En comparant l'affinité des protéines de liaison en utilisant GTPase Compétition dosages

L’objectif général de cette procédure est de comparer les affinités relatives des partenaires de liaison aux protéines pour les ECA GT P de la famille des rangs dans des conditions de charge nucléotidique soigneusement contrôlées. Ceci est accompli en purifiant d’abord les partenaires de liaison compétitifs putatifs, chacun marqué avec le même marqueur, par exemple, protéine fluorescente verte ou GFP. La deuxième étape consiste à purifier le GTPA d’intérêt.

Par exemple, RAC one et chargez-le avec le nucléotide approprié pour obtenir l’état de signalisation GTPA souhaité. Ensuite, le gtpa chargé de nucléotides est incubé avec une quantité fixe d’un concurrent de liaison et des quantités croissantes de l’autre concurrent de liaison pour obtenir une courbe de liaison de titrage. La dernière étape consiste à résoudre les protéines liées à la protéine GT immobilisée par transfert Western et à sonder la membrane à la recherche de l’étiquette GFP partagée entre les deux partenaires de liaison.

En fin de compte, le transfert Western est utilisé pour identifier les concentrations relatives auxquelles des quantités similaires de chaque partenaire de liaison marqué à la GFP sont capturées par la GTPase. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la co-précipitation est que les propriétés de liaison aux protéines de gtpa sont dictées par le nucléotide lié dans la cellule. Le nucléotide lié est labile, ce qui rend difficile l’interprétation des données de liaison aux protéines.

Commencez cette procédure par la purification de G tpa marqué GST et l’expression des protéines de liaison gtpa comme détaillé dans le protocole de texte. Rin place les fioles des cellules transfectées dans un tampon phosphate salin ou PBS et égoutte la fiole pendant cinq minutes. En aspirant le liquide libre, puis en grattant les cellules dans 500 microlitres de tampon de lyse dans un tube de micro-fuge, en mélangeant les cellules pour les lyser par inversion à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.

Pendant la lyse, laver deux lots de 40 microlitres de billes de piège GFP trois fois avec du sédiment tampon de lyse frais. Les perles à 2 700 fois G pendant deux minutes entre les lavages. Après la lyse, clarifier les lysats par centrifugation à 21 000 fois G pendant 10 minutes.

Transférez le lysat clarifié de chacune des protéines concurrentes dans des billes de piège GFP lavées séparées. Laisser les protéines de fusion GFP se lier pendant deux heures, en les mélangeant par inversion à quatre degrés Celsius. Lavez les billes de piège GFP chargées deux fois dans un tampon de lyse et deux fois en compétition.

Tampon de liaison : billes de sédimentation à 2 700 fois G pendant deux minutes entre les lavages. Éluer les protéines de fusion GFP en ajoutant 40 microlitres de glycine molaire 0,2 molaire et en pipetant de haut en bas pendant 30 secondes, sédimenter immédiatement les billes à 21 000 fois G pendant 60 secondes et transférer le liquide dans un nouveau tube de fuge contenant quatre microlitres d’une molaire tris HCL effectuer cette étape rapidement pour limiter les dommages à la protéine purifiée. Analyser un microlitre de chaque protéine purifiée par western blot et sonder avec un anticorps anti-GFP pour établir le rendement relatif à l’aide d’un système de transfert quantitatif selon le protocole du fabricant.

Égaliser la concentration en protéines molaires par l’ajout d’un tampon de liaison de compétition. Prenez 90 microlitres de billes de GST préparées et lavez-les trois fois avec un tampon de chargement de nucléotides à l’aide d’un trieur de particules magnétiques pour précipiter les billes à chaque étape. Aspirez le tampon des billes et ajoutez 100 microlitres de tampon de charge nucléotidique selon que G-D-P-G-T-P ou aucune charge nucléotidique n’est requise.

Pour l’expérience de compétition, ajoutez 12 microlitres de 100 millimolaires de PIB 12 microlitres de 10 millimolaires GTP gamma S ou sans nucléotide à 60 microlitres de billes GST rack one pour les contrôles de charge nucléotidique. Divisez les billes restantes en trois quats de 10 microlitres et ajoutez deux microlitres de 100 millimoles de PIB, deux microlitres de 10 millimolaires de GTP gamma S ou aucun nucléotide dans chaque tube. Incuber les mélanges de billes pendant 30 minutes à 30 degrés Celsius avec agitation.

Stabiliser le rack lié aux nucléotides, un par l’ajout d’une molaire de chlorure de magnésium au mélange expérimental et aux mélanges de contrôle pour effectuer la liaison de compétition. Installez six micro-tubes de fuge. Chacun contenant 200 microlitres de tampon de liaison de compétition.

Chaque tube doit également contenir 10 microlitres du rack chargé de nucléotides, une bille et cinq microlitres du rack. Une protéine de liaison A en tant que protéine de liaison constante dans chaque tube, ajoutez 0, 1, 2, 0,55, 10 ou 20 microlitres de la protéine de liaison B en tant que protéine de liaison variable. Ces volumes supposent des concentrations de stock à peu près égales de protéines de liaison constantes et variables et peuvent devoir être ajustés.

Porter le volume total du mélange de liaison à 235 microlitres par l’ajout du tampon de liant de compétition. Ensuite, installez un tube de micro-fuge contenant 200 microlitres de tampon de compétition. 10 microlitres de rack expérimental chargé de nucléotides, une bille et 10 microlitres de rack une protéine de liaison A.Ensuite, configurez les tubes de contrôle G-D-P-G-T-P gamma S et sans nucléotide comme décrit dans le protocole de texte.

Incuber les tubes pendant deux heures en les mélangeant par inversion à quatre degrés Celsius après l’incubation. Lavez les perles trois fois avec le tampon de reliure de compétition. Enfin, éluez les protéines liées dans 20 microlitres de tampon d’échantillon réducteur.

Le western blot quantitatif de l’étiquette GFP de la GFP RCC deux purifiée et de la GFP Corona dans un domaine C.Propeller révèle que la protéine de la bande supérieure, GFP RCC deux est 1,4 fois plus abondante que la bande inférieure et doit être diluée pour obtenir un rapport molaire un à un pour l’expérience de compétition. Une expérience de contrôle démontre que l’état de charge nucléotidique de la première crémaillère dicte la spécificité de liaison, titrant des volumes croissants de GFP RCC deux par rapport à un volume fixe de GFP Corona équimolaire dans un domaine d’hélice C et blot. Les protéines qui se lient à l’un d’entre eux permettent de visualiser un changement relatif de la protéine liée En traçant les intences de la bande GFP pour les deux concurrents sur le même graphique, et en identifiant le point d’intersection des lignes, il est possible d’identifier le volume de la protéine de liaison variable à l’équilibre.

Cependant, il faut veiller à ce que des problèmes tels que l’interaction entre concurrents ou l’excès d’appât gtpa ne compromettent pas l’expérience. L’augmentation d’un concurrent sans perte de l’autre, comme indiqué ici, indique un problème lors de la tentative de cette procédure. Il est important de se rappeler de vérifier qu’il existe une relation réciproque entre l’abondance des partenaires de liaison concurrents.

Il existe un certain nombre de problèmes qui peuvent fausser les résultats et/ou être résolus tant qu’ils sont identifiés en inspectant les données.