Une méthode rapide et efficace pour la purification des cellules endoderme Généré à partir d'embryons humains Cellules souches

L'objectif général de cette méthode est de purifier les cellules endodermiques générées à partir de cellules souches embryonnaires humaines ou cellules ES. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des cellules souches concernant la différenciation endodermique. Le principal avantage de cette technique est qu'une population cellulaire endoderme pure peut être obtenue après l'élimination des cellules non différenciées.

Avant de commencer la procédure, recouvrir les plaques de culture cellulaire à six puits avec un millilitre de matrice de membrane basale par puits. Laisser agir pendant au moins 30 minutes à température ambiante. Ensuite, pour récolter les cellules ES humaines, aspirer le milieu d'une culture de cellules souches embryonnaires humaines présentant une confluence de 80 à 90 % à l'aide d'une pipette Pasteur en verre stérile.

Et laver les cellules avec deux millilitres de PBS par puits. Agiter la plaque et aspirer la solution saline pour éliminer les cellules mortes et les débris. Ensuite, dissocier délicatement les agrégats cellulaires avec un millilitre de réactif de passage sans enzyme, à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, jusqu’à ce que les cellules présentent des signes évidents de fragmentation en agrégats plus petits.

Après environ sept minutes, ajouter un millilitre de milieu DMMF12 dans les puits. Puis, pipeter plusieurs fois vers le haut et vers le bas avec une pointe de pipette de un millilitre afin de détacher les agrégats cellulaires restants en une suspension monocellulaire. À l’aide de la même pipette, transférer les cellules dans un tube de centrifugation et rincer les puits avec un millilitre de milieu DMMF12 frais, en regroupant les rinçages dans le tube.

Après avoir centrifugé les cellules, resuspendre le culot dans cinq millilitres de milieu de culture de cellules ES supplémenté en inhibiteur de ROCK. Compter les cellules et ensemencer 1,5 : 4 fois 10 à la puissance 5 cellules par puits dans des plaques recouvertes de matrice de membrane basale, en milieu de culture supplémenté en inhibiteur de ROCK afin de prévenir l'apoptose. Incuber les cellules pendant environ 24 heures.

Ensuite, utilisez une pipette de Pasteur stérile en verre pour remplacer le milieu de chaque puits par 2 millilitres de milieu d'induction de la strie primitive. Après 24 heures supplémentaires de culture, remplacez le milieu par du milieu d'induction de l'endoderme pour une incubation de 48 heures avec un changement de milieu quotidien. Le dernier jour de culture et au moins une heure avant la récolte des cellules, ajoutez un nouvel inhibiteur de ROCK au milieu de culture.

Ensuite, utilisez une pipette de Pasteur stérile en verre pour aspirer le milieu de chacun des puits et dissocier les cellules à l’aide de la solution réactif sans enzyme, comme vient de l’être démontré. Une fois une suspension monocellulaire obtenue, comptez les cellules et centrifugez-les. Assurez-vous qu’à partir de ce moment, tous les milieux et tampons contiennent l’inhibiteur de ROCK afin d’empêcher la mort cellulaire.

Sinon, ils ne s'attacheront pas correctement après retrait. Resuspendre le culot dans 100 microlitres de tampon PEB, supplémenté avec un inhibiteur de ROCK par 1 fois 10 à la puissance 7 cellules. Puis ajouter l'anticorps CXCR4 APC aux cellules.

Faites doucement tourner le tube pour mélanger. Après 15 minutes à 4 degrés Celsius, lavez les cellules dans un à deux millilitres de tampon PEB et utilisez une pipette Pasteur en verre stérile pour aspirer le surnageant. Resuspendez le culot dans 80 microlitres de tampon PEB par 1 × 10⁷ cellules et ajoutez 20 microlitres de microbilles anti-APC aux cellules.

Mélangez l'échantillon par de légers mouvements de flicking. Incubez ensuite les cellules à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. À la fin de l'incubation, lavez les cellules avec un à deux millilitres de tampon PEB supplémenté en inhibiteur ROCK.

Et re-suspendre le culot dans 500 microlitres de tampon PEB frais additionné d'inhibiteur. Pour isoler les cellules CXCR4+ par séparation magnétique, placer une colonne magnétique de taille moyenne sur un aimant de taille appropriée et pré-rincer la colonne avec 500 microlitres de tampon PEB additionné d'inhibiteur de ROCK. Lorsque tout le liquide de lavage a été évacué par le haut de la colonne, appliquer sur la colonne le volume total des cellules marquées par les billes magnétiques, en recueillant l'écoulement dans un tube conique.

Lavez la colonne avec trois applications de 500 microlitres de tampon PEB contenant l'inhibiteur ROCK. Ensuite, transférez la colonne depuis l'aimant vers un tube de collecte approprié. Puis faites passer un millilitre de tampon PEB contenant l'inhibiteur ROCK à travers la colonne afin de recueillir les cellules CXCR4+.

Éventuellement, tous les échantillons de l'écoulement peuvent être recueillis séparément et des aliquotes de 20 microlitres provenant de chaque échantillon peuvent être utilisées pour déterminer le pourcentage de cellules CXCR4+ dans chaque alouette par cytométrie en flux. Cette procédure peut être répétée avec le premier écoulement afin de recueillir les cellules qui ne se sont pas fixées sur la colonne. Ensuite, regrouper tous les échantillons alloués de cellules CXCR4+ et les centrifuger.

Enfin, re-suspendre le culot dans un millilitre de milieu d'induction de l'endoderme supplémenté en inhibiteur de ROCK et ensemencer les cellules à la densité appropriée dans un récipient de culture cellulaire revêtu d'une matrice de membrane basale. Avant leur différenciation, les cellules souches embryonnaires humaines expriment des niveaux élevés du marqueur de pluripotence SOX2. En revanche, le marqueur de l'endoderme définitif, FOXA2, n'est pas détecté.

Après la différenciation, les cellules ES subissent des changements importants dans leur expression génique et protéique. En effet, après quatre jours en milieu de différenciation, SOX17 et FOXA2 sont coexprimés de manière uniforme dans les noyaux de nombreuses anciennes cellules ES, ce qui constitue un signe caractéristique de l'engagement vers l'endoderme définitif. Certaines cellules résistent au processus de différenciation et n'expriment aucune des deux protéines marqueurs.

Et en effet, conservent leur expression du marqueur de pluripotence SOX2. Dans cette expérience représentative, au troisième jour de différenciation, près de 60 % des cellules souches embryonnaires récoltées exprimaient CXCR4, dont la pureté a été enrichie à plus de 85 % après tri magnétique des cellules pluripotentes et des autres lignées indésirables. Après ensemencement des cellules CXCR4+ purifiées, seules quelques rares cellules SOX2+ sont détectées, la majorité des cellules ensemencées exprimant FOXA2.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de deux heures, si elle est effectuée correctement. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que l'immunohistochimie ou la QPCR peuvent être réalisées pour répondre à des questions supplémentaires concernant le processus de différenciation. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la purification des cellules d'endoderme par tri magnétique à billes.