HSV-Mediated Expression du transgène de chimériques Constructs pour étudier la fonction Behavioral des GPCR hétéromères chez la souris

L’objectif global de cette méthode est d’observer comment le transfert de gènes médié par le virus affecte les phénotypes comportementaux qui nécessitent l’hétérodimérisation des récepteurs couplés aux protéines G dans des modèles murins. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neuropharmacologie et de la psychopharmacologie. Plus précisément, comment les récepteurs couplés aux protéines g interagissent les uns avec les autres au niveau moléculaire.

En utilisant cette méthode, nous pouvons comprendre comment cette interaction affecte le comportement dans des modèles de troubles psychiatriques, tels que la schizophrénie et la dépression. À l’aide de cette méthode, nous allons examiner spécifiquement la sérotonine 2a et le récepteur métabotropique du glutamate 2, qui se sont tous deux révélés être impliqués dans le mécanisme d’action des médicaments utilisés pour traiter les patients atteints de schizophrénie. Commencez par anesthésier correctement la souris selon les méthodes approuvées.

Assurez-vous qu’un plan chirurgical d’anesthésie a été obtenu en effectuant un pincement des orteils et en notant l’absence de réponse. Appliquez ensuite un gel ophtalmique pour protéger les yeux. Fixez la souris au cadre stéréotaxique en vous assurant d’ajuster l’inclinaison de la tête de manière à ce que le crâne soit de niveau et plat.

Appliquez de la povidone iodée sur le cuir chevelu exposé. À l’aide d’un scalpel, faites une incision sagittale le long de la ligne médiane du crâne dans la zone rasée exposée. Fixez ensuite les pinces pureit à la peau au site d’incision pour vous assurer que le crâne reste exposé.

Appliquez du peroxyde d’hydrogène pour dissoudre le périoste et exposez les sutures du crâne. Maintenant que le bregma et les sutures sont visibles, assurez-vous d’ajuster le cadre stéréotaxique pour vous assurer que le crâne est de niveau. Alignez les pointes des aiguilles des seringues avec bregma et notez les coordonnées de bregma.

Pour injecter bilatéralement le cortex frontal, ajoutez 1,6 mm à la coordonnée enregistrée du bregma caudal rostral et 2,6 mm à la coordonnée enregistrée du bregma latéral médial. Marquez les sites d’injection sur le crâne, puis percez de petits trous aux sites d’injection. À l’aide d’un coton-tige, essuyez tout excès de sang ou de fragments d’os.

Amenez l’aiguille à la surface du cerveau et abaissez-la jusqu’à la profondeur de la coordonnée ventrale dorsale. Injectez ensuite lentement le contenu de la seringue en tournant le piston de l’aiguille pour administrer 0,1 microlitre par minute pendant cinq minutes, pour une injection de 0,5 microlitre. Laissez la seringue rester en place pendant cinq minutes.

Après le temps imparti, retirez l’animal de la stéréotaxie, fermez l’incision et placez-le sur un coussin chauffant. Administrez l’analgésie postopératoire selon votre protocole animal approuvé. Effectuez des tests comportementaux deux à trois jours après l’injection stéréotaxique de particules virales.

Habituez les souris à la pièce pendant au moins quatre heures avant le début de l’expérience. Commencez par dissoudre le DOI dans une solution saline à 0,9 % à deux milligrammes par kilogramme. Préparez une cage domestique sans aucune litière et, à l’aide d’un trépied, ajustez un appareil photo de manière à ce qu’il soit directement au-dessus de la cage domestique.

Calibrez la caméra de manière à ce que toute la cage de la maison soit dans le champ de vision. Pesez la souris et injectez-la par voie intrapéritonéale avec la dose appropriée de solution saline à 0,9 % ou de DOI. Remettez la souris dans la cage de la maison pendant dix minutes.

Au bout de dix minutes, placez la souris au centre de la cage domestique vide et assurez-vous qu’il n’y a pas d’angles morts dans le champ de vision de la caméra. Appuyez sur enregistrer sur le caméscope et quittez la pièce. Après 30 minutes, arrêtez l’enregistrement et replacez la souris dans la cage d’origine.

Répétez le test comportemental sur la souris suivante. Demandez à l’arbitre d’examiner les vidéos à l’aveugle aux conditions expérimentales. Enregistrez manuellement chaque contraction de la tête tout au long de la vidéo.

Une contraction de la tête est définie comme un mouvement rapide de la tête secoué par une souris. Traiter les données comme indiqué dans la partie écrite du protocole. Voici une image représentative de l’expression du transgène médiée par le HSV dans le cortex frontal.

HSV mGlu2 GFP a été injecté dans le cortex frontal et l’expression de la GFP a été révélée par immunocytochimie. Cette barre d’échelle représente 200 microns. Cette image montre un western blot de l’expression du transgène médié par le HSV et de la réactivité anti-mGlu2 dans le cortex frontal de souris knock-out mGlu2.

Ici, nous avons mesuré l’immunoréactivité de mGlu2 en tant que monomère. Cet histogramme montre que l’expression virale de mGlu2, mais pas de mGlu2 chimérique dans le cortex frontal des souris knock-out mGlu2, sauve significativement la réponse de contraction de la tête induite par l’agoniste hallucinogène du récepteur de la sérotonine 2a DOI. Les étapes les plus critiques de cette expérience sont le moment entre les injections virales, la réponse de la torsion de la tête et le moment où les souris sont sacrifiées.

Tout retard peut altérer les résultats de l’expérience ou introduire une ambiguïté dans les données. Une fois maîtrisée, la chirurgie de la souris prendra environ 30 minutes pour injecter le virus. L’expérience de contraction de la tête devrait également prendre environ 35 minutes par souris.

Il est recommandé d’échelonner les chirurgies ou d’opérer sur plus d’une souris à la fois. De cette façon, on peut maintenir une chronologie qui permet de faire les expériences de contraction de la tête dans les trois à quatre jours suivant la chirurgie, ce qui est le temps d’expression maximal de la construction virale. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans votre expérience.