Name: Identification des protéines de liaison des petits ligands avec l’action capillaire radiale différentielle du test de ligand (DRaCALA) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Découvrez l'utilisation de DRaCALA pour identifier les protéines cibles des messagers secondaires (p)ppGpp chez Escherichia coli. Cette méthode rapide et sensible permet le criblage systématique des interactions protéine-ligand.

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Le travail est soutenu par une subvention de projet NNF (NNF19OC0058331) à YEZ, et le programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention Marie Skłodowska-Curie (Nº 801199) à MLS.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62331/62331img1.jpg">

1. Préparation de lysates de cellules entières
<ol><li>Inoculer les souches de collecte E. coli K-12 ASKA ORFeome15 dans un bouillon de lysogénie (LB) de 1,5 mL contenant 25 μg/mL de chloramphénicol dans des plaques de puits profondes de 96 puits. Cultiver pendant la nuit (O/N) pendant 18 h à 30 °C en agitant à 160 tr/min. Le lendemain, ajouter l’isopropyle β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (final 0,5 mM) aux cultures O/N pour induire l’expression des protéines à 30 °C pendant 6 h.</li>
	<li>Cellules à granulés à 500 x g pendant 10 min. Congeler les granulés à -80 °C jusqu’à leur utilisation. Pour lyser les cellules, ajouter 150 μL de tampon de lyse L1 (40 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, complété par 2 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), 40 μg/mL de DNase 1 et 0,5 mg/mL de lysozyme) pour ressusposer la pastille.</li>
	<li>Congeler les cellules à -80 °C pendant 30 min, puis décongeler à 37 °C pendant 20 min. Répétez ce cycle trois fois pour lyser les cellules. Conserver les lysates à -80 °C avant utilisation.</li>
</ol>2. Purification de Relseq et GppA
REMARQUE: Les protéines recombinantes Relseq de Streptococcus equisimilis et GppA de E. coli K-12 sont utilisées pour synthétiser les pppGpp et ppGpp radiomarqués, respectivement.
<ol><li>Cultiver et collecter des cellules surexprimant chaque protéine.<ol>
<li>Cultiver la souche E. coli BL21 DE3 jusqu’à la phase exponentielle (densité optique (OD) ~ 0,3-0,4) dans le bouillon LB et faire tourner 1 mL de culture à 6000 x g pendant 5 min. Décanter le surnageant et ressuspender les cellules avec 100 μL de bouillon de BST glacé (bouillon LB complété par 0,1 g/mL de PEG3350, 0,05 mL/mL de diméthylsulfoxyde, 20 mMMgCl2).</li>
		<li>Mélanger les plasmides portant le rel seq et le gppAmarqués à l’histidine, chacun de 100 ng, avec les suspensions cellulaires ci-dessus dans le TSB, et incuber sur de la glace pendant 30 min. Choc thermique des cellules à 42 °C pendant 40 s. Placer le mélange sur de la glace pendant 2 min, et ajouter 1 mL de bouillon LB à température ambiante pour permettre aux cellules de récupérer pendant 1 h à 37 °C avec agitation à 160 tr/min.</li>
		<li>Plaquer les cellules récupérées sur des plaques de gélose LB complétées par les antibiotiques correspondants (Relseq:100 μg/mL d’ampicilline; GppA : 30 μg/mL de kanamycine). Le lendemain, inoculez les colonies dans du bouillon LB pour commencer les précultures O/N des deux souches à 37 °C.</li>
		<li>Après 18 h, inoculer 500 mL de milieu LB avec 10 mL des cultures O/N et des antibiotiques correspondants. Cultivez les cultures en les agitant à 160 tr/min à 37 °C. Lorsque la DO600nm atteint 0,5-0,7, induire l’expression des protéines en ajoutant 0,5 mM d’IPTG et en augmentant pendant 3 h à 30 °C en agitant à 160 tr/min.</li>
		<li>Prélever les cellules en les tournant à 6084 x g pendant 10 min à 4 °C. Resuspendez la pastille dans 20 mL de solution saline glacée 1x tamponnée au phosphate (PBS) et recentrifugez à 1912 x g pendant 20 min à 4 °C. Décantez le surnageant et congelez les granulés à -20 °C avant utilisation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purification par affinité de l’acide nickel-nitrilotriacétique (Ni-NTA) REMARQUE: À partir de ce moment, assurez-vous que les échantillons sont froids.<ol>
<li>Ajouter 40 mL de tampon de lyse glacé L2 (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM naCl, 5 % de glycérol, 10 mM d’imidazole, 10 mM de β-mercaptoéthanol complété par des inhibiteurs de la protéase (comprimé sans EDTA; voir la table des matériaux)pour ressuspender la pastille. Lyser les cellules par sonication (amplitude de 60%, 2 s ON / 4 s OFF pendant 8 min ON). Nettoyer le lysate en filant à 23 426 x g pendant 40 min à 4 °C, et continuer avec le surnageant pour la purification.</li>
		<li>Pendant la centrifugation ci-dessus, préparez la résine Ni-NTA.<ol>
<li>Transférer 500 μL de résine Ni-NTA homogénéisée dans une colonne de chromatographie en polypropylène sur pied et laisser se déposer pendant 15 min et la solution de stockage s’écouler à travers. Lavez la résine avec 15 mL d’eau ultrapure deux fois, puis lavez la colonne avec 15 mL du tampon de lyse L2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Chargez le surnageant dégagé du lysate de cellule de l’étape 1 sur la colonne et laissez-le s’écouler. Laver la colonne avec 30 mL de tampon de lavage (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glycérol, 20 mM d’imidazole).</li>
		<li>Éluez les protéines avec 400 μL du tampon d’élution (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glycérol, 500 mM imidazole) trois fois. Ensuite, répétez l’élution avec 300 μL de plus du tampon d’élution. Combiner les protéines éluées pour un volume final de 700 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filtration sur gel<ol>
<li>Préparer un tampon de filtration en gel (50 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl; 5% de glycérol). Lavez la colonne d’exclusion de taille avec un volume de colonne (25 mL) du tampon de filtration en gel.</li>
		<li>Chargez l’échantillon de 700 μL ci-dessus à l’aide d’une boucle de 500 μL, exécutez à 0,5 mL / min et collectez 2 à 3 fractions, chacune de volume de 0,5 mL, contenant les protéines respectives.</li>
		<li>Combinez et concentrez les fractions contenant chacune des protéines à l’aide d’une colonne de spin et mesurez la concentration en protéines à l’aide du test de Bradford.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Synthèse de 32pppGpp et ppGpp marqués P
<ol><li>Assembler une réaction Relseq à petite échelle dans un tube à bouchon à vis (voir tableau 1). REMARQUE : Travailler avec des réactifs radioactifs uniquement dans un endroit autorisé et avec de l’équipement de protection individuelle.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">Volume (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Petite échelle</td>
			<td>À grande échelle</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eau ultrapure</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>10x Relseq buffer*</td>
			<td>2</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>ATP (finale 8 mM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Relseq (4 μM final)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>
32 P-α-Guanosine triphosphate (GTP) (final 120 nM) (ATTENTION)</td>
			<td>0.2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>total</td>
			<td>20</td>
			<td>500</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Informations d’assemblage pour les réactions de synthèse à petite et à grande échelle de 32pppGpp marqués P. *10x Le tampon Relseq contient 250 mM de Tris-HCl, pH 8,6 ; 1M NaCl; 80 mM MgCl2. Abréviation : pppGpp = guanosine pentaphosphate.
<ol start="2"><li>Incuber le tube à 37 °C dans un thermomélangeur pendant 1 h, puis à 95 °C pendant 5 min, et placer sur de la glace pendant 5 min. Faites tourner la protéine précipitée à 15 700 x g pendant 5 min et transférez le surnageant (synthétisé 32P-pppGpp) dans un nouveau tube à bouchon à vis.</li>
	<li>Pour synthétiser 32P-ppGpp à partir de 32P-pppGpp, transférez la moitié du produit 32p-pppGpp dans un nouveau tube à bouchon à vis et ajoutez 1 μM GppA. Incuber le tube à 37 °C pendant 10 min, à 95 °C pendant 5 min, puis placer sur de la glace pendant 5 min.</li>
	<li>Faites tourner la protéine précipitée à 15 700 x g pendant 5 min et transférez le surnageant (synthétisé 32P-ppGpp) dans un nouveau tube à bouchon à vis.</li>
	<li>Analyser les 32P-pppGpp et 32P-ppGpp en faisant fonctionner 1 μL des échantillons sur une plaque de chromatographie sur couche mince (TLC) (plaques TLC de cellulose modifiée à la polyéthylèneimine) en utilisant le 1,5 M KH2PO4, pH 3,4, comme phase mobile. REMARQUE: Utilisez leα-32P-marqué guanosine 5'-triphosphate(32P-α-GTP) comme témoin.</li>
	<li>Séchez complètement la plaque TLC, placez-la entre un dossier en plastique transparent et exposez-la à un écran de stockage au phosphore pendant 5 minutes. Visualisez et quantifiez les signaux à l’aide d’un phosphorimager. REMARQUE: Lorsque les rapports de 32P-pppGpp et 32P-ppGpp sont supérieurs à 85%, une réaction à grande échelle (500 μL, suffisant pour le criblage de 20 plaques de 96 puits) peut être assemblée et synthétisée à l’aide du tableau 1.</li>
</ol>4. Dépistage DRaCALA des protéines cibles de (p)ppGpp
<ol><li>Décongeler et transférer 20 μL de lysates de cellules entières vers une plaque de microtitrage à fond en V de 96 puits. Ajouter 2,5 U/puits d’endonucléase de Serratia marcescenset incuber à 37 °C pendant 15 min pour réduire la viscosité du lysate. Placez les lysates sur de la glace pendant 20 min.</li>
	<li>Mélanger les 32P-pppGpp et 32P-ppGpp dans un rapport de 1:1, et ajouter 1x tampon de lyse L1 pour que la concentration finale de (p)ppGpp soit égale à 4 nM. REMARQUE: Compte tenu de la similitude chimique entre pppGpp et ppGpp, un mélange des deux produits chimiques simplifiera le processus de criblage.</li>
	<li>Utilisez une pipette multicanal et des embouts de pipette filtrés pour ajouter et mélanger 10 μL du mélange (p)ppGpp avec le lysate cellulaire. Incuber à température ambiante (RT) pendant 5 min.</li>
	<li>Lavez l’outil à 96 broches en le plaçant dans une solution à 0,01% de détergent non ionique pendant 30 s et séchez-le sur un papier de soie pendant 30 s. Répétez le lavage de l’outil de broche 3x.</li>
	<li>Placez l’outil à broches dans les plaques d’échantillonnage de 96 puits ci-dessus et attendez 30 s. Soulevez l’outil à goupille vers le haut et placez-le directement sur une membrane de nitrocellulose pendant 30 s. REMARQUE: S’il manque un point, repérez 2 μL des échantillons correspondants avec une pipette et des pointes filtrées. Il est conseillé de faire une tache dupliquée du même échantillon comme indiqué ci-dessous.</li>
	<li>Sécher la membrane pendant 5 min à TA. Placez la membrane entre un dossier en plastique transparent et exposez-la à un écran de stockage au phosphore pendant 5 min. Visualisez à l’aide d’un phosphorimageur.</li>
</ol>5. Quantification et identification des protéines cibles potentielles
<ol><li>Utilisez le logiciel d’analyse associé au phosphorimager pour ouvrir le fichier .gel des plaques visualisées. Utilisez la fonction d’analyse Array pour définir les 96 points en configurant une grille de 12 colonnes x 8 lignes.</li>
	<li>Définissez de grands cercles pour circonscrire le bord extérieur de l’ensemble des taches (voir Figure 1B). Exportez volumn+background et area des grands cercles définis et enregistrez-les dans une feuille de calcul. REMARQUE: Si nécessaire, repositionnez chaque cercle individuel pour qu’il se chevauche parfaitement avec les taches et redimensionnez chaque cercle individuel pour le rendre légèrement plus grand que le point réel.</li>
	<li>Dimensionnez les cercles définis pour circonscrire les petits points intérieurs. Exportez Volumn+Backgroundet Area des petits cercles définis, puis enregistrez-les dans une feuille de calcul.</li>
	<li>Calculez les fractions de liaison dans la feuille de calcul à l’aide de l’équation de la figure 1Bet tracez les données. Identifier les protéines de liaison potentielles dans les puits qui présentent des fractions de liaison élevées par rapport à la majorité des autres puits.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig02.jpg"> Figure 2: Flux de travail global du processus de sélection DRaCALA. La production de protéines à partir d’une collection Escherichia coli ASKA est induite et les cellules sont lysées. Pendant ce temps, les protéines recombinantes Relseq-Hiset GppA-His sont purifiées et utilisées pour synthétiser 32pppGpp et ppGpp marqués P à partir de 32P-α-GTP. Les molécules (p)ppGpp radioactivement étiquetées sont ensuite mélangées avec les lysates, et un outil à 96 broches est utilisé pour repérer les mélanges sur une membrane de nitrocellulose pour une exposition ultérieure à un écran de stockage du phosphore, l’imagerie et la quantification des signaux radioactifs. Abréviations: DRaCALA = Action capillaire radiale différentielle du test de ligand; (p)ppGpp = guanosine penta- et tétraphosphates; RT = température ambiante; IPTG = isopropyle β-d-1-thiogalactopyranoside; GTP = guanosine 5'-triphosphate; SDS-PAGE = électrophorèse sur gel de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium ; TLC = chromatographie sur couche mince. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

L’une des étapes critiques dans la réalisation du dépistage DRaCALA est d’obtenir de bons lysates de cellules entières. Tout d’abord, les protéines testées doivent être produites en grande quantité et sous des formes solubles. Deuxièmement, la lyse des cellules doit être complète et la viscosité du lysate doit être minimale. L’inclusion de lysozyme et l’utilisation de trois cycles de gel-dégel sont souvent suffisantes pour lyser complètement les cellules. Cependant, l’ADN chromosomique libéré rend le lysate visqueux et g...

Les bactéries utilisent plusieurs petites molécules de signalisation pour s’adapter à des environnements en constante évolution1,2. Par exemple, les auto-inducteurs, les lactones N-acylhomosérine et leurs oligopeptides modifiés, médient la communication intercellulaire entre les bactéries pour coordonner le comportement de la population, un phénomène connu sous le nom de quorum sensing2. Un autre groupe de petites molécules de signalisation est les NSM, y compris l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc), le di-AMP cyclique, la di-guanosine monophosphate cyclique (di-GMP cyclique) et les penta- et tétraphosphates de guanosine (p)ppGpp1. Les bactéries produisent ces NSM en réponse à une variété de conditions de stress différentes. Une fois produites, ces molécules se lient à leurs protéines cibles et régulent plusieurs voies physiologiques et métaboliques différentes pour faire face aux stress rencontrés et améliorer la survie bactérienne. Par conséquent, l’identification des protéines cibles est une condition préalable inévitable pour déchiffrer les fonctions moléculaires de ces petites molécules.
La dernière décennie a été témoin d’un boom des connaissances sur ces petites molécules de signalisation, principalement en raison de plusieurs innovations techniques qui ont dévoilé les protéines cibles de ces petites molécules. Il s’agit notamment de la technique du composé de capture3,4,5et de l’action capillaire radiale différentielle du test de ligand (DRaCALA)6 qui sera discutée dans cet article.
Inventé par Vincent Lee et ses collègues en 20116,DRaCALA déploie la capacité d’une membrane de nitrocellulose à séquestrer différemment des ligands libres et liés aux protéines. Les molécules telles que les protéines ne peuvent pas diffuser sur une membrane de nitrocellulose, tandis que de petits ligands, tels que les NSM, sont capables de le faire. En mélangeant le NSM(par exemple,ppGpp) avec la protéine à tester et en les repérant sur la membrane, on peut s’attendre à deux scénarios (Figure 1): Si (p)ppGpp se lie à la protéine, le (p)ppGpp radiomarqué sera retenu au centre de la tache par la protéine et ne diffusera pas vers l’extérieur, donnant un petit point intense(c’est-à-dire, signal radioactif fort) sous un imageur phosphoré. Cependant, si (p)ppGpp ne se lie pas à la protéine, elle diffusera librement vers l’extérieur pour produire une grande tache avec un signal radioactif de fond uniforme.
De plus, DRaCALA peut détecter l’interaction entre une petite molécule et une protéine non purifiée dans un lysate cellulaire entier si la protéine est présente en quantité suffisante. Cette simplicité permet l’utilisation de DRaCALA dans l’identification rapide de cibles protéiques à l’aide d’une bibliothèque d’expression ORFeome. En effet, les protéines cibles de l’AMPc7,du di-AMP8cyclique,du di-GMPcyclique 9,10et du (p)ppGpp11,12,13 ont été systématiquement identifiées à l’aide de DRaCALA. Cet article vidéo utilise (p)ppGpp comme exemple pour démontrer et décrire les étapes et les considérations critiques dans la réalisation d’un dépistage DRaCALA réussi. Il est à noter qu’il est fortement recommandé de lire une description plus complète de DRaCALA14 en combinaison avec cet article avant d’effectuer DRaCALA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig01.jpg"> Figure 1: Le principe de DRaCALA. (A) Schéma du test DRaCALA. Voir le texte pour plus de détails. (B) Quantification et calcul de la fraction liante. Voir le texte pour plus de détails. En bref, les taches DRaCALA seront analysées en dessinant deux cercles qui circonscrivent la tache entière et le point sombre interne(c’est-à-direle (p)ppGpp retenu en raison de la liaison de la protéine testée). Le signal de liaison spécifique est le signal radioactif du cercle intérieur (S1) après soustraction du signal de fond non spécifique (calculé par A1 × ((S2-S1)/(A2-A1))). La fraction de liaison est le signal de liaison spécifique divisé par le signal radioactif total (S2). Abréviations: DRaCALA = Action capillaire radiale différentielle du test de ligand; (p)ppGpp = guanosine penta- et tétraphosphates; RT = température ambiante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>32P-&alpha ;-GTP</td><td>Perkinelmer</td><td>BLU006X250UC</td><td></td></tr><tr><td>96 x outil à goupille</td><td>V& P Scientific</td><td>VP 404</td><td>96 Réplicateur de boulons, sur 9 mm d’entraxe, diamètre de boulon de 4,2 mm, 24 mm de long</td></tr><tr><td>Plaque de microtitration à fond en V de 96 puits</td><td>Sterilin</td><td>MIC9004</td><td>Microplaque de Sterilin V Well 611V96</td></tr><tr><td>Agar</td><td>OXOID - Thermo Fisher</td><td>LP0011</td><td>Gélose n° 1</td></tr><tr><td>Souche de collection ASKA</td><td>NBRP, SHIGEN, JAPON</td><td></td><td>Réf : DNA Research, volume 12, numéro 5, 2005, pages 291-299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012</td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>SIGMA</td><td>E1014-25KU</td><td>endonucléase génétiquement modifiée à partir de Serratia marcescens</td></tr><tr><td>Bradford Protein Assay Dye</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td>Reagent Concentrate</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIGMA</td><td>D8418</td><td>&ge ; 99,9 %</td></tr> <tr><td>DNase 1</td><td>SIGMA</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>filtration sur gel10x300 colonne</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>contient 20 % d’éthanol comme conservateur</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>PanReac AppliChem</td><td>122329.1214</td><td>Glycérol 87 % pour l’analyse</td></tr><tr><td>Hypercassette</td><td>Amersham</td><td>RPN 11647</td><td>20 x 40 cm</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>SIGMA</td><td>56750</td><td>puriss. p.a., &ge ; 99,5 % (GC)</td></tr><tr><td>Écran au phosphore de stockage IP</td><td>FUJIFILM</td><td>28956474</td><td>BAS-MS 2040 20x 40 cm</td></tr><tr><td>Isopropyle &beta ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>SIGMA</td><td>I6758</td><td>Isopropyl &beta ;-D-thiogalactoside</td></tr><tr><td>Lysogeny Broth (LB)</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher</td><td>12795027</td><td>Miller’s LB Base</td></tr><tr><td>de bouillon Lysozyme</td><td>SIGMA</td><td>L4949</td><td>du blanc d’oeuf de poule ; BioUltra, poudre lyophilisée, &ge ; 98 %</td></tr><tr><td>MgCl2 (Chlorure de magnésium)</td><td>Pipette</td><td></td> multicanaux pour eau ultra-pure 208337 <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>4661110</td><td>F1 - Clip Tip ; 1-10 ul, 8 x canaux</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Chemicals</td><td>27810</td><td>AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qiagen</td><td>30230</td><td></td></tr><tr><td>Membrane buvard nitrocellulosique</td><td>Amersham Protran</td><td>10600003</td><td>Premium 0,45 um 300 mm x 4 m</td></tr><tr><td>PBS</td><td>OXOID - Thermo Fisher</td><td>BR0014G</td><td>Solution saline tamponnée au phosphate (Dulbecco A), Comprimés</td></tr><tr><td>PEG3350 (Polyéthylène glycol 3350)</td><td>SIGMA</td><td>202444</td><td></td></tr><tr><td>fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF)</td><td>SIGMA</td><td>93482</td><td>Solution de fluorure de phénylméthanesulfonyle - 0,1 M dans de l’éthanol (T)</td></tr><tr><td>Imageur au phosphore</td><td>GE Healthcare</td><td>28955809</td><td>Typhoon FLA-7000 Pointes de pipette pour imageur au phosphore</td></tr><tr><td>, filtrées</td><td>Thermo Scientific</td><td>94410040</td><td>ClipTip 12.5 &mu ; l</td></tr><tr><td>colonne de chromatographie Poly-Prep</td> non stérile <td>Colonne de chromatographie en polypropylène</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550</td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase Mini</td><td>Pierce</td><td>A32955</td><td>Comprimés, tube à</td></tr><tr><td>bouchon à vis</td> sans EDTA <td>Thermo Scientific</td><td>3488</td><td>Tubes microcentifuge, 2,0 ml avec bouchon à vis, non</td></tr><tr><td>stériles SLS 96-deep Plaques à puits</td><td>Greiner</td><td>780285</td><td>MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom,</td></tr><tr><td>Natural spin column</td><td>Millipore</td><td>UFC500396</td><td>Amicon Ultra -0,5 ml Filtres centrifuges</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Thermomixer C</td></tr><tr><td>Plaque TLC (PEI-cellulose F plaques TLC)</td><td>Merck Millipore</td><td>105579</td><td>DC PEI-cellulose F (20 x 20 cm)</td></tr><tr><td>Tris</td><td>SIGMA</td><td>BP152</td><td>Tris Base pour la biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA</td><td>P1379</td><td>détergent visqueux non ionique</td></tr><tr><td>&bêta ;-mercaptoéthanol</td><td>SIGMA</td><td>M3148</td><td>99 % (GC/titrage)</td></tr></tbody></table>

identification des protéines de liaison des petits ligands avec l’action capillaire radiale différentielle du test de ligand (dracala)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

La dernière décennie a vu d’énormes progrès dans la compréhension des petites molécules de signalisation dans la physiologie bactérienne. En particulier, les protéines cibles de plusieurs messagers secondaires dérivés de nucléotides (NSM) ont été systématiquement identifiées et étudiées dans des organismes modèles. Ces réalisations sont principalement dues au développement de plusieurs nouvelles techniques dont la technique du composé de capture et l’action capillaire radiale différentielle du dosage des ligands (DRaCALA), qui ont été utilisées pour identifier systématiquement les protéines cibles de ces petites molécules. Cet article décrit l’utilisation des NSM, de la guanosine penta- et des tétraphosphates (p)ppGpp, à titre d’exemple et de démonstration vidéo de la technique DRaCALA. En utilisant DRaCALA, 9 des 20 protéines cibles connues et 12 nouvelles de (p)ppGpp ont été identifiées dans l’organisme modèle, Escherichia coli K-12, démontrant la puissance de ce test. En principe, DRaCALA pourrait être utilisé pour étudier de petits ligands qui peuvent être marqués par des isotopes radioactifs ou des colorants fluorescents. Les étapes critiques, les avantages et les inconvénients de DRaCALA sont discutés ici pour une application ultérieure de cette technique.

Suivre le protocole décrit ci-dessus donnera généralement deux types de résultats (Figure 3).
La figure 3A montre une plaque avec des signaux de liaison de fond relativement faibles (fractions de liaison &lt; 0,025) provenant de la majorité des puits. Le signal de liaison positif du puits H3 donne une fraction de liaison d’environ 0,35 qui est beaucoup plus élevée que celle observée pour les autres puits. Même sans quantification, le ...

L’action capillaire radiale différentielle du test de ligand (DRaCALA) peut être utilisée pour identifier les petites protéines de liaison au ligand d’un organisme à l’aide d’une bibliothèque ORFeome.

Identification des protéines de liaison des petits ligands avec l’action capillaire radiale différentielle du test de ligand (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

De petites molécules de signalisation ciblent diverses protéines effectrices pour contrôler la virulence bactérienne et la biologie humaine. Cependant, ces protéines effectrices sont difficiles à identifier. En tant qu’outil de biologie des systèmes, DRaCALA permet une identification réalisable, rapide et très sensible des protéines effectrices inconnues à l’aide d’une bibliothèque OVium.DRaCALA pourrait être utilisé pour étudier n’importe quelle petite molécule de signalisation tant qu’elle peut être étiquetée avec des isotopes radioactifs ou des colorants fluorescents. Commencez par inoculer E. coli en 1,5 millilitre de LB complété par 25 microgrammes par millilitre de chloramphénicol dans chaque puits de plaques de puits profondes de 96 puits pour une incubation nocturne à 30 degrés Celsius et 160 rotations par minute. Le lendemain matin, traiter les cultures de nuit avec 500 IPTG micromolaires pendant six heures à 30 degrés Celsius pour induire l’expression des protéines.À la fin de l’incubation, arouillez les cellules par centrifugation, retirez le surnageant et congelez les échantillons à moins 80 degrés Celsius. Pour initier la lyse, resuspendez les granulés dans 150 microlitres de tampon de lyse un par puits pour une incubation de 30 minutes à moins 80 degrés Celsius avant de décongeler les cellules pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. Le lysate doit ensuite être conservé à moins 80 degrés Celsius avant utilisation.Pour compléter la lyse des cellules avec des protéines surexprimées, resuspendez les échantillons dans 40 millilitres de tampon de lyse glacée deux et soniquez les échantillons à une amplitude de 60% à deux secondes sur quatre secondes pendant huit minutes, puis nettoyez les lysates par centrifugation. Pendant que les échantillons sont en cours de centrifugation, ajoutez 500 microlitres de résine nickel-NTA homogénéisée à une colonne de chromatographie en polypropylène sur pied. Après 15 minutes, laver la résine déposée deux fois avec 15 millilitres d’eau ultrapure et une fois avec 15 millilitres de tampon de lyse deux.À la fin de la centrifugation, chargez le surnageant de lysate dégagé sur la colonne. Lorsque tout le lysate a coulé à travers la colonne, lavez la colonne avec 30 millilitres de tampon de lavage. Pour éluer les protéines, ajoutez 400 microlitres de volume de tampon d’élution à la colonne et répétez l’élution trois fois.Un autre volume de 300 microlitres du tampon d’élution pour répéter l’élution trois fois et combiner les protéines éluées dans un volume final de 700 microlitres. Pour la filtration sur gel de l’échantillon élué, après avoir lavé une colonne d’exclusion de taille avec 25 millilitres de tampon de filtration en gel fraîchement préparé, chargez tout le volume de protéine éluée sur la colonne à l’aide d’une boucle de 500 microlitres. Exécutez à 500 microlitres par minute et collectez deux à trois fractions volumiques de 500 microlitres des protéines respectives.Ensuite, utilisez des colonnes de spin individuelles pour concentrer chaque protéine et utilisez le kit de dosage de Bradford pour mesurer les concentrations de protéines selon des protocoles standard. Pour synthétiser le pentaphosphate de guanosine marqué phosphore 32, assemblez une réaction Relseq à petite échelle dans un tube à bouchon à vis comme indiqué dans le tableau et incubez la réaction dans un ThermoMixer pendant une heure à 37 degrés Celsius et cinq minutes à 95 degrés Celsius, suivies de cinq minutes sur glace. À la fin des incubations, faire tourner la protéine précipitée par centrifugation et transférer le phosphore synthétisé 32 marqué guanosine pentaphosphate contenant un surnageant dans un nouveau tube à bouchon à vis.Pour la synthèse du phosphore 32 guanosine tétraphosphate, ajouter un GppA micromolaire à la moitié du produit de guanosine pentaphosphate marqué phosphore 32 dans un nouveau tube à bouchon à vis et incuber la réaction pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius, cinq minutes à 95 degrés Celsius et cinq minutes sur glace. À la fin de l’incubation, faire tourner le précipité par centrifugation et transférer le phosphore 32 marqué guanosine tétraphosphate contenant un surnageant dans un nouveau tube. Pour analyser les protéines cibles isolées, exécutez un microlitre de chaque échantillon sur une plaque de chromatographie sur couche mince en utilisant 1,5 molaire de phosphate monopotassique comme phase mobile.Après l’analyse, placez la plaque séchée dans un dossier en plastique transparent et exposez-la à un écran de phosphore de stockage pendant cinq minutes avant de visualiser et de quantifier les données sur un imageur au phosphore. Pour le criblage DRaCALA des protéines cibles, ajouter 20 microlitres de lysates en gros décongelés à des puits individuels d’une plaque de microtitrage à fond en V de 95 puits et ajouter 2,5 unités d’endonucléase serratia marcescens à chaque puits. Après 15 minutes à 37 degrés Celsius, placez les lysates sur de la glace pendant 20 minutes.Ensuite, mélangez des volumes égaux de phosphore 32 marqué guanosine pentaphosphate et guanosine tétraphosphate et ajoutez un tampon de lyse 1X au mélange pour obtenir une solution de pentaphosphate de guanosine à quatre nanomolaires. À l’aide d’une pipette multicanal et d’embouts de pipette filtrés, mélanger 10 microlitres du mélange de guanosine pentaphosphate avec le lysate cellulaire pour une incubation de cinq minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, lavez un outil à broches 96X trois fois dans une solution à 0,01% de détergent non ionique pendant 30 secondes, suivi de 30 secondes de séchage sur une serviette en papier par lavage avant de placer l’outil à goupille dans la plaque d’échantillonnage de 96 puits.Après 30 secondes, soulevez l’outil à broches vers le haut et placez-le directement sur une membrane de nitrocellulose pendant 30 secondes. Après cinq minutes de séchage, placez la membrane de nitrocellulose dans un dossier en plastique transparent pour stocker l’exposition à l’écran de phosphore et la visualisation par imagerie au phosphore, comme démontré. Pour quantifier et identifier les protéines cibles potentielles, dans le logiciel d’analyse associé à l’imageur de phosphore, ouvrez le fichier gel des plaques visualisées.Pour définir les points à analyser, utilisez la fonction d’analyse de tableau pour configurer une grille de 12 colonnes sur huit lignes. Pour circonscrire le bord extérieur des taches de trou, définissez de grands cercles, exportez le volume ainsi que l’arrière-plan et la zone des grands cercles définis vers une feuille de calcul. Pour circonscrire les petits points intérieurs, réduisez la taille des cercles définis, exportez le volume ainsi que l’arrière-plan et la zone des petits cercles définis et enregistrez toutes les données dans la feuille de calcul.Positionnez les cercles pour qu’ils se chevauchent avec les taches si nécessaire, en redimensionnant les taches légèrement plus grandes que les taches réelles. Utilisez l’équation pour calculer les fractions de liaison dans la feuille de calcul et tracer les données. Ensuite, identifiez les protéines de liaison potentielles dans les puits qui présentent des fractions de liaison élevées par rapport à la majorité des autres puits.Dans cette analyse représentative, on peut observer une plaque avec des signaux de liaison de fond relativement faibles dans la plupart des puits. Le signal de liaison positif dans le puits H3 présentait une fraction de liaison beaucoup plus élevée que celle observée pour les autres puits en raison de la surexpression de la protéine de liaison à la guanosine pentaphosphate Hpt. Dans les plaques représentatives, plusieurs puits ont montré des signaux de liaison de fond relativement plus élevés, comme l’indiquent les points internes relativement forts observés dans de nombreux puits, ainsi que les fractions de liaison constamment élevées observées après quantification.Notamment, certaines cibles ont également donné des fractions de liaison variables, telles que les faux positifs. Pour clarifier davantage, les chercheurs ont utilisé des protéines purifiées pour tester à nouveau la liaison. Une fois les protéines cibles identifiées, on peut les purifier en homogénéité et confirmer la force et la spécificité de l’interaction en utilisant DRaCALA, la calorimétrie de titrage isotherme ou d’autres méthodes.L’identification des protéines cibles de petites molécules de signalisation ouvre la voie à une compréhension approfondie des rôles émergeant de la virulence bactérienne à la biologie humaine.

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Cette vidéo décrit la méthode d’analyse de l’interaction protéine-ligand par électrophorèse capillaire d’affinité de déplacement de mobilité. Cette méthode peut être utilisée pour caractériser le comportement de liaison d’une protéine avec divers ligands chargés.

Électrophorèse capillaire d’affinité de décalage de mobilité : une méthode pour analyser les interactions échantillon-ligand en fonction de la migration différentielle de complexes protéine-ligand

Cette vidéo démontre l’action capillaire radiale différentielle du dosage des ligands, une technique de criblage systématique à haut débit des protéines de liaison du second messager du nucléotide intracellulaire. Cette technique permet de lier directement les messagers à la protéine cible surexprimée dans le lysat cellulaire, sans avoir à se purifier des protéines.

Action capillaire radiale différentielle du dosage du ligand : une technique à haut débit pour identifier les protéines intracellulaires de liaison au second messager du nucléotide bactérien

Thermophorèse Microscale (MST) peut être largement utilisé pour la détermination de l'affinité de liaison sans purification de la protéine cible à partir de lysats cellulaires. Le protocole implique une surexpression de la protéine GFP-condensé, la lyse des cellules dans des conditions non dénaturantes, et la détection des signaux HNR en présence de concentrations variables du ligand.

Protein Purification méthode sans la détermination de l&#39;affinité de liaison par thermophorèse Microscale

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Les protocoles présentés décrivent deux techniques basées sur le dosage immunoenzymatique (ELISA) pour l'étude rapide des interactions ligand-récepteur : Le premier dosage permet la détermination de la constante de dissociation entre le ligand et le récepteur. Le deuxième dosage permet un criblage rapide de peptides bloqueurs pour les interactions ligand-récepteur.

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Nous décrivons ici une méthode d’identification des protéines de liaison aux petites molécules à l’aide du marquage par photoaffinité. L’avantage de cette technique est que la liaison et le marquage covalent des protéines cibles se produisent dans l’environnement cellulaire vivant, éliminant ainsi le risque de perturber la structure des protéines natives et les conditions de liaison lors de la lyse cellulaire.

Identification des protéines de petites molécules de liaison dans un Natif cellulaire Environnement par des cellules vivantes photoaffinité Étiquetage

Le protocole ici décrit les interactions de protéine purifiée hEAG1 de canal ionique avec la petite molécule lipidique ligand phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2). La mesure démontre que BLI pourrait être une méthode potentielle pour le dépistage de nouvelles petites molécules ion canal ligand.

Capturer la cinétique de l’Interaction d’une protéine canal ionique avec petites molécules par le dosage de l’interférométrie Bio-couche

Un protocole détaillé pour effectuer un titrage ELISA est décrite. En outre, un nouvel algorithme est présenté afin d’évaluer le titrage des tests ELISA et d’obtenir une constante de dissociation de liaison d’un ligand soluble à un récepteur immobilisée plaque de microtitration.

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Nous présentons ici un protocole pour la production et la purification des protéines qui sont marqués avec des isotopes stables et ultérieure caractérisation des interactions protéine-protéine à l’aide de la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) et micro-échelle Expériences de thermophorèse (MST).

Mesurer les Interactions des protéines globulaires et filamenteuses par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) et thermophorèse a petite Echelle (MST)

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Identification des protéines de liaison des petits ligands avec l’action capillaire radiale différentielle du test de ligand (DRaCALA) (Vidéo) | JoVE Journal

Identification des protéines de liaison des petits ligands avec l’action capillaire radiale différentielle du test de ligand (DRaCALA)

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