Name: Une méthode rapide et efficace pour la purification des cellules endoderme Généré à partir dembryons humains Cellules souches (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Découvrez une méthode de purification des cellules endoderme dérivées de cellules souches embryonnaires humaines par séparation magnétique. Cette technique permet d'obtenir des populations cellulaires pures pour la recherche en biologie du développement.

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L&#39;assistance technique habile de Jasmin Kresse est grandement appréciée.

1. Différenciation des ESC humain vers le Endoderme Definitive <ol><li> Cultiver des cellules souches embryonnaires humaines (CES) dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Enduire un nouveau 6 puits plaque de culture cellulaire avec 1 ml d&#39;une matrice de membrane basale et incuber la culture-ware pendant au moins 30 min à température ambiante. Pour plus de détails s&#39;il vous plaît tourner vers les instructions du fabricant respectif. </li><li> Vérifiez que les CES de l&#39; homme de culture ont atteint 80% -90% de confluence sous le microscope à l&#39; aide d&#39; un faible grossissement (par exemple, 4X). Aspirer le milieu des cavités par aspiration du milieu avec une pipette Pasteur stérile en verre. Laver les cellules une fois avec une solution saline (PBS), une solution de phosphate tamponnée. Pour cela, ajoutez 2 ml de PBS à chaque puits doucement agiter la plaque et aspirer la solution pour éliminer les cellules mortes et les débris cellulaires. </li><li> Ajouter 1 ml de réactif de solution de repiquage sans enzyme pour la dissociation douce des amas de cellules. Incuber les cellules à 37 ° C, und 5% de CO 2 jusqu&#39;à ce que les cellules présentent des signes évidents de perturbation en petites grappes. NOTE: Le temps d&#39;incubation dépend du réactif utilisé. Pour la solution de passages sans enzyme mentionnée dans la section des matériaux, la durée d&#39;incubation est d&#39;environ 7 min. </li><li> Ajouter 1 ml de DMEM / F-12 et de perturber les agrégats de cellules restantes dans des cellules individuelles par pipetage de haut en bas à l&#39;aide d&#39;une pipette de 1 ml. Utiliser cette fonction pour rincer les cellules de la surface et de transférer les cellules dans un tube de centrifugation. Pour récupérer toutes les cellules, laver chaque puits avec 1 ml de DMEM / F-12 et ajouter le support au tube de centrifugation. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 5 min à 300 x g. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 5 ml ES milieu de culture cellulaire contenant 10 pM de la Rho-kinase (Roche) inhibiteur. </li><li> Compter les cellules au microscope en utilisant un hémocytomètre et épépiner 150.000 - 400.000 cellules par 6 puits ou dans une autre disposition de la plaque, en fonction de la lignée cellulaire ES utilisée. Utilisez culture du milieu contenant l&#39; inhibiteur de ROCK 10 um pour éviter l&#39; apoptose et la culture des cellules dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Environ 24 heures après l&#39;ensemencement Aspirer le milieu avec une pipette Pasteur en verre stérile et ajouter 2 ml de primitive moyenne série d&#39;induction. Remarque: Ce milieu contient des concentrations finales de 1% de glutamine, 0,2% de FCS, 5 uM CHIR-99021 et 50 ng / ml d&#39; activine A à l&#39; avance du milieu RPMI-1640. Généralement, utiliser 2 ml de milieu de culture dans des plaques 6 puits. </li><li> 48 heures après l&#39;ensemencement, remplacer le milieu de l&#39;endoderme milieu d&#39;induction. Cultiver les cellules dans ce milieu pendant encore 48 heures avec changement de milieu par jour. Remarque: Ce milieu contient 1% de glutamine, 0,2% de FCS et 50 ng / ml d&#39; activine A dans Advanced milieu RPMI-1640. Les cellules qui se sont engagés envers l&#39;endoderme définitif expriment le marqueur de surface CXCR4. La coloration de CXCR4 peut être utilisé pour quantifier le nombre de cellules DE-commis. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Coloration de CXCR4 + endoderme définitif cellules d&#39;analyse de cytométrie en flux <ol><li> Pour la dernière 24 heures, mais au moins 1 heure avant la récolte des cellules, ajouter un inhibiteur de ROCK 10 uM au milieu de culture. </li><li> Enduire la culture cellulaire-ware qui sera utilisé pour re-semis avec une matrice de membrane basale, à savoir, des plaques à 12 puits pour qPCR analyse ou chambre diapositives pour immunofluorescence. Incuber les plaques ou lames pendant au moins 30 min à température ambiante. </li><li> Aspirer le milieu avec une pipette Pasteur en verre stérile, à partir des puits des cellules différenciées utilisées pour la coloration et / ou de tri. </li><li> Ajouter 1 ml de réactif de la solution de passages sans enzyme pour la dissociation douce des amas de cellules. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO2 jusqu&#39;à ce que les cellules présentent des signes évidents de perturbation en petites grappes. NOTE: Le temps d&#39;incubation dépend du réactif utilisé. Pour la solution de passages sans enzyme mentionnée dans la materisection als, le temps d&#39;incubation est d&#39;environ 7 min. </li><li> Ajouter 1 ml de DMEM / F-12 et de perturber restant agrégats de cellules dans des cellules individuelles par pipetage de haut en bas à l&#39;aide d&#39;une pointe de 1 ml. Utiliser cette fonction pour rincer les cellules de la surface et de transférer les cellules dans un tube de centrifugation. Pour récupérer toutes les cellules, laver chaque puits avec 1 ml de DMEM / F-12 w / o FCS et ajouter le support au tube de centrifugation. </li><li> Compter les cellules au microscope en utilisant un hémocytomètre. Les cellules provenant de trois puits d&#39;une plaque à 6 puits devraient aboutir à 10-15 x 10 6 cellules après trois jours de différenciation. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 300 x g. NOTE: Le nombre exact de cellules obtenues dépendra de la lignée cellulaire pluripotente utilisée pour la différenciation. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un tampon PEB contenant un inhibiteur de ROCK 10 uM. Utiliser 100 pl de ce tampon pour 10 7 cellules. Ajouter l&#39;inhibiteur de ROCK 10 uM au jour de staining. Utilisez ce tampon pour toutes les applications en aval (appelés PEB tampon + RI). REMARQUE: tampon PEB contient 0,5% de BSA et 2 mM EDTA dans du PBS. Si plusieurs cellules doivent être colorées, régler le volume de la mémoire tampon en conséquence. </li><li> Ajouter 10 ul d&#39;un anticorps CXCR4 APC pour 10 7 cellules dans 100 ul, ce qui représente à peu près une dilution de 1:10. NOTE: L&#39;utilisation d&#39;un anticorps APC lié est pas obligatoire. Au contraire, il peut être remplacé en fonction des microbilles utilisées. Si plusieurs cellules sont colorées à ajuster le volume d&#39;anticorps en conséquence. </li><li> Mélanger doucement par retournement du tube avec les doigts et laisser incuber à 4 ° C dans un réfrigérateur pendant 15 min. Resuspendre les cellules avec PEB tampon de 1-2. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 300 x g. </li><li> Aspirer le surnageant avec une pipette Pasteur stérile en verre et remettre en suspension le culot cellulaire dans 80 ul PASE par 10 7 cellules et ajouter 20 ul de microbilles anti APC. REMARQUE: </strong&gt; Si plusieurs cellules doivent être colorées, régler le volume de micro-billes en conséquence. </li><li> Mélanger doucement par retournement du tube avec les doigts et laisser incuber à 4 ° C dans un réfrigérateur pendant 15 min. Resuspendre les cellules avec PEB tampon de 1-2 + RI. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 300 x g. Aspirer le tampon. Remettre en suspension dans 500 ul PEB tampon + RI. </li></ol> 3. Séparation magnétique de CXCR4 + Cellules <ol><li> Placez une colonne magnétique de taille moyenne dans un champ magnétique selon les instructions du fabricant. Pré-rincer la colonne avec 500 ul PEB tampon + RI. Appliquer la suspension de cellule entière à la colonne. Recueillir l&#39;écoulement à travers les cellules car tous vont se lier à la colonne. Assurez-vous de ne pas perturber les colonnes pour une récupération optimale des cellules CXCR4 +. </li><li> Laver la colonne trois fois avec 500 ul PEB tampon + RI. Recueillir le premier écoulement à travers et les combiner avec les cellules recueillies à l&#39;étape 3.1. Retirer la colonne magnétique du champ magnétique et placez-le dans untube de collecte approprié. Ajouter 1 ml PEB tampon + RI sur la colonne. Pour éluer les cellules appuyez fermement sur le piston dans la colonne. </li><li> Facultatif: Collecter tous les flux à travers des échantillons séparément et utiliser 20 pi chacun pour analyser le nombre de CXCR4 + cellules en utilisant la cytométrie de flux. Leur nombre devrait diminuer à chaque étape de lavage. REMARQUE: Au moins 2 x 10 4 viable, les cellules bloquées doivent être comptés pour obtenir des résultats fiables. </li><li> Répétez les étapes 3.1-3.3 avec le flux collecté à travers l&#39;échantillon de l&#39;étape 3.1 et le premier écoulement à travers l&#39;échantillon de l&#39;étape 3.2 en utilisant une nouvelle colonne. Ne pas réutiliser la colonne précédente. En utilisant l&#39;air de piston est pressée dans la colonne, ce qui le bloque. </li><li> Compter les cellules au microscope en utilisant un hémocytomètre. En fonction de l&#39;efficacité de la différenciation jusqu&#39;à 6 x 10 6 cellules peuvent être triées d&#39; abord et l&#39; autre 1 x 10 6 cellules à l&#39;aide d&#39; une seconde colonne lors de l&#39; utilisation de 10 7 cellules de la procédure. </li&gt; <li> Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min. Aspirer le surnageant et avec un verre pipette Pasteur stérile, et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu d&#39;induction endoderme à l&#39;étape 1.9 avec un inhibiteur supplémentaire de 10 uM de roche. </li><li> Compter les cellules au microscope en utilisant un hémocytomètre. Ensemencer les cellules à une densité appropriée, soit ~ 4 x 10 5 cellules par puits d&#39;une plaque de 12 puits (app. 3,6 cm 2 de surface) ou ~ 1,5 x 10 5 cellules par puits d&#39;une chambre-slide 8 puits. </li></ol> 4. Facultatif: Analyse de Purifié Population Endoderme Definitive <ol><li> Pour immunofluorescence fixer les cellules purifiées de l&#39;étape 3.7 à peu près 24 heures après l&#39;ensemencement avec 4% de paraformaldehyde et tache pendant endoderme définitif (DE) et / ou des protéines marqueurs de pluripotence. NOTE: Généralement utilisé DE marqueurs comprennent FOXA2 et Sox17, les marqueurs de pluripotence couramment utilisés comprennent OCT3 / 4, NANOG et SOX2 6, 8. </li><li> foanalyse r RT-qPCR, récolter les cellules purifiées directement ou 24 heures après l&#39;ensemencement, l&#39;extrait total d&#39;ARN et d&#39;inverser la transcription d&#39;ADNc à partir des échantillons d&#39;ARN totale extraites. En utilisant 10 ng d&#39; ADNc en tant que matrice pour la réaction de RT-PCR quantitative (triplicats) pour analyser l&#39;expression de DE et les gènes marqueurs de la pluripotence 6, 8. NOTE: Les gènes marqueurs couramment utilisés sont mentionnés dans l&#39; étape 4.1. les conditions de cycle sont 5 min à 95 ° C et 40 cycles de 15 s à 95 ° C et 1 min à 60 ° C, puis en faisant fondre l&#39;analyse de la courbe. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

protocoles de différenciation utilisés actuellement aboutissent rarement à 100% de cellules différenciées. Pour des raisons qui restent à aborder certaines cellules résistent au processus de différenciation. En fonction de l&#39;efficacité du protocole de différenciation utilisé et la propension de l&#39;ESC aligner un certain nombre de cellules pluripotentes résiduelles sont couramment observée même après différenciation dans l&#39;endoderme définitif. Ces cellules résiduelles peuvent affecter différenciations en aval ...

Les cellules souches pluripotentes telles que des cellules souches embryonnaires (CSE) ont la capacité de se différencier en pratiquement tout type de corps humain de la cellule. Ainsi, les protocoles de différenciation in vitro peuvent être utilisés pour produire de nombreux types cellulaires adultes , tels que des cardiomyocytes 1, 2, hépatocytes cellules bêta 3, 4 épithéliale pulmonaire ou des cellules neuronales 5. Cela rend CES un outil précieux pour le traitement potentiel de diverses maladies dégénératives 3. La différenciation in vitro des CES vers les tissus adultes du poumon, du foie et du pancréas nécessite une pseudo-gastrulation dans des cellules qui rappellent l&#39;endoderme définitif (DE) 6. Etant donné que la différenciation en aval vers les types de cellules somatiques ci - dessus est nettement moins efficace, une différenciation endoderme optimale est considérée comme limitant la vitesse 7. Les cellules qui se sont engagés envers la lignée endoderme subissent chachangements racteristic dans leur profil d&#39;expression génique. Gènes régulateurs maîtres pluripotent sont régulés à la baisse, tandis que l&#39;expression d&#39;autres facteurs de transcription tels que FOXA2, Sox17, HNF1B, les membres de la famille GATA et le récepteur de surface de CXCR4 est fortement régulée à la hausse 6, 8, 9. CXCR4 est connu pour être transactivé par SMAD2 / 3, en aval de la signalisation Nodal / TGF-β et Sox17 due à des sites de liaison spécifiques dans la région promotrice 10. Il est donc un marqueur très approprié utilisé dans un certain nombre de rapports 6, 8, 11-13. Ces changements d&#39;expression reflète un événement pseudo-gastrulation, dans lequel les CES acquièrent première caractéristiques d&#39;une population de cellules de série comme primitive et engagent ensuite dans la couche de germe de endoderme 6. Cependant, les protocoles de différenciation sont rarement efficaces à 100% en quelques cellules peuvent résister au processus de différenciation ou de se différencier vers d&#39; autres lignées 14 non souhaitées. Ces cellules peuvent Influe négativementnce autre différenciation. En outre, des cellules indifférenciées résiduelles abritent de grands risques pour les expériences de transplantation ultérieures et peuvent donner lieu à des tératomes 15-17. Pour supprimer ces cellules indésirables précoce sur le marqueur CXCR4 de surface peut être utilisé pour la purification de cellules qui se sont engagés vers le DE 18. Ici, nous décrivons une méthode pour la sélection positive des cellules CXCR4 + provenant de Cultures de différenciation. Pour cela, le marqueur de surface de CXCR4 est liée par un anticorps qui se lie à son tour à des microbilles magnétiques. Contrairement aux conditions sévères au cours de tri FACS, les cellules telles que le document DE-magnétiquement marquées peuvent ensuite être facilement purifiées dans un format de paillasse en utilisant un procédé de purification délicat. Ce protocole fournit une méthode simple pour l&#39;élimination des populations de cellules qui a résisté au processus de différenciation DE.

<table><tbody><tr><td>Lignée de cellules souches embryonnaires humaines Hues8</td><td>Harvard Département de cellules souches et de biologie</td><td></td> régénérative <td>Lignée cellulaire appropriée pour la génération d’endoderme</td></tr><tr><td>Lignée de cellules souches embryonnaires humaines Hes3</td><td>ES Cell International</td><td></td><td>Lignée cellulaire appropriée et robuste pour la génération d’endoderme</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td>Milieu de culture ESC</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biowest</td><td>S1860</td><td></td></tr><tr><td>Advanced RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>CD184 (CXCR4)-APC, humain</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-357</td><td></td></tr><tr><td>Microbilles anti-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur OctoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>champ magnétique</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td>inhibiteur de ROCK</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14</td><td></td></tr><tr><td>réactif de dissociation cellulaire douce</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7174</td><td>sans enzyme solution de passage, alternative : Trypsine/EDTA</td></tr><tr><td>Matrigel*</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>matrice de membrane basale * résoudre et stocker dans des aliquotes à -80 &deg ; C comme indiqué dans le manuel du fournisseur. Après utilisation, décongeler sur de la glace, diluer dans 25 ml de DMEM/F-12. Ajouter 1 ml dans chaque puits d’une plaque à 6 puits et incuber pendant 45 min à température ambiante. Retirer le matrigel et l’utiliser immédiatement. </td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>30-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga</td><td>Life Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Human FOXA2 REV tcatgttgctcggaggagta</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human GSC FW gaggagaaagtggaggtgtgtt</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humain GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOX17 TaqMan essai</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs00751752_s1</td><td></td></tr><tr><td>Humain SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humain SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humain POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humain POU5F1 REV ctgcagtgtgtttcgggca</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humain Nanog FW ccgagggcagacatcatcc</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humain Nanog REV ccatccactgccacatcttct</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humain TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t </td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17320</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FOXA2</td><td>MerckMillipore</td><td>07-633</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX17</td><td>R& D Systems</td><td>AF1924</td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode rapide et efficace pour la purification des cellules endoderme généré à partir d&#39;embryons humains cellules souches

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

Les capacités de différenciation des cellules souches pluripotentes telles que des cellules souches embryonnaires (CSE) permettent une application thérapeutique potentielle pour les thérapies de remplacement cellulaire. Terminalement types de cellules différenciées peuvent être utilisés pour le traitement de diverses maladies dégénératives. In vitro la différenciation de ces cellules vers les tissus du poumon, du foie et du pancréas nécessite dans un premier temps la production de cellules endodermiques définitives. Cette étape est limitante pour une différenciation plus poussée vers des types de cellules matures en phase terminale comme les cellules bêta productrices d&#39;insuline, les hépatocytes ou d&#39;autres types de cellules endoderme dérivés. Les cellules qui se sont engagés envers la lignée endoderme expriment fortement une multitude de facteurs de transcription tels que FOXA2, Sox17, HNF1B, membres de la famille GATA, et le récepteur de surface CXCR4. Cependant, les protocoles de différenciation sont rarement efficaces à 100%. Ici, nous décrivons un procédé pour la purification d&#39;une population de cellules CXCR4 + après différenciationdans le DE en utilisant des microbilles magnétiques. Cette purification élimine en outre des cellules de lignées indésirables. Le procédé de purification douce est rapide et fiable et peut être utilisé pour améliorer les applications en aval et différenciations.

lors de la différenciation CES subissent des changements drastiques dans le gène et l&#39; expression de la protéine. La figure 1 illustre les gènes marqueurs typiques qui peuvent être utilisés pour vérifier une différenciation endoderme réussie. Les principales cibles pour une analyse d&#39;expression génique sont CGC, FOXA2 et Sox17. Dans une analyse relative expression du gène particulier FOXA2 et Sox17 s...

Ici, nous décrivons une méthode pour la purification de cellules embryonnaires humaines différenciées souches qui se sont engagés envers l&#39;endoderme définitif pour l&#39;amélioration des applications en aval et d&#39;autres différenciations.

Une méthode rapide et efficace pour la purification des cellules endoderme Généré à partir d&#39;embryons humains Cellules souches

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

L'objectif général de cette méthode est de purifier les cellules endodermiques générées à partir de cellules souches embryonnaires humaines ou cellules ES. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des cellules souches concernant la différenciation endodermique. Le principal avantage de cette technique est qu'une population cellulaire endoderme pure peut être obtenue après l'élimination des cellules non différenciées.Avant de commencer la procédure, recouvrir les plaques de culture cellulaire à six puits avec un millilitre de matrice de membrane basale par puits. Laisser agir pendant au moins 30 minutes à température ambiante. Ensuite, pour récolter les cellules ES humaines, aspirer le milieu d'une culture de cellules souches embryonnaires humaines présentant une confluence de 80 à 90 % à l'aide d'une pipette Pasteur en verre stérile.Et laver les cellules avec deux millilitres de PBS par puits. Agiter la plaque et aspirer la solution saline pour éliminer les cellules mortes et les débris. Ensuite, dissocier délicatement les agrégats cellulaires avec un millilitre de réactif de passage sans enzyme, à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, jusqu’à ce que les cellules présentent des signes évidents de fragmentation en agrégats plus petits.Après environ sept minutes, ajouter un millilitre de milieu DMMF12 dans les puits. Puis, pipeter plusieurs fois vers le haut et vers le bas avec une pointe de pipette de un millilitre afin de détacher les agrégats cellulaires restants en une suspension monocellulaire. À l’aide de la même pipette, transférer les cellules dans un tube de centrifugation et rincer les puits avec un millilitre de milieu DMMF12 frais, en regroupant les rinçages dans le tube.Après avoir centrifugé les cellules, resuspendre le culot dans cinq millilitres de milieu de culture de cellules ES supplémenté en inhibiteur de ROCK. Compter les cellules et ensemencer 1,5 : 4 fois 10 à la puissance 5 cellules par puits dans des plaques recouvertes de matrice de membrane basale, en milieu de culture supplémenté en inhibiteur de ROCK afin de prévenir l'apoptose. Incuber les cellules pendant environ 24 heures.Ensuite, utilisez une pipette de Pasteur stérile en verre pour remplacer le milieu de chaque puits par 2 millilitres de milieu d'induction de la strie primitive. Après 24 heures supplémentaires de culture, remplacez le milieu par du milieu d'induction de l'endoderme pour une incubation de 48 heures avec un changement de milieu quotidien. Le dernier jour de culture et au moins une heure avant la récolte des cellules, ajoutez un nouvel inhibiteur de ROCK au milieu de culture.Ensuite, utilisez une pipette de Pasteur stérile en verre pour aspirer le milieu de chacun des puits et dissocier les cellules à l’aide de la solution réactif sans enzyme, comme vient de l’être démontré. Une fois une suspension monocellulaire obtenue, comptez les cellules et centrifugez-les. Assurez-vous qu’à partir de ce moment, tous les milieux et tampons contiennent l’inhibiteur de ROCK afin d’empêcher la mort cellulaire.Sinon, ils ne s'attacheront pas correctement après retrait. Resuspendre le culot dans 100 microlitres de tampon PEB, supplémenté avec un inhibiteur de ROCK par 1 fois 10 à la puissance 7 cellules. Puis ajouter l'anticorps CXCR4 APC aux cellules.Faites doucement tourner le tube pour mélanger. Après 15 minutes à 4 degrés Celsius, lavez les cellules dans un à deux millilitres de tampon PEB et utilisez une pipette Pasteur en verre stérile pour aspirer le surnageant. Resuspendez le culot dans 80 microlitres de tampon PEB par 1 × 10⁷ cellules et ajoutez 20 microlitres de microbilles anti-APC aux cellules.Mélangez l'échantillon par de légers mouvements de flicking. Incubez ensuite les cellules à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. À la fin de l'incubation, lavez les cellules avec un à deux millilitres de tampon PEB supplémenté en inhibiteur ROCK.Et re-suspendre le culot dans 500 microlitres de tampon PEB frais additionné d'inhibiteur. Pour isoler les cellules CXCR4+ par séparation magnétique, placer une colonne magnétique de taille moyenne sur un aimant de taille appropriée et pré-rincer la colonne avec 500 microlitres de tampon PEB additionné d'inhibiteur de ROCK. Lorsque tout le liquide de lavage a été évacué par le haut de la colonne, appliquer sur la colonne le volume total des cellules marquées par les billes magnétiques, en recueillant l'écoulement dans un tube conique.Lavez la colonne avec trois applications de 500 microlitres de tampon PEB contenant l'inhibiteur ROCK. Ensuite, transférez la colonne depuis l'aimant vers un tube de collecte approprié. Puis faites passer un millilitre de tampon PEB contenant l'inhibiteur ROCK à travers la colonne afin de recueillir les cellules CXCR4+.Éventuellement, tous les échantillons de l'écoulement peuvent être recueillis séparément et des aliquotes de 20 microlitres provenant de chaque échantillon peuvent être utilisées pour déterminer le pourcentage de cellules CXCR4+ dans chaque alouette par cytométrie en flux. Cette procédure peut être répétée avec le premier écoulement afin de recueillir les cellules qui ne se sont pas fixées sur la colonne. Ensuite, regrouper tous les échantillons alloués de cellules CXCR4+ et les centrifuger.Enfin, re-suspendre le culot dans un millilitre de milieu d'induction de l'endoderme supplémenté en inhibiteur de ROCK et ensemencer les cellules à la densité appropriée dans un récipient de culture cellulaire revêtu d'une matrice de membrane basale. Avant leur différenciation, les cellules souches embryonnaires humaines expriment des niveaux élevés du marqueur de pluripotence SOX2. En revanche, le marqueur de l'endoderme définitif, FOXA2, n'est pas détecté.Après la différenciation, les cellules ES subissent des changements importants dans leur expression génique et protéique. En effet, après quatre jours en milieu de différenciation, SOX17 et FOXA2 sont coexprimés de manière uniforme dans les noyaux de nombreuses anciennes cellules ES, ce qui constitue un signe caractéristique de l'engagement vers l'endoderme définitif. Certaines cellules résistent au processus de différenciation et n'expriment aucune des deux protéines marqueurs.Et en effet, conservent leur expression du marqueur de pluripotence SOX2. Dans cette expérience représentative, au troisième jour de différenciation, près de 60 % des cellules souches embryonnaires récoltées exprimaient CXCR4, dont la pureté a été enrichie à plus de 85 % après tri magnétique des cellules pluripotentes et des autres lignées indésirables. Après ensemencement des cellules CXCR4+ purifiées, seules quelques rares cellules SOX2+ sont détectées, la majorité des cellules ensemencées exprimant FOXA2.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de deux heures, si elle est effectuée correctement. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que l'immunohistochimie ou la QPCR peuvent être réalisées pour répondre à des questions supplémentaires concernant le processus de différenciation. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la purification des cellules d'endoderme par tri magnétique à billes.

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