Une seule molécule Simple, robuste et haut débit débit étirement test mise en place pour étudier le Transport de molécules le long de l’ADN

L’objectif global de cette procédure est de mettre au point un test d’étirement de flux de molécules uniques simple, robuste et à haut débit pour étudier le transport des molécules le long de l’ADN. Ceci est accompli en préparant d’abord de l’ADN lambda marqué à la biotine en ligaturant un oligo marqué à la biotine à l’ADN lambda. La deuxième étape consiste à préparer des lamelles fonctionnalisées en polyéthylène glycol ou PEG en suivant un protocole de réaction en une étape.

Ensuite, une cellule d’écoulement à haut débit est construite en prenant en sandwich un ruban adhésif double face avec des canaux prédécoupés entre une lamelle fonctionnalisée PEG et une dalle de polydiméthylsiloxane ou PDMS contenant des trous d’entrée et de sortie. La dernière étape consiste à suivre les trajectoires de molécules fluorescentes uniques dans le canal d’écoulement à l’aide de l’imagerie TIRF. Pour identifier les trajectoires des molécules uniques diffusant le long de l’ADN lambda étiré en flux, un logiciel de suivi de particules uniques personnalisé fiable et efficace est utilisé pour analyser les images brutes de fluorescence

Les principaux avantages de cette configuration d’essai par rapport aux autres sont la fiabilité de la préparation des lamelles, une capacité de débit plus élevée, un temps de manipulation réduit pour la préparation des échantillons et une analyse des données non supervisée plus rationalisée. La démonstration de la procédure sera faite par un post-doctorant de mon laboratoire, le Dr Kan Xiong. Avant de commencer ce test, préparez tous les réactifs nécessaires comme décrit dans le texte du protocole.

Chauffez 0,5 milligramme par millilitre de bouillon lambda-DNA à 65 degrés Celsius pendant 60 secondes et plongez immédiatement dans la glace humide. Mélangez 100 microlitres de la solution d’ADN lambda avec deux microlitres de 10 oligomoles micromolaires marqués à la biotine à l’intérieur d’un tube de microcentrifugation. Chauffez le mélange à 65 degrés Celsius pendant 60 secondes, puis refroidissez lentement à température ambiante.

Placez le mélange sur de la glace. Ajoutez 11 microlitres de tampon de réaction T4 DNA ligase et mélangez doucement. Puis deux microlitres équivalents à 800 unités d’ADN ligase T4 et mélangez doucement.

Incuber le mélange pendant deux heures à 16 degrés Celsius ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Purifier le produit à l’aide de tubes filtrants centrifuges dont le poids moléculaire nominal est limité à 100 kilodaltons. Le sonicate numéro un est appliqué dans de l’éthanol à 95 % dans un bocal de coloration pendant 10 minutes, puis rince trois fois à l’eau ultrapure.

Remplissez le bocal de coloration avec une molaire d’hydroxyde de potassium, sonicate à nouveau pendant 10 minutes, puis rincez trois fois à l’eau ultra-pure. Répétez ce cycle deux fois. Séchez les lamelles sous un flux d’azote gazeux propre et sec.

Nettoyez et séchez davantage les lamelles en effectuant un traitement au plasma d’air à une pression de 900 millitorrs pendant cinq minutes. Incubez des lamelles avec 50 microlitres de 25 milligrammes par millilitre de silane-polyéthylène glycol-biotine dissous dans de l’éthanol à 95 % à température ambiante pendant deux heures. Lavez l’excès de polyéthylène glycol avec de l’eau ultra-pure et séchez les lamelles recouvertes de polyéthylène glycol sous un flux d’azote gazeux propre et sec.

Concevez des canaux d’écoulement à l’aide d’un logiciel de CAO et coupez les canaux sur un ruban adhésif double face à l’aide d’un coupe-ruban. Retirez les résidus de bande à l’intérieur des canaux. Pour fabriquer des plaques PDMS, mélangez soigneusement 45 grammes de PDMS avec cinq grammes de réactif de réticulation à l’aide d’un mélangeur.

Versez le mélange dans deux boîtes de Pétri de 100 millimètres et laissez les plats à l’intérieur d’une chambre à vide pendant environ 30 minutes jusqu’à ce que toutes les bulles d’air aient disparu. Laissez la vaisselle dans un four à 80 degrés Celsius pendant environ deux heures jusqu’à ce que le PDMS se solidifie. Découpez une dalle PDMS qui correspond à la taille du ruban adhésif double face avec des canaux prédécoupés.

Décollez un film de protection du ruban adhésif double face et collez-le sur un côté plat de la dalle PDMS. Percez les trous de sortie et d’entrée sur la dalle PDMS à l’aide d’une perforatrice à biopsie avec une aiguille de calibre 23. Décollez l’autre film de protection du ruban adhésif double face et collez-le sur la surface fonctionnalisée de la lamelle.

Fixez la cellule d’écoulement assemblée sur un insert de platine de microscope. Chargez tous les réactifs pré-dégazés dans des réservoirs dotés d’un tube Tygon relié à une électrovanne et d’un autre tube relié à un tube PEEK qui empêchera le reflux des réactifs. Le débit des réactifs est contrôlé par des électrovannes contrôlées par une application de programmation de script.

Amorcez un canal d’écoulement en l’écoulant dans un tampon vierge. Insérez trois autres tubes PEEK dans les trous d’entrée. Veillez à ne pas induire la formation de bulles d’air à l’intérieur du canal.

Connectez un tube Tygon avec un tube PEEK court du trou de sortie à un conteneur de déchets d’échantillons. Versez 0,2 milligramme par millilitre de solution de streptavidine et incubez pendant cinq minutes. Ensuite, versez dans un tampon vierge pour éliminer la streptavidine non liée.

Verser un milligramme par millilitre de solution d’albumine sérique bovine et incuber pendant une minute. Ensuite, versez un tampon vierge pour éliminer l’albumine sérique bovine non liée. Versez 100 solutions picomolaires de biotine-lambda-ADN et incubez pendant 10 minutes.

Ensuite, versez un tampon vierge pour éliminer les ADN lambda non liés. Pour vérifier la qualité de la lamelle fonctionnalisée PEG, injectez un colorant de coloration de l’ADN tel que le colorant SYTOX Orange et lancez l’imagerie de fluorescence. Si la qualité de la lamelle est bonne, la densité d’ADN lambda étirés en flux sera élevée.

Réglez également l’angle TIRF pour obtenir le rapport signal/bruit le plus élevé des images d’ADN lambda étirés presque entièrement en flux. Pour suivre les trajectoires de molécules uniques, commencez les incubations à l’intérieur d’un nouveau canal, puis fusionnez les molécules marquées au fluorophore subnanomolaire à un débit suffisamment élevé à l’aide d’une pompe à seringue et collectez des images de fluorescence en accéléré avec une fréquence d’images de 100 Hertz. En règle générale, 10 000 images sont collectées dans un champ de vision et les vidéos de plusieurs champs de vision sont collectées.

À la fin, versez à nouveau le colorant de coloration de l’ADN pour confirmer que les ADN peuvent toujours être étirés par l’écoulement. Un logiciel personnalisé de suivi des particules uniques sera utilisé pour identifier les trajectoires des molécules uniques diffusant le long de l’ADN. Le logiciel déterminera d’abord les positions centroïdes de particules uniques avec une grande précision.

Retirez les particules qui sont collées sur la surface de la lamelle, puis reliez les particules dans différentes images pour former des trajectoires en accéléré. À partir de ces trajectoires, les constantes de diffusion 1D seront estimées. Pour lancer l’analyse des données, ouvrez une application de programmation de script et rendez-vous dans le répertoire du logiciel de suivi des particules uniques.

Ouvrez un script nommé largedataprocess3.m. Un paramètre important à définir est la valeur seuil pour la détection d’une seule particule. Pour déterminer la valeur de seuil optimale, exécutez le determine_threshold_value.

M. Ce script visualise comment la valeur de seuil affecte la détection d’une seule particule. Après avoir déterminé la valeur de seuil optimale, exécutez largedataprocess3.

M. Une fois l’analyse de suivi des particules unique terminée, les trajectoires brutes seront filtrées en exécutant le trajectory_filtering. M.

Une interface utilisateur graphique ou interface graphique est conçue pour visualiser l’étape de filtrage. Dans le panneau GUI, définissez le déplacement minimal le long de l’ADN, MinXDisp, sur deux pixels. Réglez le déplacement maximal transversal à l’ADN, MaxYDisp, à deux pixels.

Définissez le nombre minimal d’images, minFrames, sur 10. Définissez le nombre minimal d’états du triplet, minTriplets, sur 10. Définissez la constante de diffusion minimale le long de l’ADN, D_par être nulle.

Réglez la constante de diffusion maximale estimée transversale à l’ADN, D_trans, à 10 méga paires de bases carrées par seconde. Définissez le paramètre statistique minimal, Chi2 Stat, sur moins cinq. Fixez à deux le rapport minimal du déplacement le long de l’ADN par rapport à celui transversal à l’ADN, MinX/Y.

Toutes les trajectoires brutes qui passent ces paramètres de filtrage seront répertoriées dans le tableau un et celles qui ne le font pas seront répertoriées dans le tableau trois. Cliquez sur un numéro de trajectoire dans le premier tableau. La trajectoire sera affichée dans les graphiques un et deux.

Cliquez sur le bouton de lecture pour lire les images brutes de fluorescence. Cliquez sur l’ajout au tableau2 si cette trajectoire est une trajectoire de glissement d’une seule molécule. Au final, toutes les trajectoires ajoutées à table2 seront sauvegardées lors de la fermeture de l’interface graphique.

Les trajectoires qui ont passé toutes les étapes de filtrage sont regroupées à partir desquelles la constante de diffusion moyenne sera estimée. Pour calculer les constantes de diffusion moyennes, il suffit d’exécuter le script calculate_mean_diffusion_constant.m. Cette procédure profitera à de nombreuses personnes qui étudient in vitro la biophysique des molécules uniques.