Microscopie intravitale de la microcirculation cérébrale souris en utilisant une fenêtre fermée crânienne

L’objectif global de cette procédure est d’étudier la microcirculation dans le cerveau de la souris par microscopie intravitale, ce qui permet de suivre les changements dynamiques des marqueurs hémodynamiques et inflammatoires dans la microcirculation de la pile sur de longues périodes de temps. Cette technique a été développée à l’Institut de bio-ingénierie de La Jolla, où elle a été utilisée pour de nombreux types d’études. Par exemple, le suivi des changements hémodynamiques au cours de l’infection à Plasmodium burgi onca et au moment de l’expression du paludisme cérébral.

Ceci est accompli en implantant d’abord une fenêtre crânienne chronique deux semaines avant les études de microscopie intravitale. La deuxième étape de la procédure consiste à enregistrer la morphologie globale de la fenêtre crânienne à l’aide d’une image numérique à haute résolution à faible grossissement. La troisième étape de la procédure consiste à acquérir des images de microscopie intravitale à l’aide d’un éclairage conventionnel et fluorescent, et à sélectionner des sites d’étude spécifiques pour les mesures en ligne du diamètre des vaisseaux et de la vitesse des globules rouges.

La dernière étape de la procédure consiste à effectuer une analyse intravitale de l’adhérence des leucocytes et des plaquettes dans les vaisseaux de la pile via des anticorps spécifiques marqués par fluorescence. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent in vivo, des changements microcirculatoires dans des modèles de miroir cérébral de conditions physiologiques, pathophysiologiques ou pathologiques grâce à la microscopie intravitale du cerveau pour établir des changements hémodynamiques associés à ces conditions. Le principal avantage de cette technique est que nous observons le cerveau dans son environnement physiologique sans l’exposer à des agents extérieurs ou à un milieu artificiel : la microscopie intravitale par rapport à l’image, la résonance magnétique et l’angiographie ont des résolutions spatiales et temporelles et nous permettent de regarder du niveau microscopique au niveau microscopique.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la physiologie et la physiopathologie de la microcirculation cérébrale, telles que les changements hémodynamiques et inflammatoires au cours d’une maladie aiguë et chronique Deux à trois semaines avant la microscopie intravitale. Une craniotomie est réalisée chez des souris âgées de huit à 10 semaines est préalablement démontrée sauf qu’une barre de titane n’est pas placée dans la tête de l’animal. La fenêtre crânienne chronique est une préparation stable, permettant d’examiner la microcirculation de la pile même des mois après avoir été implantée le jour de l’expérience.

Tout d’abord, vérifiez la température corporelle de l’animal avant de le placer dans un cadre stéréotaxique infusé d’érythrocytes préalablement préparés et marqués par fluorescence à travers la veine de la queue de la souris. Cela permettra de suivre les érythrocytes, ce qui sera démontré plus tard. Ensuite, anesthésez légèrement la souris avec de l’huile de fluor.

4 % pour l’induction, un à 2 % pour la maintenance. Ensuite, placez l’animal en position couchée dans un cadre stéréotaxique sur un coussin chauffant. Fixez soigneusement la tête à l’aide des barres d’oreille et ajustez le niveau à l’aide des leviers droit et gauche.

Nettoyez délicatement la lamelle de couverture sur la fenêtre crânienne à l’aide d’un coton-tige imbibé d’huile minérale. Ensuite, à l’aide d’un stéréomicroscope connecté à un appareil photo numérique, prenez quelques photos panoramiques des récipients sous la fenêtre. Après avoir transféré les photos panoramiques sur un ordinateur, sélectionnez la meilleure à imprimer, identifier et dater.

Cette photo servira de carte pour les mesures du diamètre des vaisseaux et des vitesses des globules rouges, qui seront démontrées ensuite pour commencer la microscopie intra-vitale. Transférez la souris sur une platine de microscope intravital personnalisée. Placez une goutte d’eau sur la fenêtre crânienne en profitant du puits formé par l’acrylique dentaire.

Un objectif à immersion dans l’eau 20x avec une ouverture numérique de 0,5 est utilisé. Les images sont enregistrées à l’aide de deux caméras, une caméra numérique à faible luminosité et à grande vitesse connectée à un ordinateur et à un moniteur, et une caméra analogique à faible luminosité connectée à une bande magnétoscope, un horodatage et un moniteur couleur avant de sélectionner les vaisseaux pour la mesure, de vérifier les vaisseaux pour évaluer la qualité de la préparation et si le sang circule dans tous les vaisseaux, Sélectionnez ensuite les récipients à mesurer. Ils doivent inclure des lieux et des artères de différents diamètres et couvrir différents endroits dans la zone exposée par la fenêtre.

Dans notre expérience, nous sélectionnons 12 vaisseaux pour la mesure pendant que vous visualisez divers champs dans la fenêtre crânienne. Pour sélectionner les vaisseaux, annotez l’emplacement précis de chaque point à mesurer sur la photo du système vasculaire PY qui a été prise plus tôt pour chaque point, le diamètre du vaisseau est mesuré à l’aide d’un dispositif de cisaillement d’image. Une fois l’endroit sélectionné, l’image du récipient est alignée en position verticale et l’image est déformée jusqu’à l’opposé.

Les extrêmes sont alignés et la lecture est documentée. Pour le suivi des érythrocytes, chaque point est enregistré par l’appareil photo numérique pendant au moins 30 secondes, et les images vidéo sont enregistrées à 150 images par seconde. Cette vitesse est réglée pour obtenir une à six images d’une cellule sur une trame vidéo pour la détermination de vitesses allant jusqu’à six millimètres par seconde.

Une fois la collecte de données terminée, retirez la souris du cadre stéréotaxique et remettez-la dans sa cage pour récupérer de l’anesthésie à l’aide d’un logiciel approprié. Les images vidéo acquises sont numérisées et XY. Les données de coordonnées de chaque image de cellule sont obtenues. Les positions des cellules sont déterminées manuellement plutôt que par l’analyse d’images.

Étant donné que l’œil d’un observateur averti donne une bonne estimation de l’emplacement du centre d’une cellule, qui correspond en général à l’emplacement de fluorescence maximale observée. Pour la plupart des orientations de cellules, la position et la vitesse sont déterminées pour 15 cellules dans chaque vaisseau. Une moyenne pour obtenir la vitesse moyenne des globules rouges une fois que le diamètre du récipient et les mesures de la vitesse des globules rouges sont disponibles.

Le calcul du débit sanguin dans chaque vaisseau peut être effectué à l’aide de la formule Q égale D sur deux fois au carré PI fois V où Q est égal au débit sanguin, V est égal à la vitesse des globules rouges et D est égal au diamètre du vaisseau pour l’évaluation de la profusion et l’analyse de l’adhérence leucocytaire dans les vaisseaux hémophytes. La microscopie intravitale est réalisée sur un animal perfusé avec un mélange d’albumine marquée FSE et d’anticorps contre le marqueur leucocytaire CD 45 marqué au Texas Red. L’albumine marquée par fluorescence permet une meilleure visualisation du réseau vasculaire, y compris les vaisseaux pénétrants, et est particulièrement utile dans les états pathologiques tels que le paludisme cérébral pour vérifier la présence de vaisseaux non perfusés ou sous-perfusés.

Les anticorps anti-CD 45 marqués par fluorescence facilitent l’identification et la quantification du roulement des leucocytes et de l’adhésion aux vaisseaux de l’amas. La quantification de l’adhésion des leucocytes se fait en comptant le nombre de leucocytes dans une longueur de vaisseau de 100 microns. Le roulement est quantifié en comptant le nombre de leucocytes se déplaçant à une vitesse significativement plus lente que la vitesse du sang dans la même longueur de 100 microns pendant 30 secondes. Montré.

Voici un exemple de mesures de la vitesse des globules rouges microvasculaires par suivi cellulaire à partir d’une fluorescence à grande vitesse. Les enregistrements vidéo de A à F sont des images-séquences de la microcirculation. Chaque image représente la position d’un seul globule rouge qui coule, qui est capturé image par image par la caméra à grande vitesse.

Ce graphique issu d’une expérience représentative montre les changements dans le flux sanguin de la pile au fil du temps. Chez les souris infectées par Plasmodium, burgi, Onca et chez les souris témoins non infectées, alors que chez les souris témoins, le flux sanguin de la pile est relativement stable dans le temps. Les souris infectées par le PBA montrent une diminution du marché du flux sanguin au moment du développement du paludisme cérébral.

Au sixième jour, la coloration avec des anticorps fluorescents anti CD 45, Texas Red révèle un grand nombre de leucocytes adhérant aux vaisseaux empilés d’une souris infectée par Plasmodium burgi onca. Cette procédure a un large éventail d’applications en plus du travail ici aujourd’hui. Toute technique optique pouvant être utilisée in vivo peut être adaptée à ce modèle et des paramètres tels que les tissus, le niveau d’oxygène dans les tissus, le pH, les espèces réactives de l’oxygène et l’interaction endothéliale avec les leucocytes peuvent être étudiés dans ce modèle.