propriétés de liaison de la GTPase dans des conditions d’activité spécifiques. Cette étape est également la plus sensible car les nucléotides vont à la fois s’hydrolyser et se détacher de la GTPase si les conditions de magnésium ne sont pas maintenues avec précision.
Dans la cellule, le grand nombre de protéines de liaison à la GTPase combiné au renouvellement rapide des nucléotides rend ces voies difficiles à interpréter. La simplicité de cette méthode, qui consiste à comparer uniquement des paires de protéines de liaison et à utiliser des conditions de charge nucléotidique soigneusement contrôlées, permet d’élucider les voies de signalisation. Cependant, la plus grande force du protocole est aussi la plus grande faiblesse car il s’agit d’une simplification de la situation in vivo . Les tests de compétition peuvent être utilisés pour construire une hypothèse robuste, mais celle-ci doit ensuite être testée dans des cellules par des expériences de knockdown.
Trois caractéristiques doivent être prises en compte lors de la sélection des protéines de liaison à la GTPase marquées GFP à utiliser dans l’expérience. Tout d’abord, les protéines de fusion doivent bien s’exprimer dans les cellules de mammifères, telles que les HEK293T, car les tests de compétition nécessitent une quantité raisonnable de protéines. Deuxièmement, il doit être possible de purifier la protéine recombinante sans dégradation significative, et lorsque cela n’est pas possible, le clonage d’un fragment de liaison à la GTPase doit être envisagé. Troisièmement, les deux protéines de liaison à la GTPase doivent se dissoudre l’une de l’autre sur SDS-PAGE pour permettre l’analyse dans la section 6.
Il y a un certain nombre de mises en garde potentielles à l’expérience qui doivent être prises en compte, et peut-être abordées :
Dénaturation possible des protéines purifiées de liaison à la GTPase lors de l’étape d’élution acide ou entrave stérique par l’étiquette GFP. Entre nos mains, cela n’a pas été un problème, mais doit être testé. Les protéines purifiées peuvent être testées dans des tests fonctionnels 10. Il existe maintenant des kits commerciaux pour tester l’activité des FEM ou des GAP sans avoir besoin de nucléotides marqués par des isotopes. Les protéines séquestrantes, de par leur nature, protègent les GTPases de l’activité du GEF ou du GAP, et peuvent donc être utilisées comme inhibiteurs compétitifs dans les essais commerciaux du GEF ou du GAP, comme nous l’avons fait dans notre récente publication 7. La caractéristique pertinente des protéines qui circulent dans la GTPase est la capacité de se lier à la GTPase, ce qui peut être testé facilement dans un test de traction. Une autre approche de test de l’intégrité des protéines qui s’applique à toutes les protéines de liaison consiste à titrer la protéine éluée des billes du piège GFP avec de la glycine, la même protéine étant retirée des billes du piège GFP par clivage enzymatique. L’expérience serait analysée en sondant à la fois la protéine marquée à la GFP et la protéine clivée avec un anticorps contre la protéine elle-même. Si la protéine n’est pas endommagée par l’élution, l’équilibre doit être atteint dans un rapport de 1:1. Cette approche indiquerait également si la présence de l’étiquette GFP elle-même compromet les propriétés de liaison de la protéine candidate, bien que cela nécessite la production d’une construction avec un site de clivage enzymatique entre l’étiquette et la protéine de liaison. Que la protéine soit compromise par l’étiquette ou l’étape d’élution, le problème pourrait être résolu en modifiant le protocole pour utiliser une méthode de purification alternative. Plutôt que la GFP, les protéines de liaison pourraient être marquées par His, purifiées à l’aide de Ni-NTA et analysées à l’aide d’un anticorps contre le His-tag. La caractéristique importante est que les deux protéines de liaison doivent partager une étiquette commune, bien que, si nécessaire, deux étiquettes puissent être ajoutées à une protéine, l’une pour la purification et l’autre pour la détection.
Le protocole est conçu pour étudier la concurrence entre les interactions avec les domaines de commutation I/II. Bien que la majorité des interactions de la GTPase soient médiées par ce motif, il existe quelques exceptions, notamment les interactions des GDI qui se lient à la queue prényle, ainsi que l’obscurcissement des domaines de commutation. En principe, le protocole pourrait être adapté pour utiliser la GTPase purifiée à partir de cellules de mammifères, de sorte que la GTPase soit prénylée, cependant, la présence de plusieurs sites de liaison ou des effets allostériques compliquent l’interprétation des données de liaison à la compétition. D’autres problèmes associés à une telle modification sont que les GDI co-purifient avec la GTPase à partir de cellules de mammifères, compromettant la pureté des protéines isolées et la nature hydrophobe des groupes prényles, ce qui signifie que les GTPases prénylées sont associées soit à la GDI, soit à la membrane lipidique et que ces facteurs devraient être pris en compte dans l’expérience.
La quantité de GST-Rac1 utilisée dans l’essai. La protéine de liaison constante à la GTPase doit être à une concentration supérieure à celle de la Rac1, sinon lorsque le concurrent est ajouté, il se liera simplement à la Rac1 libre. Il sera immédiatement évident si cela s’est produit, car la liaison du concurrent, sans perte de la protéine constante, sera détectée à peu près de la même manière que lorsque les deux protéines concurrentes se lient l’une à l’autre, comme le montre la figure 3B. À titre de contrôle supplémentaire (étape 5.3), une réaction de liaison contenant le double de la quantité de protéine de liaison constante et aucune protéine de liaison variable doit être incluse (étape 5.3). Si le Rac1 dans l’expérience de titrage est saturé, doubler la quantité de protéine de liaison constante n’aura aucun effet sur la sortie. Les volumes suggérés dans le protocole devraient être appropriés, mais la quantité de Rac1 peut être facilement réduite. Si la liaison du compétiteur sans perte du partenaire de liaison constant est observée, il faut tenter de réduire la quantité de Rac1 avant d’essayer de cartographier les sites de liaison pour éviter la formation de complexes ternaires.
Interaction non spécifique des protéines de liaison à la GTPase avec la GST ou la bille, ainsi que spécifiquement avec Rac1. Ce problème se manifesterait par une liaison résiduelle de la protéine constante de liaison à la GTPase, même lorsque la protéine variable de liaison à la GTPase a atteint un plateau à forte concentration. L’identification de ce problème sera facilitée par la réalisation d’expériences réciproques où les protéines constantes et variables de liaison à la GTPase sont échangées. Les expériences réciproques amélioreront également considérablement la précision de l’estimation du point d’équilibre, elles doivent donc toujours être incluses. Dans les cas de liaison non spécifique, les concentrations relatives auxquelles l’équilibre est atteint peuvent encore être calculées en comparant l’intensité de la bande entre les maxima et les minima pour chaque protéine, ou en mesurant l’étendue de la liaison non spécifique en utilisant des billes de GST comme appât, plutôt que GST-Rac1.
Des essais de traction utilisant différentes conditions de charge nucléotidique doivent être utilisés pour compléter l’essai de compétition décrit dans le présent protocole. Déterminer la préférence nucléotidique des partenaires est important à la fois pour comprendre les événements de compétition et pour comprendre la voie de signalisation dans laquelle la protéine de liaison à la GTPase est impliquée. Dans la figure 2B , nous analysons la liaison des protéines avec une préférence établie pour la GTPase chargée en GTP ou sans nucléotides comme moyen de valider la charge nucléotidique. Cependant, il est judicieux d’étudier également l’effet de la charge nucléotidique sur chacun des concurrents. Si les concurrents hypothétiques montrent des préférences différentes, la concurrence contribuera moins à la voie de signalisation, et en effet, le renouvellement des nucléotides est probablement le mécanisme qui dirige l’échange des protéines de liaison.

Le cytosquelette d’actine qui détermine la forme, la polarité et les propriétés migratoires des cellules de mammifères est régulé par la famille Rho des petites GTPases. Les GTPases de la famille Rho comprennent RhoA qui stimule la contraction du cytosquelette, Rac1 qui stimule la ramification de l’actine et la protrusion membranaire, et Cdc42 qui a des effets similaires sur la polymérisation de l’actine à Rac1 et provoque la formation de filopodes 1,2. L’activité de signalisation de la GTPase est déterminée par la liaison d’un nucléotide, qui contrôle la contraction et la relaxation des boucles de l’interrupteur I et de l’interrupteur II qui médient les interactions protéine-protéine avec les régulateurs et les effecteurs. Les GTPases liées à la guanosine 5'-triphosphate (GTP) activent les effecteurs en aval, tandis que la forme liée à la guanosine 5'-diphosphate (GDP) est inactive. Dans la cellule, les cycles d’hydrolyse du GTP et d’échange de nucléotides permettent un renouvellement rapide des signaux de la GTPase qui sont nécessaires à la dynamique du cytosquelette. Le renouvellement nucléotidique est régulé par trois mécanismes. Les facteurs d’échange de nucléotides (GEF) de la guanine stabilisent la GTPase sans nucléotides, catalysant l’échange de GDP pour la GTP, et stimulant ainsi l’activité de signalisation de la GTPase 3,4. Les protéines activatrices de la GTPase (GAPase) catalysent l’hydrolyse de la GTP en GDP, inhibant ainsi l’activité de signalisation de la GTPase 5. Les molécules séquestrantes telles que le régulateur de la condensation de la chromatine 2 (RCC2) et les inhibiteurs de la dissociation des nucléotides de la guanine (GDI) obscurcissent les boucles de commutation et, dans le cas des GDI, éliminent la GTPase de la membrane en interagissant avec la queue de prényle 6,7. Chacune des trois classes de molécules régulatrices interagit avec les boucles de commutation, tout comme les effecteurs en aval et certains régulateurs de trafic tels que la coronine-1C 7. Le but de ce protocole est de mesurer la compétition pour le site de liaison du commutateur I/II entre les régulateurs présumés et les molécules de signalisation en aval. Il convient de noter que les tests de compétition testent la liaison à un site de liaison partagé, de sorte que ce protocole ne convient pas pour tester les interactions avec d’autres sites, comme la liaison des GDI à la queue prényle.
La subtilité des différences de conformation entre les formes actives et inactives, combinée à la nature labile du nucléotide lié, a rendu difficile l’étude des événements de liaison à la GTPase. Le rôle du nucléotide lié signifie que les tests de liaison conventionnels tels que l’immunoprécipitation ou la résonance plasmonique de surface ne sont pas bien adaptés à l’investigation, car le nucléotide ne peut pas être contrôlé. Cet obstacle est aggravé par le chevauchement des sites de liaison des GEF, des GAPs, des effecteurs, des molécules séquestrantes et des molécules de trafic, ce qui rend difficile l’interprétation des données de liaison d’une interaction unique dans le contexte de la compétition qui se produira dans la cellule. L’immunoprécipitation, en particulier, est compromise par la compétition entre les partenaires de liaison, car dans certaines conditions cellulaires, un partenaire de liaison peut être identifié au détriment de tous les autres, tandis que dans d’autres conditions, un autre partenaire peut dominer. La nature dynamique de la signalisation de la GTPase est essentielle au fonctionnement de la GTPase et doit être prise en compte lors de l’analyse des relations entre les interactions de liaison des différents régulateurs. En effet, nous avons récemment décrit un parcours qui reposait fortement sur la liaison compétitive. Nous avons identifié la coronine-1C comme une molécule de trafic qui se lie aux boucles de commutation de GDP-Rac1 7. Dans les zones où l’activité du FEM est faible, le trafic domine, ce qui permet d’éliminer le Rac1 de ces régions. Cependant, lorsque Rac1 est délivré dans des régions de la cellule où l’activité du GEF est élevée, le GEF supplante la coronine-1C, activant ainsi Rac1 et empêchant l’élimination de Rac1 médiée par la coronine-1C de cette zone. Le modèle va plus loin, car l’action des échanges du FEM a lié le PIB au GTP, déplaçant encore plus l’équilibre de la coronine-1C. Par conséquent, l’activité de Rac1 pourrait s’expliquer entièrement en termes de concurrence et d’affinité relative.
Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour comparer les affinités relatives de différents partenaires de liaison pour de petites GTPases, en utilisant Rac1 comme exemple. En utilisant une approche de protéine purifiée, il est possible de reconstituer une chaîne d’événements de signalisation par comparaison, dans une expérience où le nucléotide lié peut être étroitement contrôlé.

<table><tbody><tr><td>Bugbuster</td><td>Novagen</td><td>70584-3</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase COMPLET</td><td>Roche</td><td>05 056 489 001</td><td></td></tr><tr><td>Billes magnétiques de glutathion</td><td>Pierce</td><td>88821</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylénimine, ramifiée, moyenne Mw ~25 000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408727-100ML</td><td></td></tr><tr><td>OPIMEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Media</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10270-1-6</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>GFP-Trap_A</td><td>Chromotec</td><td>gta-20</td><td></td></tr><tr><td>GDP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7127</td><td>Très instable. Aliquote et stockage à -80 immédiatement après la reconscription</td></tr><tr><td>GTP & gamma ; S</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8634</td><td>Très instable. Aliquote et stockage à -80 immédiatement après la reconstitution</td></tr><tr><td>Tampon de blocage</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6429</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-GFP</td><td>Living Colors</td><td>632592</td><td>Utilisation à 1/1000 de dilution</td></tr><tr><td>DyLight 800 Anticorps secondaire anti-lapin conjugué</td><td>de chèvre Fisher Scientific</td><td>10733944</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-PAK1</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>2602S</td><td>Utilisation à dilution 1/1000</td></tr><tr><td>Système d’imagerie infrarouge Odyssey SA</td><td>Li-cor</td><td>9260-11PC</td><td></td></tr></tbody></table>

en comparant l&#39;affinité des protéines de liaison en utilisant gtpase compétition dosages

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

Dans ce protocole, nous démontrons une méthode pour comparer la compétition entre les protéines de liaison à la GTPase. Une telle approche est importante pour déterminer les capacités de liaison des GTPases pour deux raisons : le fait que toutes les interactions impliquent la même face des GTPases signifie que les événements de liaison doivent être considérés dans le contexte des concurrents, et le fait que le nucléotide lié doit également être contrôlé signifie que les approches conventionnelles telles que l’immunoprécipitation ne conviennent pas à la biochimie des GTPases. Le test repose sur l’utilisation de protéines purifiées. Le Rac1 purifié immobilisé sur des billes est utilisé comme protéine d’appât, et peut être chargé avec du GDP, une version non hydrolysable de GTP ou laissée sans nucléotides, de sorte que l’étape de signalisation à étudier peut être contrôlée. Les protéines de liaison à étudier sont purifiées à partir de cellules de mammifères, pour permettre un repliement correct, au moyen d’une étiquette GFP. L’utilisation du même marqueur sur les deux protéines est importante car non seulement elle permet une purification et une élution rapides, mais elle permet également de détecter les deux concurrents avec le même anticorps pendant l’élution. Cela signifie que les quantités relatives des deux protéines liées peuvent être déterminées avec précision.

Ce protocole est conçu pour calculer les affinités relatives des partenaires de liaison pour Rac1, sans avoir besoin de connaître la concentration précise des concurrents (Figure 1). Détermination de la concentration en protéine et introduit des erreurs lors de l&#39;examen compétition entre les molécules dans une voie de signalisation préalable. Cependant, il est important de savoir que les deux concurrents ont la même concentration molaire dans les solutions de réserve pour permettre des rapports simples à calculer lors de l&#39;ajout des volumes différents de l&#39;essai. 40 ul de billes GFP-Trap ont une capacité de liaison de ~ 300 pmol de sorte qu&#39;une confluence de 75 cm 2 flacons de très cellules exprimant se saturer les billes, de sorte que les préparations des deux protéines de liaison différents seront similaires avant l&#39;ajustement (Figure 2A). Si l&#39;on exprime les protéines de mal, ce problème peut être surmonté par la purification de cette protéine à partir de plus d&#39;un flacon de cellules. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; La liaison de la plupart des effecteurs et des régulateurs de GTPase dépend de la nucleotide-chargement de la GTPase de l&#39;appât, il est donc important de tester si le chargement a réussi. Le chargement peut être vérifiée par précipitation de protéines de liaison connus à partir de lysats cellulaires. Protéines effectrices, comme la liaison de GTP PAK1-Rac1 et peuvent être facilement précipité à partir de lysats et détectées par Western blot 8 (figure 2B). GEFS lier préférentiellement au nucléotide sans GTPase de stabiliser l&#39;état de transition. Comme GEF sont de faible abondance, habituellement inactifs et éponger souvent mal, il est préférable de surexprimer une FEM ou d&#39;un fragment du FEM à l&#39;essai gratuitement GTPase nucléotides. Nous utilisons souvent le premier homologie Dbl du Trio, exprimé comme une fusion GFP (GFP-TrioD1 9) (figure 2B), mais toute FEM travailler. Les protéines qui se lient à la GTPase de PIB chargé sont plus rares. Nous avons récemment rapporté RCC2 comme l&#39;une telle protéine 7, ou le PIB de chargement peut être validé simplement comme binding à FEM ni ni effecteur. La sortie à partir de l&#39;expérience sera un transfert de Western illustrant les deux partenaires de liaison marqués GFP liés à la GTPase. En utilisant un seul anticorps pour détecter les deux protéines, les concentrations auxquelles des quantités similaires des deux concurrents se lient peuvent être déterminées et donc les affinités relatives déduites. Dans cet exemple, la concurrence entre le domaine de l&#39;hélice de la protéine Rac1-trafic, coronine-1C (Rac1-binding protein A), et la protéine Rac1-séquestrant, RCC2 (Rac1-binding protein B), est démontré (figure 3A). En utilisant un volume constant de coronine-1C hélice (5 pi), et en ajoutant des volumes croissants de RCC2, nous pouvons voir de la GFP efface que l&#39;équilibre est atteint à 1,25-2,5 ul de RCC2 (astérisque), démontrant que RCC2 a une plus forte affinité pour Rac1 que coronine-1C. En mesurant l&#39;intensité des bandes en utilisant quantitative Western blot, et le tracé des valeurs moyennes pour chaque competitor, le point d&#39;équilibre peut être calculée avec précision, en identifiant les volumes à laquelle se coupent les courbes (figure 3B). L&#39;un des obstacles possibles à un dosage de compétition est réussie si les partenaires de liaison se lient les uns aux autres ainsi que la liaison à Rac1. Dans la figure 3A + B nous démontrons la concurrence entre RCC2 et le domaine de l&#39;hélice de coronine-1C, plutôt que sur toute la longueur coronine-1C. La raison pour utiliser le coronine tronquée est que coronine-1C se lie également RCC2 à travers le domaine de la queue. Lorsque pleine longueur coronine-1C est titré contre RCC2, la liaison de deux protéines est détectée, en raison de la formation complexe ternaire, plutôt que la concurrence (figure 3C). Si la concurrence est en cours, la liaison d&#39;une protéine va augmenter tandis que les autres baisses, et lié total GFP-fusion restera constant. Dans les cas où un complexe ternaire se forme, il est nécessaire de tronquer une de la protéine GTPase se liant de sorte que la competvisi- plus interagir. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53254/53254fig1.jpg" /> Figure 1. Workflow. Représentation schématique du flux de travail pour déterminer l&#39;affinité des protéines de GTPase liaison en utilisant des analyses de la concurrence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53254/53254fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53254/53254fig2.jpg" /> Figure 2. La validation des protéines purifiées. (A) purifiée GFP-étiqueté protéines analysées par transfert de Western de liaison, sondant avec anti-GFP pour déterminer le rendement relatif des deux protéines Rac1. Ce type d&#39;égalisation pendant l&#39;expérience permet la concentration des deux protéines à être réglé de façon qu&#39;ils correspondent à l&#39;expérience de liaison. (B) GDP, GTPyS et aucun nucléotide chargé TPS-Rac1 a été incubé avec un lysat de HEK293T exprimant la GFP-TrioD1 et protéines détectées en traçant pour PAK1 endogène ou surexprimé GFP-TrioD1 liés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53254/53254fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53254/53254fig3.jpg" /> Figure 3. Analyse par Western blot de la protéine par rapport Exemple sorties contraignant. À partir des essais de compétition de liaison. (A) PIB chargé Rac1 a été mélangé avec 5 pi GFP-coronine-1C domaine de l&#39;hélice et de l&#39;augmentation des volumes de GFP-RCC2 ont été titrés en jeu. En Western blot des protéines liées à GFP, des problèmes avec détection différentielle des deux protéines sont évités et le signal de la GFP indique le rapport molaire entre les deux protéines de fusion. Les astérisques indiquent les rapports de concurrence sur eithecôté r du point d&#39;équilibre. (B) des intensités de bande des protéines liées à la GFP de fusion de trois expériences indépendantes ont été mesurées par quantitative Western Blot, en utilisant des anticorps et moyennes secondaires fluorophores conjugué comploté pour calculer le montant de RCC2 nécessaire pour atteindre l&#39;équilibre. (C ) Exemple de sortie à partir d&#39;une expérience dans laquelle des protéines de liaison à Rac1 lient les unes aux autres et forment un complexe ternaire, au lieu de la compétition. PIB chargé Rac1 a été mélangé avec 5 pi GFP-RCC2 et l&#39;augmentation des volumes de GFP-coronine-1C pleine longueur ont été titrés. L&#39;augmentation liée GFP-coronine-1C sans perte de borne GFP-RCC2 indique formation d&#39;un complexe ternaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53254/53254fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Ce protocole compare les affinités relatives des partenaires de liaison pour les GTPases de la famille Rho, y compris Rac1. In vivo, les protéines de liaison à Rac1 sont en compétition pour une seule interface de liaison, dont la conformation est dictée par un nucléotide lié. Le nucléotide est à la fois important et difficile à contrôler expérimentalement, en raison du taux d’hydrolyse élevé.

En comparant l&#39;affinité des protéines de liaison en utilisant GTPase Compétition dosages

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...

L'objectif général de cette procédure est de comparer les affinités relatives des partenaires de liaison des protéines pour les GTPases de la famille Row dans des conditions de chargement en nucléotide soigneusement contrôlées. Cela est réalisé en premier lieu par la purification de partenaires de liaison compétitifs présumés, chacun marqué avec la même étiquette, par exemple, la protéine fluorescente verte ou GFP. La deuxième étape consiste à purifier la GTPA d'intérêt.Par exemple, RAC1 est chargé avec le nucléotide approprié afin d'atteindre l'état de signalisation souhaité de la GTPath. Ensuite, la GTPath chargée en nucléotide est incubée avec une quantité fixe d'un partenaire compétiteur de liaison et des quantités croissantes d'un autre partenaire compétiteur de liaison, afin d'obtenir une courbe de titrage d'interaction. La dernière étape consiste à séparer les protéines liées à la GTPath immobilisée par immunotransfert (western blot) et à sonder la membrane pour détecter la marque GFP partagée par les deux partenaires d'interaction.En fin de compte, le Western blot est utilisé pour identifier les concentrations relatives auxquelles des quantités similaires de chaque partenaire de liaison marqué par la GFP sont capturées par la GTPase. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la co-précipitation, est que les propriétés de liaison protéique de la GTPase sont déterminées par le nucléotide lié dans la cellule. Le nucléotide lié étant labile, l'interprétation des données de liaison protéique devient difficile.Commencez cette procédure par la purification de la protéine G tpa marquée par un marqueur GST et par l'expression des protéines de liaison à gtpa, comme décrit dans le protocole écrit. Rincez les flacons de cellules transfectées avec du tampon salin phosphate ou PBS et laissez égoutter le flacon pendant cinq minutes. Aspirez le liquide libre, puis grattez les cellules dans 500 microlitres de tampon de lyse et transférez-les dans un tube microfuge. Mélangez les cellules pour les lyser par retournement à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.Pendant la lyse, lavez deux lots de 40 microlitres de billes GFP trap trois fois avec du tampon de lyse frais en centrifugeant les billes à 2 700 ×g pendant deux minutes entre chaque lavage. Après la lyse, clarifiez les lysats par centrifugation à 21 000 ×g pendant 10 minutes.Transférez le lysat clarifié de chacune des protéines compétitrices vers des billes GFP trap préalablement lavées. Incubez pendant deux heures afin de permettre la liaison des protéines de fusion GFP, en mélangeant par retournement à quatre degrés Celsius. Lavez les billes GFP trap chargées deux fois dans le tampon de lyse et deux fois dans le tampon de compétition.Sédimenter les billes dans le tampon de liaison à 2 700 ×g pendant deux minutes entre chaque lavage. Éluer les protéines de fusion GFP en ajoutant 40 microlitres de glycine 0,2 M et en pipetant haut et bas pendant 30 secondes ; sédimenter immédiatement les billes à 21 000 ×g pendant 60 secondes, puis transférer le liquide dans un nouveau tube de centrifugation contenant quatre microlitres de Tris HCl 1 M. Effectuer cette étape rapidement afin de limiter les dommages à la protéine purifiée. Analyser un microlitre de chaque protéine purifiée par immunotransfert et sonder avec un anticorps anti-GFP pour déterminer le rendement relatif, en utilisant un système de transfert quantitatif selon le protocole du fabricant.Égaliser la concentration molaire des protéines par ajout de tampon de liaison compétitive. Prélever 90 microlitres des billes GST préparées du rack un et laver trois fois avec le tampon de chargement en nucléotide en utilisant un séparateur de particules magnétiques pour précipiter les billes à chaque étape. Aspirer le tampon des billes et ajouter 100 microlitres de tampon de chargement en nucléotide selon que le chargement avec G-D-P-G-T-P ou sans nucléotide est requis.Pour l'expérience de compétition, ajouter 12 microlitres de GDP à 100 millimolaire, 12 microlitres de GTP gamma S à 10 millimolaire ou aucun nucléotide à 60 microlitres de billes GST-RACK1 pour les contrôles de chargement en nucléotide. Répartir les billes restantes en trois aliquots de 10 microlitres et ajouter 2 microlitres de GDP à 100 millimolaire, 2 microlitres de GTP gamma S à 10 millimolaire ou aucun nucléotide à chaque tube. Incuber les mélanges de billes pendant 30 minutes à 30 degrés Celsius sous agitation.Stabiliser le rack contenant les nucléotides en ajoutant un molaire de chlorure de magnésium au mélange expérimental et aux mélanges témoins afin d'effectuer la liaison compétitive. Préparer six tubes microfuge, chacun contenant 200 microlitres de tampon de liaison compétitive.Chaque tube doit également contenir 10 microlitres du support chargé en nucléotides, une bille et cinq microlitres du support. Ajouter à chaque tube 0, 1, 2, 0,55, 10 ou 20 microlitres du support contenant une protéine de liaison A en tant que protéine de liaison constante, et une protéine de liaison B en tant que protéine de liaison variable. Ces volumes supposent des concentrations stock approximativement égales des protéines de liaison constante et variable, et pourraient nécessiter un ajustement.Compléter le volume total du mélange de liaison à 235 microlitres en ajoutant le tampon de liaison compétitive. Ensuite, préparer un tube de microcentrifugation contenant 200 microlitres du tampon de compétition. Ajouter 10 microlitres de nucléotide expérimental chargé sur le rack, une perle et 10 microlitres de protéine de liaison A du rack un. Puis préparer les tubes témoins G-D-P-G-T-P gamma S et sans nucléotide comme décrit dans le protocole écrit.Incuber les tubes pendant deux heures en mélangeant par retournement à quatre degrés Celsius après l'incubation. Laver les billes trois fois avec le tampon de liaison compétitif. Enfin, éluer les protéines liées dans 20 microlitres de tampon d'échantillonnage réducteur.Le western blot quantitatif de la marque GFP des protéines GFP RCC deux et GFP Corona dans un domaine C-propulseur purifiées révèle que la protéine de la bande supérieure, GFP RCC deux, est 1,4 fois plus abondante que celle de la bande inférieure et doit donc être diluée afin d'obtenir un rapport molaire un pour un pour l'expérience de compétition. Une expérience témoin démontre que l'état de chargement en nucléotide de rack un détermine la spécificité de liaison, en titrant des volumes croissants de GFP RCC deux contre un volume fixe de GFP Corona dans un domaine C-propulseur à concentration équimolaire, suivie d'un immunotransfert. Les protéines qui se lient à rack un permettent de visualiser le changement relatif de protéine liée en traçant les intensités des bandes GFP pour les deux compétiteurs sur le même graphique, et en identifiant le point d'intersection des droites, ce qui permet de déterminer le volume de protéine de liaison variable à l'équilibre.Cependant, il faut faire attention à ce que des problèmes tels que l'interaction entre les concurrents ou un excès d'appât GTPa ne compromettent pas l'expérience. Une augmentation d'un concurrent sans perte de l'autre, comme indiqué ici, signale un problème lors de la réalisation de cette procédure. Il est important de vérifier qu'il existe une relation réciproque entre l'abondance des partenaires de liaison concurrents.Il existe plusieurs problèmes qui peuvent fausser les résultats et qui peuvent être résolus dès lors qu'ils sont identifiés par l'analyse des données.

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La méthode présentée ici décrit un dosage de suivre l'activation de RhoA facteurs spécifiques de change GDP / GTP (GEF) dans les cellules cultivées en faisant usage d'une protéine mutante RhoA fusion GST qui a une forte affinité pour GEFs activés. GEF sont précipités à partir de lysats cellulaires, détectées par Western blot et quantifiée par densitométrie.

Précipitation par affinité des actifs des Rho GEF l&#39;aide d&#39;un TPS-étiqueté Mutant Rho protéines (TPS-RhoA (G17A)) à partir de lysats cellulaires épithéliales

Cette vidéo présente un test de compétition pour étudier les partenaires protéiques de liaison à la GTPase. En utilisant la protéine GTPase liée aux nucléotides immobilisée sur des billes magnétiques, la liaison compétitive entre deux partenaires protéiques en interaction pour le même site de liaison sur la GTPase peut être étudiée pour évaluer les affinités de liaison des partenaires protéiques.

Essai de liaison à la compétition pour étudier les partenaires protéiques concurrents de liaison à la GTPase

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Interrogation parallèle du recrutement d'2-Arrestin2 pour le dépistage de Ligand sur une échelle GPCR-Wide utilisant PRESTO-Tango Assay

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Biocapteurs de protéine G à base de BRET pour mesurer l’activité des récepteurs couplés aux protéines G dans des cellules vivantes

Apprenez à comparer les affinités de liaison des partenaires protéiques pour les GTPases de la famille Rho, notamment Rac1, en utilisant des conditions de chargement nucléotidique contrôlées et le Western blot.

En comparant l'affinité des protéines de liaison en utilisant GTPase Compétition dosages

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