Une plate-forme personnalisée de microscopie multiphoton pour l’imagerie en direct de la cornée de souris et de la conjonctive
May 17th, 2020
Présenté ici est une plate-forme microscopique multiphoton pour l’imagerie de surface oculaire de souris vivante. La souris transgénique fluorescente permet la visualisation des noyaux cellulaires, des membranes cellulaires, des fibres nerveuses et des capillaires à l’intérieur de la surface oculaire. Les signaux non linéaires de deuxième génération harmonique dérivés de structures collagènes fournissent une imagerie sans étiquette pour les architectures stromales.
Ce protocole utilise un microscope multi-filtre pour l’imagerie en direct de toute la structure de la surface oculaire de la souris dans le modèle de souris transgénique fluorescente double. La combinaison d’une plate-forme microscopique multiphoton personnalisée et de souris transgéniques fluorescentes doubles permet la visualisation en temps réel de la surface oculaire et de sa structure. Pour configurer le microscope multiphoton, sélectionnez l’objectif immersion d’eau 20X, 1.00 NA et définissez le laser Sapphire de titane comme source d’excitation sur un microscope droit.
Réglez la longueur d’onde de sortie laser à 880 nanomètres pour EGFP et 940 nanomètres pour tdTomato. Inclure deux miroirs dichroïques pour la séparation de SHG EGFP et EGFP tdTomato et utiliser 434-17, 510-84 et 585-40 nanomètres bande filtres de passage pour séparer spectralement les signaux SHG EGFP et tdTomato. Pour installer le support oculaire, après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de la pédale chez une souris anesthésiée de 8 à 12 semaines, placez la souris sur le stade du microscope chauffé et insérez une sonde de surveillance de la température.
Placez la souris dans un porte-souris stéréotaxique personnalisé et insérez des barres d’oreille dans le meatus auditif externe. Utilisez une fixation à trois points pour fixer le porte-tête et appliquez une solution hydrochlorique et saline oxybuprocaine de 0,4 % sur la surface oculaire. Couvrez les extrémités d’une paire de forceps Dumont numéro cinq avec la boucle du tube PE.
Après trois minutes effectuer une rétractation manuelle des paupières pour confirmer la saillie du globe oculaire et placer soigneusement une boucle de tube de support PE le long de la marge des paupières pour exposer la surface oculaire. Et utilisez le bouton du support pour stabiliser le globe oculaire avec les forceps. Ensuite, couvrez la surface cornéenne avec un gel pour les yeux avec un indice réfractif de 1,338.
Pour l’imagerie en série Z de la surface cornéenne, utilisez une source de lumière mercure pour imager le champ de ciblage et ouvrir le logiciel microscope. Sélectionnez le multiplicateur photo approprié et les gains numériques pour visualiser la structure cellulaire dans la surface oculaire et définissez la première et la dernière diapositive pour permettre l’acquisition d’une pile d’images. Réglez la résolution d’image à 512 par 512 pixels et l’étape Z à un micromètre.
Ensuite, cliquez sur commencer à recueillir des images en série Z acquérir une image en direct avec une excitation de 880 nanomètres pour la collecte de signaux SHG EGFP, et une image en direct à une excitation de 940 nanomètres pour egfp tdTomato collecte de signaux dans chaque zone. Tout au long de l’image, utilisez le support de scène motorisé stepper pour faire pivoter le globe oculaire pour permettre l’imagerie sur toute la surface cornéenne. Lorsque toutes les images ont été acquises, chargez les images en série Z aux Fidji et sélectionnez le plugin de filtre 3D médian.
Après avoir supprimé le bruit de fond, sélectionnez le paquet filtre masque flou Fidji pour aiguiser les images et cliquez sur le contraste de luminosité automatique pour optimiser automatiquement la qualité des images. Après traitement, enregistrez les images sous forme de séquence d’image sérielle et exportez la séquence d’image dans un logiciel de reconstruction 3D approprié. Dans toutes les images de microscopie multiphoton, présenter les signaux EGFP tdTomato et SHG en pseudo vert, rouge et cyan respectivement avant de capturer les images de la structure 3D par instantané.
La microscopie multiphoton permet la visualisation de cellules superficielles de l’aile et du basal dans l’épithélium cornéen des souris transgéniques fluorescentes doubles. Les cellules simples de la couche basale peuvent être cartographiées à la couche superficielle ainsi que les cellules superficielles hexagonales simples. Comme l’a révélé l’expression cytoplasmique du signal tdTomato, le système vésiculaire intracellulaire riche en protéines membranaires, y compris l’appareil golgi et le réticulum endoplasmique, est dispersé dans les cellules de l’aile.
Dans le stroma collagenous, les coratesites en forme de stellate sont décrites par la membrane ciblant les fluorescents EGFP chez ces souris. Les coratesites incorporées dans le stroma collegen sont plus lâchement espacées que dans les cellules endothéliales. En outre, les nerfs ram ramissants minces dans le stroma cornéen peuvent également être visualisés par membrane ciblant des signaux de tdTomato et des monolayers endothéliales cornéens de cellules démontrent une forme hexagonale relativement homogène reliée dans un modèle alvéolé.
L’épithélium limbal se compose d’une à deux couches de cellules épithéliales. La double souche transgénique fluorescente reporter permet également l’imagerie des capillaires dans la conjonctive, facilitant la reconstruction de l’architecture 3D des capillaires décrivant l’endothélium vasculaire. Stabiliser le globe oculaire avec une pression modérée sans blessure est essentiel pour acquérir des images de bonne qualité car une pression insuffisante ou excessive peut compromettre la qualité de l’image.
Cette plate-forme d’imagerie d’image NVivo peut être modifiée pour la visualisation des structures sous la surface oculaire et peut être appliquée à des études in situ de diverses maladies ophtalmiques.
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Aperçu
Cet article présente une plateforme microscopique multiphotonique pour l'imagerie en direct de la surface oculaire de la souris en utilisant un modèle de souris transgénique fluorescente double. Le système permet la visualisation en temps réel de diverses structures cellulaires au sein de la surface oculaire.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neuroscience
- Ophtalmologie
- Microscopie
Contexte
- La microscopie multiphotonique est une technique d'imagerie puissante.
- Les souris transgéniques fluorescentes offrent une visualisation améliorée des composants cellulaires.
- Comprendre la structure de la surface oculaire est crucial pour diverses applications de recherche.
- Les techniques d'imagerie sans marquage peuvent compléter les méthodes fluorescentes.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode pour l'imagerie en direct de la surface oculaire de la souris.
- Utiliser un microscope multiphotonique personnalisé pour une visualisation améliorée.
- Démontrer les capacités des souris transgéniques fluorescentes doubles en matière d'imagerie.
Méthodes utilisées
- Configuration d'un microscope multiphotonique avec des objectifs spécifiques et des paramètres laser.
- Utilisation de miroirs dichroïques et de filtres passe-bande pour la séparation du signal.
- Imagerie en direct de souris anesthésiées sur un plateau de microscope chauffé.
- Visualisation en temps réel des structures de la surface oculaire.
Résultats principaux
- Imagerie réussie des noyaux cellulaires, des membranes et des fibres nerveuses.
- Imagerie sans marquage des architectures stromales en utilisant la génération de seconde harmonique.
- Démonstration de l'efficacité de la plateforme multiphotonique.
- Les capacités de visualisation en temps réel ont été validées.
Conclusions
- La plateforme microscopique multiphotonique est efficace pour l'imagerie oculaire.
- Les souris transgéniques fluorescentes doubles améliorent la visualisation des structures oculaires.
- Cette méthode peut faire progresser la recherche en biologie oculaire et dans les domaines connexes.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
This multiphoton microscopy platform enables live, label-free imaging of mouse ocular surface structures, providing critical insights into corneal and conjunctival biology for ophthalmic drug discovery. By visualizing cellular dynamics, stromal architecture, and vascular networks in vivo, the method supports mechanistic de-risking of therapeutic targets in preclinical models of ocular disease. The platform’s ability to image across the entire ocular surface with accurate positioning enhances predictive confidence in target validation and assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing cell nuclei, membranes, nerve fibers, and capillaries in live ocular tissue.
- Operational Value: Supports functional target validation through real-time observation of stromal architecture via second harmonic generation and cellular dynamics in dual fluorescent reporters.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by providing quantitative, reproducible readouts of structural and cellular changes in disease-relevant ocular models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enabling high-resolution imaging of epithelial, stromal, endothelial, and vascular compartments.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through precise Z-stack acquisition, spectral separation of SHG and fluorescent signals, and stabilized eyeball positioning.
- Strategic Value: Highlights screening readiness and platform reuse by allowing imaging across the entire corneal and conjunctival surface with minimal phototoxicity.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by enabling reconstruction of 3D capillary architecture in the conjunctiva and visualization of limbal epithelial layers.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by supporting intravital imaging with accurate positioning across ocular surface regions.
- Predictive Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by providing label-free stromal imaging and cellular mapping that inform mechanistic understanding of ocular pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical imaging, supporting hypothesis testing and mechanistic de-risking in ophthalmic research.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking by enabling live imaging of cellular and structural dynamics in the ocular surface.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, and quantitative outputs through Z-serial imaging, spectral signal separation, and stabilized imaging conditions.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions, including SHG for collagen architecture and tdTomato/EGFP for membrane and nuclear localization.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment by enabling 3D reconstruction of capillaries and epithelial layer mapping in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, adaptable to various ophthalmic disease models and imaging endpoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in ocular surface biology.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability through customized eye holder, stereotaxic staging, and controlled imaging parameters.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by enabling early visualization of target engagement and tissue response.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions through quantitative, label-free, and fluorescent readouts across corneal and conjunctival compartments.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in multiphoton microscopy, ocular anatomy, and transgenic model handling.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including titanium sapphire laser, dichroic mirrors, band pass filters, motorized stage, and 3D reconstruction software.
- Cross-team standardization requirements for imaging protocols, signal detection settings, and image processing pipelines (e.g., Fiji plugins for noise reduction and contrast enhancement).
- Adaptation considerations across model systems, including adjustment of eyelid stabilization, ocular surface coupling gel, and excitation wavelengths for different fluorescent reporters.
- Practical limitations supported by source material: stabilizing the eyeball with moderate pressure without injury is critical, as insufficient or excessive pressure compromises image quality.
