HSV-Mediated Expression du transgène de chimériques Constructs pour étudier la fonction Behavioral des GPCR hétéromères chez la souris
9 juillet 2016
Cet article décrit comment injecter des vecteurs viraux dans le cortex frontal de la souris pour tester tests comportementaux qui nécessitent la formation hétéromère GPCR.
L'objectif général de cette méthode est d'observer comment le transfert génique médié par un virus affecte les phénotypes comportementaux nécessitant l'hétérodimérisation de récepteurs couplés aux protéines G chez des modèles murins. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neuropharmacologie et de la psychopharmacologie, notamment la manière dont les récepteurs couplés aux protéines G interagissent entre eux au niveau moléculaire.
En utilisant cette méthode, nous pouvons comprendre comment cette interaction affecte le comportement dans des modèles de troubles psychiatriques, tels que la schizophrénie et la dépression. En utilisant cette méthode, nous allons spécifiquement étudier le récepteur de la sérotonine 2a et le récepteur métabotropique du glutamate 2, tous deux impliqués dans le mécanisme d'action des médicaments utilisés pour traiter les patients atteints de schizophrénie. Commencez par anesthésier correctement la souris selon des méthodes approuvées.
Vérifiez qu’un plan chirurgical d’anesthésie a été atteint en pinçant un orteil et en notant l’absence de réponse. Appliquez ensuite un gel ophtalmique pour protéger les yeux. Fixez la souris sur le cadre stéréotaxique, en veillant à ajuster l’inclinaison de la tête afin que le crâne soit horizontal et plat.
Appliquer de l'iodure de povidone sur le cuir chevelu exposé. À l'aide d'un scalpel, pratiquer une incision sagittale le long de la ligne médiane du crâne dans la zone rasée exposée. Ensuite, fixer des pinces Pureit sur la peau au niveau du site d'incision afin de s'assurer que le crâne reste exposé.
Appliquez du peroxyde d'hydrogène pour dissoudre le périoste et exposer les sutures du crâne. Maintenant que le bregma et les sutures sont visibles, assurez-vous d'ajuster le cadre stéréotaxique afin de garantir que le crâne soit bien horizontal. Alignez les extrémités des aiguilles des seringues avec le bregma et enregistrez les coordonnées du bregma.
Pour injecter bilatéralement le cortex frontal, ajouter 1,6 mm à la coordonnée rostro-caudale enregistrée du bregma et 2,6 mm à la coordonnée médio-latérale enregistrée du bregma. Marquer les sites d'injection sur le crâne, puis percer de petits trous aux emplacements des injections. À l’aide d’un applicateur à embout cotonneux, éliminer tout excès de sang ou de fragments osseux.
Amener l'aiguille à la surface du cerveau et descendre à la profondeur correspondant à la coordonnée dorso-ventrale. Ensuite, injecter lentement le contenu de la seringue en tournant le piston de l'aiguille afin d'administrer 0,1 microlitre par minute pendant cinq minutes, pour une injection totale de 0,5 microlitre. Laisser la seringue en place pendant cinq minutes.
Après le temps imparti, retirer l'animal de la stéréotaxie, fermer l'incision et le placer sur un tapis chauffant. Administrer une analgésie postopératoire conformément au protocole animal approuvé. Réaliser les tests comportementaux deux à trois jours après l'injection stéréotaxique de particules virales.
Habituez les souris à la pièce pendant au moins quatre heures avant le début de l'expérience. Commencez par dissoudre le DOI dans une solution saline à 0,9 pour cent à une concentration de deux milligrammes par kilogramme. Préparez une cage d'habitation sans aucune litière et, à l'aide d'un trépied, positionnez une caméra directement au-dessus de la cage d'habitation.
Étalonner la caméra afin que toute la cage d’origine soit dans le champ de vision. Peser la souris et injecter par voie intrapéritonéale la dose appropriée de solution saline à 0,9 pour cent ou de DOI. Remettre la souris dans sa cage d’origine pendant dix minutes.
Après dix minutes, placer la souris au centre de la cage domestique vide et s'assurer qu'il n'y a aucun angle mort dans le champ de vue de la caméra. Appuyer sur « enregistrement » sur le caméscope et quitter la pièce. Après 30 minutes, arrêter l'enregistrement et replacer la souris dans sa cage domestique d'origine.
Répétez le test comportemental sur la souris suivante. Demandez à l'observateur de visionner les vidéos en aveugle par rapport aux conditions expérimentales. Enregistrez manuellement chaque secousse de la tête tout au long de la vidéo.
Un tic de la tête est défini comme un mouvement rapide de secousse de la tête effectué par une souris. Traitez les données comme indiqué dans la partie écrite du protocole. L'image présentée ici montre un exemple d'expression de transgène médiée par un HSV dans le cortex frontal.
Le HSV mGlu2 GFP a été injecté dans le cortex frontal et l'expression de la GFP a été révélée par immunocytochimie. Cette barre d'échelle représente 200 microns. Cette image montre un immunoblot de l'expression du transgène médiée par le HSV et la réactivité anti-mGlu2 dans le cortex frontal de souris knock-out pour mGlu2.
Ici, nous avons mesuré l'immunoréactivité de mGlu2 sous forme de monomère. Cet histogramme montre que l'expression médiée par un vecteur viral de mGlu2, mais pas celle de mGlu2 chimérique dans le cortex frontal de souris invalidées pour mGlu2, restaure de manière significative la réponse au tremblement de la tête induite par l'agoniste hallucinogène du récepteur 5-HT2A, le DOI. Les étapes les plus critiques de cette expérience sont le moment des injections virales, celui de la réponse au tremblement de la tête et celui de la mise à mort des souris.
Tout retard peut modifier les résultats de l'expérience ou introduire une ambiguïté dans les données. Une fois maîtrisée, la chirurgie chez la souris prendra environ 30 minutes pour injecter le virus. L'expérience du tremblement de la tête devrait également prendre environ 35 minutes par souris.
Il est recommandé d’espacer les chirurgies ou d’opérer plusieurs souris simultanément. Cela permet de respecter un calendrier qui rend possible la réalisation des expériences de secouement de la tête entre trois et quatre jours après la chirurgie, période correspondant au pic d’expression du vecteur viral. Merci d’avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.
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Aperçu
Cet article présente une méthode permettant d'étudier les conséquences comportementales du transfert génique médié par un virus ciblant l'hétérodimérisation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) chez des modèles murins. Plus précisément, il examine l'interaction entre le récepteur de la sérotonine 2A (5-HT2A) et le récepteur métabotropique du glutamate 2 (mGlu2) dans le contexte de comportements liés à la psychose, en utilisant la réponse par secousse de la tête (HTR) comme indicateur comportemental après l'administration d'une substance hallucinogène.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neuropharmacologie
- Neurosciences comportementales
- Neurosciences moléculaires
Contexte
- Les complexes hétéromériques de RCPG, tels que 5-HT2A-mGlu2, sont impliqués dans des troubles psychiatriques comme la schizophrénie.
- La réponse de secousse de la tête (HTR) chez la souris est un test comportemental bien établi pour l'action des drogues hallucinogènes et dépend de la fonction du récepteur 5-HT2A.
- Des études antérieures montrent que les souris dépourvues de mGlu2 présentent une HTR réduite aux hallucinogènes, suggérant un rôle du mGlu2 dans les comportements médiés par le 5-HT2A.
- La nécessité du complexe récepteur 5-HT2A-mGlu2 pour ces comportements n'avait pas été testée directement.
Objectif de l'étude
- Déterminer si le complexe hétéromérique de récepteurs 5-HT2A-mGlu2 est nécessaire aux réponses comportementales induites par les hallucinogènes chez la souris.
- Évaluer la capacité de l'expression virale médiée du mGlu2 ou d'une construction chimérique de mGlu2 (incapable de former le complexe hétéromérique) à restaurer la réponse de tête chez des souris invalidées pour le mGlu2.
- Fournir un cadre méthodologique pour l'étude des interactions entre récepteurs couplés aux protéines G in vivo.
Méthodes utilisées
- Chirurgie stéréotaxique pour l'injection bilatérale de constructions de virus de l'herpès simplex (HSV) dans le cortex frontal de souris anesthésiées.
- Expression de mGlu2 de type sauvage ou d'une construction chimérique mGlu2/mGlu3 (mGlu2ΔTM4N) par l'intermédiaire de vecteurs viraux.
- Tests comportementaux utilisant la réponse de secousse de la tête (HTR) après administration de l'hallucinogène DOI.
- Immunocytochimie et immunoblotting pour confirmer l'expression du transgène dans le cortex frontal.
Résultats principaux
- L'expression médiée par un HSV du mGlu2 dans le cortex frontal de souris knock-out pour le mGlu2 corrige de manière significative la réponse au tremblement de tête induite par le DOI.
- L'expression de la construction chimérique du mGlu2, qui ne peut pas former le complexe 5-HT2A-mGlu2, ne corrige pas la réponse au tremblement de tête.
- L'immunocytochimie et le western blot confirment une expression transgénique réussie et spécifique dans la région cérébrale ciblée.
- Le moment des injections virales, des tests comportementaux et du prélèvement tissulaire est crucial pour la réussite de l'expérience.
Conclusions
- Le complexe hétéromérique de récepteurs 5-HT2A-mGlu2 est nécessaire pour obtenir la réponse comportementale complète aux drogues hallucinogènes chez la souris.
- Le transfert génique médié par virus constitue une approche efficace pour analyser les exigences moléculaires des interactions entre récepteurs couplés aux protéines G dans un organisme vivant.
- Cette méthode fournit un outil précieux pour l'étude des bases moléculaires des comportements associés aux troubles psychiatriques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'analyse de la fonction comportementale des hétéromères de récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) par expression transgénique médiée par un virus herpès simple (HSV) chez la souris répond à un défi crucial dans la découverte de médicaments neuropsychiatriques : établir des liens mécanistiques entre les complexes récepteurs et les phénotypes pertinents pour la maladie. Cette approche permet d'acquérir une confiance prédictive dans la validation des cibles pour les troubles psychiatriques en isolant la nécessité fonctionnelle d'interactions réceptrices spécifiques. La méthode soutient les décisions de portefeuille ajustées au risque à l'interface entre la découverte précoce et la recherche translationnelle.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'interrogation directe de la fonction des hétéromères de RCPG in vivo pour une détection mécanistique des risques.
- Précise la nécessité de complexes récepteurs spécifiques pour des phénotypes comportementaux pertinents dans la maladie.
- Renforce la confiance prédictive dans le choix de la cible pour les indications neuropsychiatriques.
Développement de criblages et de tests
- Établit des tests comportementaux validés associés à des interventions moléculaires pour le criblage en aval.
- Fournit des mesures comportementales quantitatives (réponse de tremblement de la tête) pour la standardisation des tests.
- Permet une évaluation reproductible des manipulations génétiques et pharmacologiques in vivo.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les modèles comportementaux précliniques avec les mécanismes de la maladie humaine grâce à l'analyse des complexes récepteurs.
- Permet une continuité entre la découverte moléculaire et la validation comportementale dans les modèles animaux.
- Facilite le développement de biomarqueurs translationnels en reliant les interventions moléculaires à des phénotypes quantifiables.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode fait le lien entre la découverte précoce et la validation préclinique en permettant des tests fondés sur des hypothèses concernant la fonction des complexes récepteurs dans des systèmes comportementaux pertinents pour la maladie.
- Biologie de la découverte : Soutient le test d'hypothèse nulle concernant l'implication des hétéromères de récepteurs couplés aux protéines G dans les phénotypes psychiatriques.
- Dépistage : Fournit une plateforme permettant des mesures comportementales quantitatives après une perturbation génétique ou pharmacologique.
- Analytique : Fournit des paramètres mesurables (nombre de secousses de la tête) permettant des comparaisons statistiques entre les groupes expérimentaux.
- Recherche translationnelle Relie les interventions moléculaires à des résultats comportementaux pertinents pour les troubles psychiatriques.
- Réutilisation au niveau de l'entreprise : Propose un flux de travail réutilisable pour l'analyse d'autres complexes récepteurs in vivo.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles et réduit l'ambiguïté mécanistique pour les programmes de médicaments neuropsychiatriques.
- Valeur opérationnelle : Standardise le phénotypage comportemental associé aux interventions moléculaires afin d'assurer la reproductibilité et l'évolutivité.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'aller/arrêt en précisant la nécessité des complexes récepteurs pour les comportements pertinents à la maladie.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles et mécanismes en vue de leur développement dans les filières du système nerveux central.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en chirurgie stéréotaxique et en phénotypage comportemental chez les rongeurs.
- Exige un accès à une infrastructure de production de vecteurs viraux et de validation moléculaire (immunocytochimie, immunotransfert).
- Implique une standardisation rigoureuse entre équipes en ce qui concerne le moment des injections, les tests comportementaux et l'analyse des données.
- L'adaptation à d'autres complexes récepteurs ou à d'autres tests comportementaux peut nécessiter une optimisation du protocole.
- Un chronométrage précis entre l'administration virale, l'évaluation comportementale et la collecte de tissus est essentiel pour l'intégrité des données.
