Name: Une méthode rapide et efficace pour la purification des cellules endoderme Généré à partir dembryons humains Cellules souches (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Découvrez une méthode de purification des cellules endoderme dérivées de cellules souches embryonnaires humaines par séparation magnétique. Cette technique permet d'obtenir des populations cellulaires pures pour la recherche en biologie du développement.

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L&#39;assistance technique habile de Jasmin Kresse est grandement appréciée.

1. Différenciation des ESC humain vers le Endoderme Definitive <ol><li> Cultiver des cellules souches embryonnaires humaines (CES) dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Enduire un nouveau 6 puits plaque de culture cellulaire avec 1 ml d&#39;une matrice de membrane basale et incuber la culture-ware pendant au moins 30 min à température ambiante. Pour plus de détails s&#39;il vous plaît tourner vers les instructions du fabricant respectif. </li><li> Vérifiez que les CES de l&#39; homme de culture ont atteint 80% -90% de confluence sous le microscope à l&#39; aide d&#39; un faible grossissement (par exemple, 4X). Aspirer le milieu des cavités par aspiration du milieu avec une pipette Pasteur stérile en verre. Laver les cellules une fois avec une solution saline (PBS), une solution de phosphate tamponnée. Pour cela, ajoutez 2 ml de PBS à chaque puits doucement agiter la plaque et aspirer la solution pour éliminer les cellules mortes et les débris cellulaires. </li><li> Ajouter 1 ml de réactif de solution de repiquage sans enzyme pour la dissociation douce des amas de cellules. Incuber les cellules à 37 ° C, und 5% de CO 2 jusqu&#39;à ce que les cellules présentent des signes évidents de perturbation en petites grappes. NOTE: Le temps d&#39;incubation dépend du réactif utilisé. Pour la solution de passages sans enzyme mentionnée dans la section des matériaux, la durée d&#39;incubation est d&#39;environ 7 min. </li><li> Ajouter 1 ml de DMEM / F-12 et de perturber les agrégats de cellules restantes dans des cellules individuelles par pipetage de haut en bas à l&#39;aide d&#39;une pipette de 1 ml. Utiliser cette fonction pour rincer les cellules de la surface et de transférer les cellules dans un tube de centrifugation. Pour récupérer toutes les cellules, laver chaque puits avec 1 ml de DMEM / F-12 et ajouter le support au tube de centrifugation. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 5 min à 300 x g. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 5 ml ES milieu de culture cellulaire contenant 10 pM de la Rho-kinase (Roche) inhibiteur. </li><li> Compter les cellules au microscope en utilisant un hémocytomètre et épépiner 150.000 - 400.000 cellules par 6 puits ou dans une autre disposition de la plaque, en fonction de la lignée cellulaire ES utilisée. Utilisez culture du milieu contenant l&#39; inhibiteur de ROCK 10 um pour éviter l&#39; apoptose et la culture des cellules dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Environ 24 heures après l&#39;ensemencement Aspirer le milieu avec une pipette Pasteur en verre stérile et ajouter 2 ml de primitive moyenne série d&#39;induction. Remarque: Ce milieu contient des concentrations finales de 1% de glutamine, 0,2% de FCS, 5 uM CHIR-99021 et 50 ng / ml d&#39; activine A à l&#39; avance du milieu RPMI-1640. Généralement, utiliser 2 ml de milieu de culture dans des plaques 6 puits. </li><li> 48 heures après l&#39;ensemencement, remplacer le milieu de l&#39;endoderme milieu d&#39;induction. Cultiver les cellules dans ce milieu pendant encore 48 heures avec changement de milieu par jour. Remarque: Ce milieu contient 1% de glutamine, 0,2% de FCS et 50 ng / ml d&#39; activine A dans Advanced milieu RPMI-1640. Les cellules qui se sont engagés envers l&#39;endoderme définitif expriment le marqueur de surface CXCR4. La coloration de CXCR4 peut être utilisé pour quantifier le nombre de cellules DE-commis. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Coloration de CXCR4 + endoderme définitif cellules d&#39;analyse de cytométrie en flux <ol><li> Pour la dernière 24 heures, mais au moins 1 heure avant la récolte des cellules, ajouter un inhibiteur de ROCK 10 uM au milieu de culture. </li><li> Enduire la culture cellulaire-ware qui sera utilisé pour re-semis avec une matrice de membrane basale, à savoir, des plaques à 12 puits pour qPCR analyse ou chambre diapositives pour immunofluorescence. Incuber les plaques ou lames pendant au moins 30 min à température ambiante. </li><li> Aspirer le milieu avec une pipette Pasteur en verre stérile, à partir des puits des cellules différenciées utilisées pour la coloration et / ou de tri. </li><li> Ajouter 1 ml de réactif de la solution de passages sans enzyme pour la dissociation douce des amas de cellules. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO2 jusqu&#39;à ce que les cellules présentent des signes évidents de perturbation en petites grappes. NOTE: Le temps d&#39;incubation dépend du réactif utilisé. Pour la solution de passages sans enzyme mentionnée dans la materisection als, le temps d&#39;incubation est d&#39;environ 7 min. </li><li> Ajouter 1 ml de DMEM / F-12 et de perturber restant agrégats de cellules dans des cellules individuelles par pipetage de haut en bas à l&#39;aide d&#39;une pointe de 1 ml. Utiliser cette fonction pour rincer les cellules de la surface et de transférer les cellules dans un tube de centrifugation. Pour récupérer toutes les cellules, laver chaque puits avec 1 ml de DMEM / F-12 w / o FCS et ajouter le support au tube de centrifugation. </li><li> Compter les cellules au microscope en utilisant un hémocytomètre. Les cellules provenant de trois puits d&#39;une plaque à 6 puits devraient aboutir à 10-15 x 10 6 cellules après trois jours de différenciation. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 300 x g. NOTE: Le nombre exact de cellules obtenues dépendra de la lignée cellulaire pluripotente utilisée pour la différenciation. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un tampon PEB contenant un inhibiteur de ROCK 10 uM. Utiliser 100 pl de ce tampon pour 10 7 cellules. Ajouter l&#39;inhibiteur de ROCK 10 uM au jour de staining. Utilisez ce tampon pour toutes les applications en aval (appelés PEB tampon + RI). REMARQUE: tampon PEB contient 0,5% de BSA et 2 mM EDTA dans du PBS. Si plusieurs cellules doivent être colorées, régler le volume de la mémoire tampon en conséquence. </li><li> Ajouter 10 ul d&#39;un anticorps CXCR4 APC pour 10 7 cellules dans 100 ul, ce qui représente à peu près une dilution de 1:10. NOTE: L&#39;utilisation d&#39;un anticorps APC lié est pas obligatoire. Au contraire, il peut être remplacé en fonction des microbilles utilisées. Si plusieurs cellules sont colorées à ajuster le volume d&#39;anticorps en conséquence. </li><li> Mélanger doucement par retournement du tube avec les doigts et laisser incuber à 4 ° C dans un réfrigérateur pendant 15 min. Resuspendre les cellules avec PEB tampon de 1-2. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 300 x g. </li><li> Aspirer le surnageant avec une pipette Pasteur stérile en verre et remettre en suspension le culot cellulaire dans 80 ul PASE par 10 7 cellules et ajouter 20 ul de microbilles anti APC. REMARQUE: </strong&gt; Si plusieurs cellules doivent être colorées, régler le volume de micro-billes en conséquence. </li><li> Mélanger doucement par retournement du tube avec les doigts et laisser incuber à 4 ° C dans un réfrigérateur pendant 15 min. Resuspendre les cellules avec PEB tampon de 1-2 + RI. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 300 x g. Aspirer le tampon. Remettre en suspension dans 500 ul PEB tampon + RI. </li></ol> 3. Séparation magnétique de CXCR4 + Cellules <ol><li> Placez une colonne magnétique de taille moyenne dans un champ magnétique selon les instructions du fabricant. Pré-rincer la colonne avec 500 ul PEB tampon + RI. Appliquer la suspension de cellule entière à la colonne. Recueillir l&#39;écoulement à travers les cellules car tous vont se lier à la colonne. Assurez-vous de ne pas perturber les colonnes pour une récupération optimale des cellules CXCR4 +. </li><li> Laver la colonne trois fois avec 500 ul PEB tampon + RI. Recueillir le premier écoulement à travers et les combiner avec les cellules recueillies à l&#39;étape 3.1. Retirer la colonne magnétique du champ magnétique et placez-le dans untube de collecte approprié. Ajouter 1 ml PEB tampon + RI sur la colonne. Pour éluer les cellules appuyez fermement sur le piston dans la colonne. </li><li> Facultatif: Collecter tous les flux à travers des échantillons séparément et utiliser 20 pi chacun pour analyser le nombre de CXCR4 + cellules en utilisant la cytométrie de flux. Leur nombre devrait diminuer à chaque étape de lavage. REMARQUE: Au moins 2 x 10 4 viable, les cellules bloquées doivent être comptés pour obtenir des résultats fiables. </li><li> Répétez les étapes 3.1-3.3 avec le flux collecté à travers l&#39;échantillon de l&#39;étape 3.1 et le premier écoulement à travers l&#39;échantillon de l&#39;étape 3.2 en utilisant une nouvelle colonne. Ne pas réutiliser la colonne précédente. En utilisant l&#39;air de piston est pressée dans la colonne, ce qui le bloque. </li><li> Compter les cellules au microscope en utilisant un hémocytomètre. En fonction de l&#39;efficacité de la différenciation jusqu&#39;à 6 x 10 6 cellules peuvent être triées d&#39; abord et l&#39; autre 1 x 10 6 cellules à l&#39;aide d&#39; une seconde colonne lors de l&#39; utilisation de 10 7 cellules de la procédure. </li&gt; <li> Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min. Aspirer le surnageant et avec un verre pipette Pasteur stérile, et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu d&#39;induction endoderme à l&#39;étape 1.9 avec un inhibiteur supplémentaire de 10 uM de roche. </li><li> Compter les cellules au microscope en utilisant un hémocytomètre. Ensemencer les cellules à une densité appropriée, soit ~ 4 x 10 5 cellules par puits d&#39;une plaque de 12 puits (app. 3,6 cm 2 de surface) ou ~ 1,5 x 10 5 cellules par puits d&#39;une chambre-slide 8 puits. </li></ol> 4. Facultatif: Analyse de Purifié Population Endoderme Definitive <ol><li> Pour immunofluorescence fixer les cellules purifiées de l&#39;étape 3.7 à peu près 24 heures après l&#39;ensemencement avec 4% de paraformaldehyde et tache pendant endoderme définitif (DE) et / ou des protéines marqueurs de pluripotence. NOTE: Généralement utilisé DE marqueurs comprennent FOXA2 et Sox17, les marqueurs de pluripotence couramment utilisés comprennent OCT3 / 4, NANOG et SOX2 6, 8. </li><li> foanalyse r RT-qPCR, récolter les cellules purifiées directement ou 24 heures après l&#39;ensemencement, l&#39;extrait total d&#39;ARN et d&#39;inverser la transcription d&#39;ADNc à partir des échantillons d&#39;ARN totale extraites. En utilisant 10 ng d&#39; ADNc en tant que matrice pour la réaction de RT-PCR quantitative (triplicats) pour analyser l&#39;expression de DE et les gènes marqueurs de la pluripotence 6, 8. NOTE: Les gènes marqueurs couramment utilisés sont mentionnés dans l&#39; étape 4.1. les conditions de cycle sont 5 min à 95 ° C et 40 cycles de 15 s à 95 ° C et 1 min à 60 ° C, puis en faisant fondre l&#39;analyse de la courbe. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

protocoles de différenciation utilisés actuellement aboutissent rarement à 100% de cellules différenciées. Pour des raisons qui restent à aborder certaines cellules résistent au processus de différenciation. En fonction de l&#39;efficacité du protocole de différenciation utilisé et la propension de l&#39;ESC aligner un certain nombre de cellules pluripotentes résiduelles sont couramment observée même après différenciation dans l&#39;endoderme définitif. Ces cellules résiduelles peuvent affecter différenciations en aval ...

Les cellules souches pluripotentes telles que des cellules souches embryonnaires (CSE) ont la capacité de se différencier en pratiquement tout type de corps humain de la cellule. Ainsi, les protocoles de différenciation in vitro peuvent être utilisés pour produire de nombreux types cellulaires adultes , tels que des cardiomyocytes 1, 2, hépatocytes cellules bêta 3, 4 épithéliale pulmonaire ou des cellules neuronales 5. Cela rend CES un outil précieux pour le traitement potentiel de diverses maladies dégénératives 3. La différenciation in vitro des CES vers les tissus adultes du poumon, du foie et du pancréas nécessite une pseudo-gastrulation dans des cellules qui rappellent l&#39;endoderme définitif (DE) 6. Etant donné que la différenciation en aval vers les types de cellules somatiques ci - dessus est nettement moins efficace, une différenciation endoderme optimale est considérée comme limitant la vitesse 7. Les cellules qui se sont engagés envers la lignée endoderme subissent chachangements racteristic dans leur profil d&#39;expression génique. Gènes régulateurs maîtres pluripotent sont régulés à la baisse, tandis que l&#39;expression d&#39;autres facteurs de transcription tels que FOXA2, Sox17, HNF1B, les membres de la famille GATA et le récepteur de surface de CXCR4 est fortement régulée à la hausse 6, 8, 9. CXCR4 est connu pour être transactivé par SMAD2 / 3, en aval de la signalisation Nodal / TGF-β et Sox17 due à des sites de liaison spécifiques dans la région promotrice 10. Il est donc un marqueur très approprié utilisé dans un certain nombre de rapports 6, 8, 11-13. Ces changements d&#39;expression reflète un événement pseudo-gastrulation, dans lequel les CES acquièrent première caractéristiques d&#39;une population de cellules de série comme primitive et engagent ensuite dans la couche de germe de endoderme 6. Cependant, les protocoles de différenciation sont rarement efficaces à 100% en quelques cellules peuvent résister au processus de différenciation ou de se différencier vers d&#39; autres lignées 14 non souhaitées. Ces cellules peuvent Influe négativementnce autre différenciation. En outre, des cellules indifférenciées résiduelles abritent de grands risques pour les expériences de transplantation ultérieures et peuvent donner lieu à des tératomes 15-17. Pour supprimer ces cellules indésirables précoce sur le marqueur CXCR4 de surface peut être utilisé pour la purification de cellules qui se sont engagés vers le DE 18. Ici, nous décrivons une méthode pour la sélection positive des cellules CXCR4 + provenant de Cultures de différenciation. Pour cela, le marqueur de surface de CXCR4 est liée par un anticorps qui se lie à son tour à des microbilles magnétiques. Contrairement aux conditions sévères au cours de tri FACS, les cellules telles que le document DE-magnétiquement marquées peuvent ensuite être facilement purifiées dans un format de paillasse en utilisant un procédé de purification délicat. Ce protocole fournit une méthode simple pour l&#39;élimination des populations de cellules qui a résisté au processus de différenciation DE.

<table><tbody><tr><td>Lignée de cellules souches embryonnaires humaines Hues8</td><td>Harvard Département de cellules souches et de biologie</td><td></td> régénérative <td>Lignée cellulaire appropriée pour la génération d’endoderme</td></tr><tr><td>Lignée de cellules souches embryonnaires humaines Hes3</td><td>ES Cell International</td><td></td><td>Lignée cellulaire appropriée et robuste pour la génération d’endoderme</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td>Milieu de culture ESC</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biowest</td><td>S1860</td><td></td></tr><tr><td>Advanced RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>CD184 (CXCR4)-APC, humain</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-357</td><td></td></tr><tr><td>Microbilles anti-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur OctoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>champ magnétique</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td>inhibiteur de ROCK</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14</td><td></td></tr><tr><td>réactif de dissociation cellulaire douce</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7174</td><td>sans enzyme solution de passage, alternative : Trypsine/EDTA</td></tr><tr><td>Matrigel*</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>matrice de membrane basale * résoudre et stocker dans des aliquotes à -80 &deg ; C comme indiqué dans le manuel du fournisseur. Après utilisation, décongeler sur de la glace, diluer dans 25 ml de DMEM/F-12. Ajouter 1 ml dans chaque puits d’une plaque à 6 puits et incuber pendant 45 min à température ambiante. Retirer le matrigel et l’utiliser immédiatement. </td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>30-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga</td><td>Life Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Human FOXA2 REV tcatgttgctcggaggagta</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human GSC FW gaggagaaagtggaggtgtgtt</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humain GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOX17 TaqMan essai</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs00751752_s1</td><td></td></tr><tr><td>Humain SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humain SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humain POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humain POU5F1 REV ctgcagtgtgtttcgggca</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humain Nanog FW ccgagggcagacatcatcc</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humain Nanog REV ccatccactgccacatcttct</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humain TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t </td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17320</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FOXA2</td><td>MerckMillipore</td><td>07-633</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX17</td><td>R& D Systems</td><td>AF1924</td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode rapide et efficace pour la purification des cellules endoderme généré à partir d&#39;embryons humains cellules souches

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

Les capacités de différenciation des cellules souches pluripotentes telles que des cellules souches embryonnaires (CSE) permettent une application thérapeutique potentielle pour les thérapies de remplacement cellulaire. Terminalement types de cellules différenciées peuvent être utilisés pour le traitement de diverses maladies dégénératives. In vitro la différenciation de ces cellules vers les tissus du poumon, du foie et du pancréas nécessite dans un premier temps la production de cellules endodermiques définitives. Cette étape est limitante pour une différenciation plus poussée vers des types de cellules matures en phase terminale comme les cellules bêta productrices d&#39;insuline, les hépatocytes ou d&#39;autres types de cellules endoderme dérivés. Les cellules qui se sont engagés envers la lignée endoderme expriment fortement une multitude de facteurs de transcription tels que FOXA2, Sox17, HNF1B, membres de la famille GATA, et le récepteur de surface CXCR4. Cependant, les protocoles de différenciation sont rarement efficaces à 100%. Ici, nous décrivons un procédé pour la purification d&#39;une population de cellules CXCR4 + après différenciationdans le DE en utilisant des microbilles magnétiques. Cette purification élimine en outre des cellules de lignées indésirables. Le procédé de purification douce est rapide et fiable et peut être utilisé pour améliorer les applications en aval et différenciations.

lors de la différenciation CES subissent des changements drastiques dans le gène et l&#39; expression de la protéine. La figure 1 illustre les gènes marqueurs typiques qui peuvent être utilisés pour vérifier une différenciation endoderme réussie. Les principales cibles pour une analyse d&#39;expression génique sont CGC, FOXA2 et Sox17. Dans une analyse relative expression du gène particulier FOXA2 et Sox17 s...

Ici, nous décrivons une méthode pour la purification de cellules embryonnaires humaines différenciées souches qui se sont engagés envers l&#39;endoderme définitif pour l&#39;amélioration des applications en aval et d&#39;autres différenciations.

Une méthode rapide et efficace pour la purification des cellules endoderme Généré à partir d&#39;embryons humains Cellules souches

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

L'objectif général de cette méthode est de purifier les cellules endodermiques générées à partir de cellules souches embryonnaires humaines ou cellules ES. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des cellules souches concernant la différenciation endodermique. Le principal avantage de cette technique est qu'une population cellulaire endoderme pure peut être obtenue après l'élimination des cellules non différenciées.Avant de commencer la procédure, recouvrir les plaques de culture cellulaire à six puits avec un millilitre de matrice de membrane basale par puits. Laisser agir pendant au moins 30 minutes à température ambiante. Ensuite, pour récolter les cellules ES humaines, aspirer le milieu d'une culture de cellules souches embryonnaires humaines présentant une confluence de 80 à 90 % à l'aide d'une pipette Pasteur en verre stérile.Et laver les cellules avec deux millilitres de PBS par puits. Agiter la plaque et aspirer la solution saline pour éliminer les cellules mortes et les débris. Ensuite, dissocier délicatement les agrégats cellulaires avec un millilitre de réactif de passage sans enzyme, à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, jusq

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La capacité des cellules souches embryonnaires humaines à se renouveler et se différencier en tous les types cellulaires du corps donne à penser qu'ils sont très prometteurs pour les applications médicales et comme un outil de recherche pour aborder les questions fondamentales dans le développement et la maladie. Ici, nous fournissons un résumé concis, étape par étape de protocole pour la dérivation de cellules souches embryonnaires humaines à partir d'embryons par l'isolement immunosurgical de...

Dérivation des cellules souches embryonnaires humaines par Immunosurgery

Cet article se concentrera sur la génération de l'endoderme hépatiques humaines embryonnaires humaines à partir des populations de cellules souches.

Génération robuste des hépatocytes comme des cellules embryonnaires humaines à partir populations de cellules souches

Malgré les efforts en cours pour les cultures de transition vers d'alimentation sans conditions, la dérivation et la culture de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) restent largement tributaires des co-cultures avec mangeoires embryonnaires de souris (MEF). Ici, nous montrons une nouvelle méthodologie pour éliminer rapidement départs à partir de cultures de CSEh avant l'expérimentation.

Suppression des fibroblastes rapide de haute densité embryonnaires humaines cultures de cellules souches

Nous décrivons l’utilisation des anticorps monoclonaux TG30 (CD9) et GCTM-2 pour la détection combinée des antigènes de surface cellulaire par l’intermédiaire du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour l’identification et l’enrichissement des cellules souches embryonnaires humaines vivantes (hESC) utilisant la sélection positive et également l’utilisation de la sélection négative pour purger hESCs d’une population mélangée de cellules.

Enrichissement et purge de cellules souches embryonnaires humaines par détection d’antigènes de surface cellulaire à l’aide des anticorps monoclonaux TG30 et GCTM-2

Ce protocole dirige efficacement la souris souches embryonnaires endoderme définitif dérivé des cellules matures voies respiratoires cellules épithéliales. Cette technique de différenciation utilise trois dimensions échafauds pulmonaires décellularisé pour diriger la spécification de la lignée de poumon, dans un environnement de culture exempt de sérum défini.

Génération de cellules de souris Airway épithéliales ESC dérivés Utilisation décellularisé Lung échafauds

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) ont la capacité intrinsèque de différencier et d'auto-organisation dans des modèles de tissus distincts; bien que cela nécessite la présentation des gradients environnementaux spatiales. Nous présentons stencil micromodelage comme une méthode simple et robuste pour générer des gradients biochimiques et mécaniques pour le contrôle des motifs de différenciation HPSC.

Stencil micromodelage des pluripotentes humaines Cellules souches pour Probing Organisation spatiale des Différenciation Fates

Présenté ici est un protocole pour la génération d'une culture unicellulaire des cellules souches embryonnaires humaines et leur différenciation ultérieure en cellules progénitrices neurales. Le protocole est simple, robuste, évolutif et adapté aux applications de dépistage des médicaments et de médecine régénérative.

Différenciation neuronale efficace à l'aide de la culture monocellulaire des cellules souches embryonnaires humaines

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour la différenciation des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) en cellules fonctionnelles de type hépatocytes (CHN) en complétant continuellement l’activine A et le CHIR99021 pendant la différenciation du CSEh en endoderme définitif (DE).

Une méthode efficace pour l’induction de cellules dirigées de type hépatocytes à partir de cellules souches embryonnaires humaines

Afin d’éviter les limitations associées au passage enzymatique ou mécanique des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et des cellules souches pluripotentes induites humaines (CSPhi) cultivées sur des cellules nourricières, nous avons mis au point une méthode rapide, efficace, rentable et à haut rendement pour la récolte de colonies de CSEh ou de CSPhi, maintenues sur une couche de cellules nourricières de fibroblastes de prépuce humain en utilisant la désadhésion médiée par l’EDTA.

Passage rapide, rentable et sans enzyme de cellules souches pluripotentes humaines sur des cellules nourricières par désadhérence médiée par l’acide éthylènediaminetétraacétique

Le présent protocole montre comment différencier les cellules CD3−/CD45+CD56+ présentant une cytotoxicité légère des cellules souches à potentiel élargi humain (CSEPH) dans des conditions de culture 3D et 2D. Cela permet une validation phénotypique de routine sans la destruction du microenvironnement complexe.

Production de cellules tueuses naturelles à partir de cellules souches humaines à potentiel élargi

Ce protocole décrit la génération d’organoïdes hépatiques endodermiques rapides et reproductibles (eHEPO). Avec ce protocole, les eHEPO peuvent être produits en 2 semaines et se développer à long terme (plus d’un an) sans perdre leur différenciation et leur fonctionnalité.

Génération d’organoïdes hépatiques endodermiques fonctionnels

Découvrez une méthode de purification des cellules endoderme dérivées de cellules souches embryonnaires humaines par séparation magnétique. Cette technique permet d'obtenir des populations cellulaires pures pour la recherche en biologie du développement.

Une méthode rapide et efficace pour la purification des cellules endoderme Généré à partir d'embryons humains Cellules souches

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