Une plate-forme personnalisée de microscopie multiphoton pour l’imagerie en direct de la cornée de souris et de la conjonctive
17 mai 2020
Présenté ici est une plate-forme microscopique multiphoton pour l’imagerie de surface oculaire de souris vivante. La souris transgénique fluorescente permet la visualisation des noyaux cellulaires, des membranes cellulaires, des fibres nerveuses et des capillaires à l’intérieur de la surface oculaire. Les signaux non linéaires de deuxième génération harmonique dérivés de structures collagènes fournissent une imagerie sans étiquette pour les architectures stromales.
Ce protocole utilise un microscope multi-filtre pour l’imagerie en direct de toute la structure de la surface oculaire de la souris dans le modèle de souris transgénique fluorescente double. La combinaison d’une plate-forme microscopique multiphoton personnalisée et de souris transgéniques fluorescentes doubles permet la visualisation en temps réel de la surface oculaire et de sa structure. Pour configurer le microscope multiphoton, sélectionnez l’objectif immersion d’eau 20X, 1.00 NA et définissez le laser Sapphire de titane comme source d’excitation sur un microscope droit.
Réglez la longueur d’onde de sortie laser à 880 nanomètres pour EGFP et 940 nanomètres pour tdTomato. Inclure deux miroirs dichroïques pour la séparation de SHG EGFP et EGFP tdTomato et utiliser 434-17, 510-84 et 585-40 nanomètres bande filtres de passage pour séparer spectralement les signaux SHG EGFP et tdTomato. Pour installer le support oculaire, après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de la pédale chez une souris anesthésiée de 8 à 12 semaines, placez la souris sur le stade du microscope chauffé et insérez une sonde de surveillance de la température.
Placez la souris dans un porte-souris stéréotaxique personnalisé et insérez des barres d’oreille dans le meatus auditif externe. Utilisez une fixation à trois points pour fixer le porte-tête et appliquez une solution hydrochlorique et saline oxybuprocaine de 0,4 % sur la surface oculaire. Couvrez les extrémités d’une paire de forceps Dumont numéro cinq avec la boucle du tube PE.
Après trois minutes effectuer une rétractation manuelle des paupières pour confirmer la saillie du globe oculaire et placer soigneusement une boucle de tube de support PE le long de la marge des paupières pour exposer la surface oculaire. Et utilisez le bouton du support pour stabiliser le globe oculaire avec les forceps. Ensuite, couvrez la surface cornéenne avec un gel pour les yeux avec un indice réfractif de 1,338.
Pour l’imagerie en série Z de la surface cornéenne, utilisez une source de lumière mercure pour imager le champ de ciblage et ouvrir le logiciel microscope. Sélectionnez le multiplicateur photo approprié et les gains numériques pour visualiser la structure cellulaire dans la surface oculaire et définissez la première et la dernière diapositive pour permettre l’acquisition d’une pile d’images. Réglez la résolution d’image à 512 par 512 pixels et l’étape Z à un micromètre.
Ensuite, cliquez sur commencer à recueillir des images en série Z acquérir une image en direct avec une excitation de 880 nanomètres pour la collecte de signaux SHG EGFP, et une image en direct à une excitation de 940 nanomètres pour egfp tdTomato collecte de signaux dans chaque zone. Tout au long de l’image, utilisez le support de scène motorisé stepper pour faire pivoter le globe oculaire pour permettre l’imagerie sur toute la surface cornéenne. Lorsque toutes les images ont été acquises, chargez les images en série Z aux Fidji et sélectionnez le plugin de filtre 3D médian.
Après avoir supprimé le bruit de fond, sélectionnez le paquet filtre masque flou Fidji pour aiguiser les images et cliquez sur le contraste de luminosité automatique pour optimiser automatiquement la qualité des images. Après traitement, enregistrez les images sous forme de séquence d’image sérielle et exportez la séquence d’image dans un logiciel de reconstruction 3D approprié. Dans toutes les images de microscopie multiphoton, présenter les signaux EGFP tdTomato et SHG en pseudo vert, rouge et cyan respectivement avant de capturer les images de la structure 3D par instantané.
La microscopie multiphoton permet la visualisation de cellules superficielles de l’aile et du basal dans l’épithélium cornéen des souris transgéniques fluorescentes doubles. Les cellules simples de la couche basale peuvent être cartographiées à la couche superficielle ainsi que les cellules superficielles hexagonales simples. Comme l’a révélé l’expression cytoplasmique du signal tdTomato, le système vésiculaire intracellulaire riche en protéines membranaires, y compris l’appareil golgi et le réticulum endoplasmique, est dispersé dans les cellules de l’aile.
Dans le stroma collagenous, les coratesites en forme de stellate sont décrites par la membrane ciblant les fluorescents EGFP chez ces souris. Les coratesites incorporées dans le stroma collegen sont plus lâchement espacées que dans les cellules endothéliales. En outre, les nerfs ram ramissants minces dans le stroma cornéen peuvent également être visualisés par membrane ciblant des signaux de tdTomato et des monolayers endothéliales cornéens de cellules démontrent une forme hexagonale relativement homogène reliée dans un modèle alvéolé.
L’épithélium limbal se compose d’une à deux couches de cellules épithéliales. La double souche transgénique fluorescente reporter permet également l’imagerie des capillaires dans la conjonctive, facilitant la reconstruction de l’architecture 3D des capillaires décrivant l’endothélium vasculaire. Stabiliser le globe oculaire avec une pression modérée sans blessure est essentiel pour acquérir des images de bonne qualité car une pression insuffisante ou excessive peut compromettre la qualité de l’image.
Cette plate-forme d’imagerie d’image NVivo peut être modifiée pour la visualisation des structures sous la surface oculaire et peut être appliquée à des études in situ de diverses maladies ophtalmiques.
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Aperçu
Cet article présente une plateforme de microscopie multiphoton pour l'imagerie en direct de la surface oculaire de la souris, utilisant un modèle de souris transgénique fluorescent double. Le système permet la visualisation en temps réel de diverses structures cellulaires au sein de la surface oculaire.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Ophtalmologie
- Microscopie
Contexte
- La microscopie multiphoton est une technique d'imagerie puissante.
- Les souris transgéniques fluorescentes permettent une visualisation améliorée des composants cellulaires.
- La compréhension de la structure de la surface oculaire est cruciale pour diverses applications de recherche.
- Les techniques d'imagerie sans marquage peuvent compléter les méthodes fluorescentes.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode d'imagerie en direct de la surface oculaire de la souris.
- Utiliser un microscope multiphoton sur mesure pour une visualisation améliorée.
- Montrer les capacités des souris transgéniques à double fluorescence en imagerie.
Méthodes utilisées
- Configuration d'un microscope à photons multiples avec des objectifs et des réglages laser spécifiques.
- Utilisation de miroirs dichroïques et de filtres passe-bande pour la séparation des signaux.
- Imagerie en temps réel chez des souris anesthésiées sur une platine chauffée du microscope.
- Visualisation en temps réel des structures de la surface oculaire.
Résultats principaux
- Imagerie réussie des noyaux cellulaires, des membranes et des fibres nerveuses.
- Imagerie sans marquage des architectures stromales à l'aide de la génération de seconde harmonique.
- Démonstration de l'efficacité de la plateforme à photons multiples.
- Les capacités de visualisation en temps réel ont été validées.
Conclusions
- La plateforme de microscopie multiphotonique est efficace pour l'imagerie oculaire.
- Les souris transgéniques fluorescentes doubles améliorent la visualisation des structures oculaires.
- Cette méthode peut faire progresser la recherche en biologie oculaire et dans les domaines connexes.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans l'industrie
Cette plateforme de microscopie multiphoton permet l'imagerie en direct et sans marquage des structures de la surface oculaire de la souris, offrant des informations essentielles sur la biologie de la cornée et de la conjonctive dans le cadre de la découverte de médicaments ophtalmiques. En visualisant les dynamiques cellulaires, l'architecture du stroma et les réseaux vasculaires in vivo, cette méthode soutient la détection mécanistique des cibles thérapeutiques dans les modèles précliniques de maladies oculaires. La capacité de la plateforme à imager l'ensemble de la surface oculaire avec un positionnement précis renforce la fiabilité prédictive dans les processus de validation des cibles et de développement des tests.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en visualisant les noyaux cellulaires, les membranes, les fibres nerveuses et les capillaires dans un tissu oculaire vivant.
- Valeur opérationnelle : Soutient la validation fonctionnelle des cibles grâce à l'observation en temps réel de l'architecture stromale par génération de seconde harmonique et des dynamiques cellulaires à l'aide de double capteurs fluorescents.
- Valeur prédictive : Améliore le tri des projets en fournissant des lectures quantitatives et reproductibles des modifications structurelles et cellulaires dans des modèles oculaires pertinents pour la maladie.
Développement de tests et de criblages
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés pour des flux opérationnels en aval en permettant une imagerie haute résolution des compartiments épithélial, stromal, endothélial et vasculaire.
- Valeur opérationnelle : Répond à la standardisation des tests et à la reproductibilité grâce à une acquisition précise de piles en Z, à la séparation spectrale des signaux de génération de seconde harmonique (SHG) et des signaux fluorescents, ainsi qu'à une stabilisation de la position du globe oculaire.
- Valeur stratégique : Met en évidence la préparation au criblage et la réutilisation de la plateforme en permettant l'imagerie de toute la surface cornéenne et conjonctivale avec une phototoxicité minimale.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Aborde la pertinence pour la maladie en permettant la reconstruction de l'architecture capillaire tridimensionnelle dans la conjonctive et la visualisation des couches épithéliales limbiques.
- Valeur opérationnelle : Décrit la continuité entre la découverte et la validation préclinique en soutenant l'imagerie intravitale avec un positionnement précis sur différentes régions de la surface oculaire.
- Valeur prédictive : Répond aux décisions d'avancement ajustées au risque en fournissant une imagerie stromale sans marquage et une cartographie cellulaire qui éclairent la compréhension mécanistique des pathologies oculaires.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'intègre dans la chaîne de découverte, depuis la validation précoce de cibles jusqu'à l'imagerie préclinique, en soutenant les tests d'hypothèses et la réduction des risques mécanistiques dans la recherche ophtalmologique.
- Découverte en biologie : Explique comment la méthode soutient la vérification d'hypothèses, l'élucidation des voies biologiques et la réduction des risques biologiques en permettant l'imagerie en direct des dynamiques cellulaires et structurales à la surface oculaire.
- Essais de criblage : Décrit la préparation des tests, leur reproductibilité et leurs résultats quantitatifs grâce à l’imagerie en série Z, à la séparation spectrale des signaux et à des conditions d’imagerie stabilisées.
- Analyse : Met en évidence les mesures, les lectures ou les résultats statistiques qui aident les équipes à comparer différentes conditions, notamment la génération de seconde harmonique (SHG) pour l’architecture du collagène et les signaux tdTomato/EGFP pour la localisation membranaire et nucléaire.
- Recherche translationnelle : Relie la méthode à la continuité préclinique ou à l’alignement sur des biomarqueurs en permettant la reconstruction tridimensionnelle des capillaires et la cartographie des couches épithéliales dans des modèles pertinents pour la maladie.
- Réutilisation institutionnelle : Présente la méthode comme une capacité réutilisable plutôt qu’une technique à usage unique, adaptable à divers modèles de maladies ophtalmiques et à différents critères d’imagerie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive, validation des cibles, réduction des ambiguïtés mécanistiques en biologie de la surface oculaire.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et évolutivité grâce à un support oculaire personnalisé, un positionnement stéréotaxique et des paramètres d'imagerie contrôlés.
- Valeur stratégique : Meilleures décisions de poursuite ou d'abandon, efficacité du capital et réduction des risques biologiques en phase avancée, grâce à la visualisation précoce de l'interaction avec la cible et de la réponse tissulaire.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation et décisions d'avancement ajustées au risque, à l'aide de signaux quantitatifs, sans marquage et fluorescents, dans les compartiments cornéens et conjonctivaux.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Expertise scientifique requise en microscopie multiphotonique, en anatomie oculaire et en manipulation de modèles transgéniques.
- Besoins en instrumentation et en infrastructure analytique, notamment un laser au saphir dopé au titane, des miroirs dichroïques, des filtres passe-bande, une platine motorisée et un logiciel de reconstruction 3D.
- Exigences de standardisation entre équipes pour les protocoles d'imagerie, les réglages de détection du signal et les chaînes de traitement d'images (par exemple, greffons Fiji pour la réduction du bruit et l'amélioration du contraste).
- Considérations d'adaptation selon les systèmes modèles, incluant l'ajustement de la stabilisation des paupières, du gel de couplage de la surface oculaire et des longueurs d'onde d'excitation pour différents marqueurs fluorescents.
- Limites pratiques appuyées par les données disponibles : stabiliser le globe oculaire avec une pression modérée sans provoquer de lésion est essentiel, car une pression insuffisante ou excessive compromet la qualité de l'image.
