Name: HSV-Mediated Expression du transgène de chimériques Constructs pour étudier la fonction Behavioral des GPCR hétéromères chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Découvrez le transfert de gènes par virus HSV pour étudier l'hétérodimérisation des récepteurs GPCR et ses effets comportementaux chez la souris. Cette méthode permet d'analyser les interactions 5-HT2A-mGlu2 liées aux troubles psychiatriques.

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NIH R01MH084894 a participé au financement de cette étude. Nous tenons à remercier les Drs. Yasmin Hurd et Scott Russo au Mount Sinai School of Medicine pour le don de la souris et l&#39;utilisation de leurs installations de chirurgie et de comportement pendant le tournage de ce travail.

NOTE: Toutes les procédures pour l&#39;élevage et soins des animaux ont été menées conformément à la réglementation du Comité des soins et l&#39;utilisation des animaux institutionnels (IACUC) de Mount Sinai School of Medicine. Assurez-vous d&#39;utiliser des gants stériles pendant toute la procédure. 1. drogues et Virus Préparation <ol><li> Préparation des médicaments <ol><li> Préparer 15,0 ml de kétamine / xylazine anesthésique en dissolvant 1,35 ml de 100 mg / ml de kétamine et 0,75 ml de 20 mg / ml de xylazine dans 12,9 ml de 0,9% de solution saline. Bien mélanger la solution. </li></ol></li><li> Préparation de virus <ol><li> Clone du mGlu2 et mGlu2ΔTM4N construit dans un vecteur virus bicistronique herpès simplex (HSV) suivant les protocoles standard décrits précédemment 6. Emballez les particules virales comme décrit précédemment 6,13,14. Remplacement des résidus Ala-677 4,40, Ala-681 4,44 et 4,48 Ala685 dans mGlu2 pour Ser686 4,40, PhE690 4,44 et Gly-694 à 4,48 mGlu3 (HA-mGlu2ΔTM4N) ont été décrits précédemment 6. NOTE: Il a été précédemment démontré que la construction chimère HA mGlu2ΔTM4N est exprimé à la membrane plasmique par G intacte protéine dépendante de la signalisation 6. </li><li> Stocker des vecteurs viraux à -80 ° C lorsqu&#39;ils ne sont pas en cours d&#39;utilisation. vecteur viral Thaw sur la glace, puis aliquote en 10 aliquotes. Pour l&#39;intervention chirurgicale, garder sur la glace. </li></ol></li></ol> 2. Surgery <ol><li> Préparation de la chirurgie <ol><li> Peser la souris et injecter la souris avec une dose appropriée de kétamine / xylazine cocktail (pour plus de détails, voir 1.1.1). </li><li> Vérifiez la souris pour voir si elle est correctement anesthésié, presser le pied et la queue pour la réponse de la douleur, en cas d&#39;impossibilité d&#39;obtenir une réponse, la souris est correctement anesthésié. </li><li> Raser la tête de la souris à partir de la base du crâne à la pointe du nez à l&#39;aide clippers. Appliquer le gel ophtalmique à l&#39;af de la souristerward pour prévenir la cécité de la souris. </li><li> Chargez chaque seringue sur le cadre stéréotaxique. Puis basculer la partie verticale de chaque bras du cadre stéréotaxique de sorte qu&#39;ils sont à 10 degrés par rapport à la normale. Faire en sorte que les bras sont inclinés de telle sorte que les aiguilles se font face. </li><li> Nettoyez chaque seringue en remplissant l&#39;aiguille avec 70% d&#39;éthanol. Remplir l&#39;aiguille au moins trois fois pour s&#39;assurer que la seringue est propre. </li><li> Une fois que l&#39;aiguille a été nettoyé, rincer l&#39;aiguille en remplissant l&#39;aiguille avec double H distillée 2 O. Une fois rincée, remplir chaque aiguille avec 1,3 pi de la double H distillée 2 O. Tournez le piston de la seringue pour libérer 0,3 ul d&#39; une double H distillée 2 O. Si l&#39;eau perle à la pointe de l&#39;aiguille, essuyez soigneusement l&#39;eau. Si rien ne sort de la seringue, pousser le piston complètement vers le bas et puis répétez le nettoyage de la seringue. </li><li> Après avoir rempli avec de l&#39;eau, puis retirez la seringue de remplissage de la seringue avec0,5 pi de l&#39;air. </li><li> Une fois que l&#39;air et l&#39;eau sont dans la seringue, remplissez soigneusement la seringue avec 1,3 pi de solution de virus. À ce stade, faire en sorte que le volume total dans la seringue est de 2,8 pi. Encore une fois tourner la pointe de la seringue pour libérer 0,3 ul de virus. Si des perles liquides à la pointe de l&#39;aiguille, essuyez soigneusement liquide. Si rien ne sort de la seringue, pousser le piston complètement vers le bas et puis répétez le nettoyage de la seringue. </li></ol></li><li> Chirurgie <ol><li> Fixer la souris sur le cadre stéréotaxique, en veillant à ajuster le cadre stéréotaxique de telle sorte que le crâne est plat et plat. Appliquer povodine iodée sur le cuir chevelu exposé. À l&#39;aide d&#39;un scalpel, une incision sagittale le long de la ligne médiane du crâne à l&#39;intérieur de la zone rasée exposée. Ensuite, fixez les pinces de burette à la peau au niveau du site d&#39;incision pour faire en sorte que le crâne reste exposé. </li><li> Utilisez H 2 O 2 à dissoudre le périoste pour exposer les sutures de lacrâne. Maintenant que le bregma et les sutures sont visibles, assurez-vous d&#39;ajuster le cadre stéréotaxique pour vous assurer que le crâne est de niveau. </li><li> Aligner les pointes d&#39;aiguilles des seringues avec le bregma et enregistrer les coordonnées du bregma. Calculer les coordonnées du où vont être insérées les aiguilles. <ol><li> Pour le plan Rostral-Cauldal (RC), ajouter 1,6 mm aux RC coordonnées enregistrées de Bregma (+1,6 de bregma). Pour le plan dorso-ventral (DV), soustraire 2,4 mm à partir des coordonnées de Bregma DV enregistrées (-2,4 de bregma). </li><li> Enfin, pour le plan médial latéral (ML), ajouter 2,6 mm aux ML coordonnées enregistrées de Bregma (+2,6 de bregma). Pour toutes les coordonnées assurez-vous d&#39;enregistrer les deux coordonnées gauche et à droite, car cela est une injection bilatérale. </li></ol></li><li> Amener les aiguilles aux coordonnées désirées. Marquez les lieux d&#39;où vont être insérés et avec une perceuse, percer les zones marquées les aiguilles. </li><li> Avec une pointe de coton applicateur wipe loin de sang ou de moelle fragment excès. </li><li> Amener les aiguilles du crâne où les pointes des aiguilles sont en contact avec la surface du cerveau. Abaissez ensuite les aiguilles pour les coordonnées désirées en les abaissant lentement. </li><li> Une fois que les aiguilles sont les coordonnées désirées, injecter lentement le contenu de la seringue en tournant le piston de l&#39;aiguille 0,1 ul par minute au cours de 5 min (au total 0,5 pi). </li><li> Une fois que l&#39;injection a été faite laisser la seringue dans le cortex pendant 5 min. </li></ol></li><li> Fermeture Up / Soins <ol><li> Retirez les aiguilles du cortex de souris régulièrement et lentement. Retirez ensuite la souris du cadre stéréotaxique. </li><li> Appliquer cyanoacrylate (colle cutanée) sur les rabats de base de la peau de l&#39;incision, puis avec une pince saisissent les lambeaux de peau et de les placer ensemble. </li><li> Laisser le cyanoacrylate sécher. Placez la souris dans une cage sur un coussin chauffant (coussin chauffant est facultatif si le surgSuite ical est maintenue sous RT de 37 ° C - sinon pas nécessaire). Assurez-vous de placer la souris sur une serviette en papier pour vous assurer que la literie ne respecte pas le site chirurgical. </li><li> En fonction de la durée de l&#39;intervention chirurgicale, en sorte que la souris est hors de l&#39;anesthésie à l&#39;intérieur de 30 - 60 minutes après l&#39;intervention. Après la chirurgie, l&#39;animal est placé dans sa propre cage et surveillé jusqu&#39;à ce qu&#39;il devienne conscient avant de retourner à sa chambre pour récupérer. Aucun analgésiques sont utilisés en post-opératoire, car ils peuvent modifier les résultats de nos expériences en modifiant certaines des voies biochimiques cérébrales. Toutefois, les animaux sont surveillés jusqu&#39;à ce qu&#39;ils récupèrent de l&#39;anesthésie sur le jour de la chirurgie, et post-fonctionnement quotidien des signes d&#39;infection et de l&#39;évaluation de la douleur / détresse. </li></ol></li></ol> Expérience 3. Réponse Head Twitch <ol><li> Installer <ol><li> Effectuer tous les tests de comportement 10h00-14:00, 2 - 3 jours après stereotainjection CTIC de particules virales. </li><li> Dissoudre le (±) -1- (2,5-diméthoxy-4-iodophényl) de chlorhydrate -2-aminopropane (DOI) dans une solution saline à 0,9% à 2,0 mg / kg. Aussi préparer une solution saline à 0,9%. </li><li> Préparer une cage à la maison (28 x 18 x 15 cm) sans literie et en utilisant un tri-pod, régler une caméra de sorte que la vue de la caméra vidéo est directement au-dessus de la cage de la maison. </li><li> Habituer les souris à la salle pendant au moins 4 heures avant le début de l&#39;expérience. </li><li> Mettre en place un caméscope pour enregistrer la contraction de la tête. </li></ol></li><li> Expérience <ol><li> Placez la caméra de sorte qu&#39;il est directement au-dessus d&#39;une cage à la maison. Calibrer la caméra de sorte que l&#39;ensemble de la cage de la maison se trouve dans le champ de vision. </li><li> Peser la souris et injecter la souris par voie intrapéritonéale avec une dose appropriée soit 0,9% de solution saline ou DOI (0,01 ml / g). NOTE: Si une souris pèse 25 grammes, administrer la dose à un volume total de 0,25 ml. </li><li> Placez chaque souris de retour dans leur cage for 10 min. Au bout de 10 min, le lieu souris dans le centre de la cage vide et valider qu&#39;il n&#39;y a pas de taches aveugles dans le champ de vision de la caméra. Appuyez sur disque sur le caméscope. Quitte la pièce. REMARQUE: les mouvements de la souris et diverses réponses comportementales qui y sont (... La tête Twitch, oreille scratch, etc S&#39;il vous plaît se référer au supplément tableau de données 1 2007 Gonzalez-Maeso et al pour la liste complète des réponses comportementales induites par DOI) 3, seront enregistrées pour 30 minutes. Par conséquent, il est important, il n&#39;y a pas de taches aveugles dans le champ de vision enregistrée. </li><li> Au bout de 30 min arrêter l&#39;enregistrement sur le caméscope et le lieu souris retour dans la cage de la maison d&#39;origine. Répétez ce processus pour chaque souris. </li></ol></li><li> La revue <ol><li> Demandez à chaque examen de l&#39; arbitre les bandes aveugles aux conditions expérimentales de la souris (ie., Médicaments utilisés pendant la tête twitch expérience ou virus utilisé lors de l&#39; injection intracrânienne)). enregistrer manuellement chaque tête twitch throughout la vidéo. NOTE: Head-tic est défini comme un mouvement de la tête d&#39;agitation rapide menée par une souris (vidéo supplémentaire). </li><li> Pour chaque souris, la moyenne de la réponse du HTR final des trois totaux des arbitres aveugles. Ensuite groupe ces valeurs par condition expérimentale et effectuer une analyse statistique (ie., T-test ou ANOVA). </li></ol></li></ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ainsi que les résultats précédents en mGlu2-KO 5 souris, les résultats obtenus avec mGlu2 et mGlu2 / mGlu3 constructions chimères qui ne forment pas le complexe récepteur 2A -mGlu2 5-HT dans des cellules en culture suggèrent que la 5-HT 2A -mGlu2 complexe récepteur hétéromère en souris cortex frontal est nécessaire pour induire un comportement tête twitch par hallucinogènes 5-HT des agonistes des récepteurs 2A LSD-like. Une limitation de cette méthode est qu&#39;elle ne mesure...

Hallucinogènes, comme le LSD, la psilocybine et la mescaline provoquent des changements importants dans la conscience humaine, la cognition et l&#39; émotion 7-9. L&#39; inactivation de la sérotonine 5-HT signalisation du récepteur 2A par des approches génétiques ou pharmacologiques soit provoque nettement atténué les réactions comportementales aux hallucinogènes dans les deux modèles de rongeurs 3,10 et humains 11. Bien que les hallucinogènes se lient d&#39; autres sous - types de récepteurs 8, le récepteur 5-HT2A est considéré comme nécessaire à l&#39;activité comportementale unique de ces produits chimiques. Groupe II récepteurs de glutamate métabotropique (ie., MGlu2 et mGlu3) ont été la cible d&#39; une attention considérable en ce qui concerne le mécanisme moléculaire d&#39;hallucinogènes et de leur rôle essentiel qui sous - tend la psychose 12. Auparavant, il a été démontré que des souris sans expression de la protéine mGlu2 (souris mGlu2-KO) sont insensibles aux effets cellulaires et comportementaux hallucinogens 5. Il a également été suggéré que la 5-HT 2A et les récepteurs de mGlu2 forment un complexe hétéromère spécifique à travers lequel la sérotonine et de glutamate de ligands modulent le motif de G couplage des protéines dans les cellules vivantes 1,2. Structurellement, transmembranaires (TM) , les domaines 4 et 5 de mGlu2 jouent un rôle fondamental dans la formation hétéromère avec le récepteur 5-HT 2A 5. En outre, une investigation a montré que trois résidus situés à l&#39;extrémité intracellulaire de TM4 de mGlu2 sont nécessaires pour former la 5-HT 2A -mGlu2 hétérocomplexe de récepteur dans des cellules vivant à 6. Sur la base de ces résultats observés dans les systèmes d&#39;expression hétérologues, ici , nous décrivons l&#39;utilisation de l&#39; expression HSV-médiée de type sauvage mGlu2 et mGlu2 / mGlu3 constructions chimériques dans le cortex frontal des souris mGlu2-KO pour vérifier si la formation hétéromère entre 5-HT 2A et mGlu2 est nécessaire pour lacomportement tête contraction induite par hallucinogènes 5-HT des agonistes des récepteurs de 2A.

<table><tbody><tr><td>vecteur du virus de l’herpès simplex bicitronnique mGlu2 (HSV)&nbsp ;</td><td>MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 et mGlu2DTM4N ont été sous-clonés dans le vecteur bicistronique du virus HSV-GFP p1005+ HSV exprimant la GFP sous le contrôle du promoteur CMV. Les particules virales ont été produites par le Viral Core Facility de l’Institut McGovern (MIT). Pour plus d’informations, veuillez contacter la directrice, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu)</td></tr><tr><td>mGlu2&Delta ; Vecteur du virus de l’herpès simplex bicitronnique TM4N&nbsp ;</td><td>MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 et mGlu2DTM4N ont été sous-clonés dans le vecteur bicistronique du virus HSV-GFP p1005+ HSV exprimant la GFP sous le contrôle du promoteur CMV. Les particules virales ont été produites par le Viral Core Facility de l’Institut McGovern (MIT). Pour plus d’informations, veuillez contacter la directrice, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu)</td></tr><tr><td>GFP vecteur du virus de l’herpès simplex bicitronné (HSV)&nbsp ;</td><td>MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 et mGlu2DTM4N ont été sous-clonés dans le vecteur bicistronique du virus HSV-GFP p1005+ HSV exprimant la GFP sous le contrôle du promoteur CMV. Les particules virales ont été produites par le Viral Core Facility de l’Institut McGovern (MIT). Pour plus d’informations, veuillez contacter la directrice, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu)</td></tr><tr><td>Xylazine&nbsp ;</td><td></td><td>Lloyd List n° 4811-20ml, NADA #139-236, Code(s) NDC : 61311-481-10</td><td>1,35 ml de kétamine (100 mg/ml) + 0,75 ml de xylazine (20 mg/ml) sont dilués dans 12,0 ml de solution saline à 0,9</td></tr> % <tr><td>de kétamine.</td><td>Vedco</td><td>KetaVed-10ml, NADA #200-029, Code(s) NDC : 50989-161-06</td><td>1,35 ml de kétamine (100 mg/ml) + 0,75 ml de xylazine (20 mg/ml) sont dilués dans 12,0 ml de solution saline à 0,9 %</td></tr><tr><td>Gel ophtalmique</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0550805</td><td></td></tr><tr><td>Pinces Burret</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9268369</td><td></td></tr><tr><td>Feather Lame chirurgicale</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9032736</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-898-919&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>seringue Hamilton</td><td>Fisher Scientific</td><td>14815203</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton&trade ; Petites aiguilles amovibles à moyeu (calibre 33)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14816206</td><td></td></tr><tr><td>Micro-perceuse sans fil</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9089241</td><td></td></tr><tr><td>Dermabond Adhésif cutané</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0690470</td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn ;)-chlorhydrate de -1-(2,5-diméthoxy-4-iodophényl)-2-aminopropane (DOI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42203-78-1</td><td>dissous dans une solution saline à 0,9 % à la concentration de 2,0 mg/kg</td></tr></tbody></table>

hsv-mediated expression du transgène de chimériques constructs pour étudier la fonction behavioral des gpcr hétéromères chez la souris

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

Le complexe récepteur hétéromérique entre 5-HT2A et mGlu2 a été impliqué dans certains des phénotypes comportementaux dans des modèles murins de psychose1,2. Par conséquent, l’étude des détails structurels de l’interaction entre 5-HT2A et mGlu2 affectant les comportements liés à la schizophrénie représente un outil translationnel puissant. Comme nous l’avons montré précédemment, la réponse de contraction de la tête (HTR) chez les souris est provoquée par des drogues hallucinogènes et cette réponse comportementale est absente chez les souris 5-HT2A knockout (KO)3,4. De plus, en exprimant conditionnellement le récepteur 5-HT2A uniquement dans le cortex, il a été démontré que les voies de signalisation dépendantes du récepteur 5-HT2A sur les neurones pyramidaux corticaux sont suffisantes pour provoquer un comportement de contraction de la tête en réponse aux drogues hallucinogènes3. Enfin, il a été démontré que la réponse comportementale induite par les hallucinogènes DOI et le diéthylamide de l’acide lysergique (LSD) est significativement diminuée chez les souris mGlu2-KO5. Ces résultats suggèrent que mGlu2 est au moins en partie nécessaire pour les effets comportementaux de type psychose dépendants du récepteur 5-HT2A induits par les drogues de type LSD. Cependant, cela ne fournit pas de preuve quant à savoir si le complexe de récepteurs 5-HT 2A-mGlu2 est nécessaire pour ce phénotype comportemental. Pour répondre à cette question, les constructions du virus de l’herpès simplex (HSV) pour exprimer soit mGlu2, soit mGlu2ΔTM4N (construction chimérique mGlu2/mGlu3 qui ne forme pas le complexe récepteur 5-HT2A-mGlu2) dans le cortex frontal des souris mGlu2-KO ont été utilisées pour examiner si ce complexe hétéromérique GPCR est nécessaire pour les effets comportementaux induits par les drogues de type LSD6.

Des résultats antérieurs démontrent que la tête-twitch réponse comportementale murin est fiable et robuste provoquée par les hallucinogènes, et il est absent dans 5-HT 2A -kō souris 3. En outre, il a été démontré que la réponse de la tête contraction provoquée par les hallucinogènes 5-HT 2A agonistes DOI et le LSD a été significativement diminuée chez les souris KO mGlu2-5. Cependant, bien que les résultats antérieurs démontrent de façon convai...

Cet article décrit comment injecter des vecteurs viraux dans le cortex frontal de la souris pour tester tests comportementaux qui nécessitent la formation hétéromère GPCR.

HSV-Mediated Expression du transgène de chimériques Constructs pour étudier la fonction Behavioral des GPCR hétéromères chez la souris

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

L'objectif général de cette méthode est d'observer comment le transfert génique médié par un virus affecte les phénotypes comportementaux nécessitant l'hétérodimérisation de récepteurs couplés aux protéines G chez des modèles murins. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neuropharmacologie et de la psychopharmacologie, notamment la manière dont les récepteurs couplés aux protéines G interagissent entre eux au niveau moléculaire.En utilisant cette méthode, nous pouvons comprendre comment cette interaction affecte le comportement dans des modèles de troubles psychiatriques, tels que la schizophrénie et la dépression. En utilisant cette méthode, nous allons spécifiquement étudier le récepteur de la sérotonine 2a et le récepteur métabotropique du glutamate 2, tous deux impliqués dans le mécanisme d'action des médicaments utilisés pour traiter les patients atteints de schizophrénie. Commencez par anesthésier correctement la souris selon des méthodes approuvées.Vérifiez qu’un plan chirurgical d’anesthésie a été atteint en pinçant un orteil et en notant l’absence de réponse. Appliquez ensuite un gel ophtalmique pour protéger les yeux. Fixez la souris sur le cadre stéréotaxique, en veillant à ajuster l’inclinaison de la tête afin que le crâne soit horizontal et plat.Appliquer de l'iodure de povidone sur le cuir chevelu exposé. À l'aide d'un scalpel, pratiquer une incision sagittale le long de la ligne médiane du crâne dans la zone rasée exposée. Ensuite, fixer des pinces Pureit sur la peau au niveau du site d'incision afin de s'assurer que le crâne reste exposé.Appliquez du peroxyde d'hydrogène pour dissoudre le périoste et exposer les sutures du crâne. Maintenant que le bregma et les sutures sont visibles, assurez-vous d'ajuster le cadre stéréotaxique afin de garantir que le crâne soit bien horizontal. Alignez les extrémités des aiguilles des seringues avec le bregma et enregistrez les coordonnées du bregma.Pour injecter bilatéralement le cortex frontal, ajouter 1,6 mm à la coordonnée rostro-caudale enregistrée du bregma et 2,6 mm à la coordonnée médio-latérale enregistrée du bregma. Marquer les sites d'injection sur le crâne, puis percer de petits trous aux emplacements des injections. À l’aide d’un applicateur à embout cotonneux, éliminer tout excès de sang ou de fragments osseux.Amener l'aiguille à la surface du cerveau et descendre à la profondeur correspondant à la coordonnée dorso-ventrale. Ensuite, injecter lentement le contenu de la seringue en tournant le piston de l'aiguille afin d'administrer 0,1 microlitre par minute pendant cinq minutes, pour une injection totale de 0,5 microlitre. Laisser la seringue en place pendant cinq minutes.Après le temps imparti, retirer l'animal de la stéréotaxie, fermer l'incision et le placer sur un tapis chauffant. Administrer une analgésie postopératoire conformément au protocole animal approuvé. Réaliser les tests comportementaux deux à trois jours après l'injection stéréotaxique de particules virales.Habituez les souris à la pièce pendant au moins quatre heures avant le début de l'expérience. Commencez par dissoudre le DOI dans une solution saline à 0,9 pour cent à une concentration de deux milligrammes par kilogramme. Préparez une cage d'habitation sans aucune litière et, à l'aide d'un trépied, positionnez une caméra directement au-dessus de la cage d'habitation.Étalonner la caméra afin que toute la cage d’origine soit dans le champ de vision. Peser la souris et injecter par voie intrapéritonéale la dose appropriée de solution saline à 0,9 pour cent ou de DOI. Remettre la souris dans sa cage d’origine pendant dix minutes.Après dix minutes, placer la souris au centre de la cage domestique vide et s'assurer qu'il n'y a aucun angle mort dans le champ de vue de la caméra. Appuyer sur « enregistrement » sur le caméscope et quitter la pièce. Après 30 minutes, arrêter l'enregistrement et replacer la souris dans sa cage domestique d'origine.Répétez le test comportemental sur la souris suivante. Demandez à l'observateur de visionner les vidéos en aveugle par rapport aux conditions expérimentales. Enregistrez manuellement chaque secousse de la tête tout au long de la vidéo.Un tic de la tête est défini comme un mouvement rapide de secousse de la tête effectué par une souris. Traitez les données comme indiqué dans la partie écrite du protocole. L'image présentée ici montre un exemple d'expression de transgène médiée par un HSV dans le cortex frontal.Le HSV mGlu2 GFP a été injecté dans le cortex frontal et l'expression de la GFP a été révélée par immunocytochimie. Cette barre d'échelle représente 200 microns. Cette image montre un immunoblot de l'expression du transgène médiée par le HSV et la réactivité anti-mGlu2 dans le cortex frontal de souris knock-out pour mGlu2.Ici, nous avons mesuré l'immunoréactivité de mGlu2 sous forme de monomère. Cet histogramme montre que l'expression médiée par un vecteur viral de mGlu2, mais pas celle de mGlu2 chimérique dans le cortex frontal de souris invalidées pour mGlu2, restaure de manière significative la réponse au tremblement de la tête induite par l'agoniste hallucinogène du récepteur 5-HT2A, le DOI. Les étapes les plus critiques de cette expérience sont le moment des injections virales, celui de la réponse au tremblement de la tête et celui de la mise à mort des souris.Tout retard peut modifier les résultats de l'expérience ou introduire une ambiguïté dans les données. Une fois maîtrisée, la chirurgie chez la souris prendra environ 30 minutes pour injecter le virus. L'expérience du tremblement de la tête devrait également prendre environ 35 minutes par souris.Il est recommandé d’espacer les chirurgies ou d’opérer plusieurs souris simultanément. Cela permet de respecter un calendrier qui rend possible la réalisation des expériences de secouement de la tête entre trois et quatre jours après la chirurgie, période correspondant au pic d’expression du vecteur viral. Merci d’avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.

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HSV-Mediated Expression du transgène de chimériques Constructs pour étudier la fonction Behavioral des GPCR hétéromères chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal

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