Une méthode rapide et efficace pour la purification des cellules endoderme Généré à partir d'embryons humains Cellules souches

L’objectif global de cette méthode est de purifier les cellules endodermiques générées à partir de cellules souches embryonnaires humaines ou de cellules ES. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des cellules souches sur la différenciation endodermique. Le principal avantage de cette technique est qu’une population de cellules endodermiques pures peut être obtenue après l’élimination des cellules indifférenciées.

Avant de commencer la procédure, enduire six plaques de culture cellulaire d’un millilitre de matrice de membrane basale par puits. Pendant au moins 30 minutes à température ambiante. Ensuite, pour récolter les cellules ES humaines, aspirez le milieu d’une culture de cellules souches embryonnaires humaines confluentes à 80 à 90 % avec une pipette en verre stérile Pasture.

Et lavez les cellules avec deux millilitres de PBS par puits. Secouez la plaque et aspirez la solution saline pour éliminer les cellules mortes et les débris. Ensuite, dissociez doucement les amas de cellules avec un millilitre de réactif de solution de passage sans enzyme, à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce que les cellules présentent des signes clairs de perturbation en amas plus petits.

Après environ sept minutes, ajoutez un millilitre de milieu DMMF12 dans les puits. Et pipetez de haut en bas plusieurs fois avec une pointe de pipette d’un millilitre pour détacher les agrégats cellulaires restants en une suspension unicellulaire. À l’aide de la même pipette, transférez les cellules dans un tube de centrifugation et rincez les puits avec un millilitre de milieu DMMF12 frais, en regroupant les lavages dans le tube.

Après avoir fait tourner les cellules, remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de milieu de culture cellulaire ES complété par un inhibiteur de ROCK. Comptez les cellules et les graines 1,5:4 fois 10 à la cinquième cellules par puits sur la matrice de la membrane basale en plaques recouvertes d’un milieu de culture complété par un inhibiteur de ROCK pour prévenir l’apoptose. Incuber les cellules pendant environ 24 heures.

Ensuite, utilisez une pipette Pasteur en verre stérile pour remplacer le milieu dans chaque puits par 2 millilitres de milieu d’induction à traînées primitives. Après 24 heures de culture supplémentaires, remplacez le milieu par un milieu d’induction endodermique pour une incubation de 48 heures avec des changements quotidiens de milieu. Le dernier jour de la culture et au moins une heure avant la récolte des cellules, ajoutez l’inhibiteur de ROCK frais au milieu de culture.

Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur en verre stérile, aspirez le milieu de chacun des puits et dissociez les cellules avec un réactif de solution de passage sans enzyme, comme nous venons de le démontrer. Lorsqu’une suspension unicellulaire a été obtenue, comptez les cellules et centrifugez-les. Assurez-vous qu’à partir de ce moment, tous les milieux et tampons contiennent l’inhibiteur de ROCK pour empêcher les cellules de mourir.

Sinon, ils ne seront pas correctement attachés après le retrait. Remettez la pastille en suspension dans 100 microlitres de tampon PEB, complété par un inhibiteur de ROCK tous les 1 fois 10 à la septième cellule. Ajoutez ensuite l’anticorps CXCR4 APC aux cellules.

En remuant doucement le tube pour mélanger. Après 15 minutes à 4 degrés Celsius, lavez les cellules dans un à deux millilitres de tampon PEB et utilisez une pipette Pasteur en verre stérile pour aspirer le surnageant. Remettez la pastille en suspension dans 80 microlitres de tampon PEB par 1 fois 10 à la septième cellule et ajoutez 20 microlitres de microbilles anti-APC aux cellules.

Mélangez l’échantillon en effleurant doucement. Ensuite, incubez les cellules à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. À la fin de l’incubation, lavez les cellules avec un à deux millilitres de tampon PEB complété par un inhibiteur de ROCK.

Et remettez le granulé en suspension dans 500 microlitres de tampon PEB frais plus inhibiteur. Pour isoler les cellules CXCR4+ par séparation magnétique des billes, chargez une colonne magnétique de taille moyenne sur un aimant de taille appropriée et pré-rincez la colonne avec un tampon PEB de 500 microlitres plus un inhibiteur de ROCK. Lorsque tout le lavage s’est écoulé du haut de la colonne, appliquez tout le volume de la cellule étiquetée à billes magnétiques sur la colonne, en recueillant le flux dans un tube conique.

Lavez la colonne avec trois applications de 500 microlitres de tampon PEB plus inhibiteur de ROCK. Transférez ensuite la colonne de l’aimant dans un tube de collecte approprié. Et plongez un millilitre de tampon PEB plus inhibiteur ROCK dans la colonne pour collecter les cellules CXCR4+.

En option, tous les échantillons en flux continu peuvent être collectés séparément et des aliquotes de 20 microlitres de chaque échantillon peuvent être utilisées pour déterminer le pourcentage de cellules CXCR4+ dans chaque alouette par cytométrie en flux. Cette procédure peut être répétée lors du premier passage pour collecter les cellules qui ne se sont pas liées à la colonne. Ensuite, regroupez les deux échantillons CXCR4+ et centrifugez-les.

Enfin, remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu d’induction de l’endoderme complété par un inhibiteur de ROCK et ensemencez les cellules à la densité appropriée dans un récipient de culture cellulaire recouvert d’une matrice de membrane basale. Avant leur différenciation, les cellules ES humaines expriment des niveaux élevés du marqueur de pluripotence SOX2. Alors que le marqueur endodermique définitif, FOXA2, n’est pas détecté.

Lors de la différenciation, les cellules ES subissent des changements drastiques dans l’expression de leurs gènes et protéines. En effet, après quatre jours dans un milieu de différenciation, SOX17 et FOXA2 sont co-exprimés uniformément dans les noyaux de nombreuses anciennes cellules ES, une marque d’engagement définitif de l’endoderme. Certaines cellules résistent au processus de différenciation, n’exprimant aucune des deux protéines marqueurs.

Et en fait, ils conservent leur expression de marqueur de pluripotence SOX2. Dans cette expérience représentative, au troisième jour de la différenciation, près de 60 % des cellules ES récoltées exprimaient CXCR4, dont la pureté a été enrichie à plus de 85 % après tri magnétique des cellules pluripotentes et d’autres cellules de lignée indésirables. Après l’ensemencement des cellules CXCR4+ purifiées, seules quelques cellules SOX2+ sont détectées, la majorité des cellules ensemencées exprimant FOXA2.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en deux heures, si elle est correctement exécutée. À la suite de cette procédure, d’autres comme l’histochimie immunitaire ou la QPCR peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur le processus de différenciation. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de purifier les cellules de l’endoderme par tri par billes magnétiques.