Une méthode simplifiée pour les ultra-basse densité, à long terme primaire hippocampique Neuron Culture

L'objectif général de cette procédure est d'établir des cultures saines et à long terme de neurones hippocampiques primaires de souris à très faible densité, afin de faciliter l'étiquetage par immunocytochimie et l'étude des mécanismes cellulaires neuronaux autonomes. Cette étude peut aider à comprendre certaines questions clés dans le domaine de la recherche en neurosciences, telles que les études sur la spécificité des protéines dans la neuromorphologie ou le fonctionnement du développement. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet aux neurones de croître à très faible densité sur un lamelle sans le soutien d'une couche de cellules gliales nourricières.

La procédure sera démontrée par Mariel Piechowicz, une étudiante de mon laboratoire. Préparez deux plaques 24 puits à haute densité et deux plaques 24 puits à faible densité. À l’aide d’une aiguille de calibre 28, rayez le fond des plaques 24 puits afin que les plastiques déplacés servent de support aux lamelles sur lesquelles poussent des neurones à faible densité.

Transférez les lamelles de verre stériles dans les deux plaques de 24 puits désignées pour les cultures à faible densité. Recouvrez les quatre plaques de 300 microlitres de poly-D-lysine à 0,1 milligramme par millilitre dilué dans un tampon borate, puis remettez-les dans l'incubateur pour un revêtement par incubation nocturne. Avant la collecte du tissu, préparez deux boîtes de Pétri de 10 centimètres remplies d'HBSS stérile glacé.

Sous le microscope, maintenir l'embryon par le cou avec la pince et effectuer la première incision exactement sur la ligne médiane, au-dessous du niveau du cervelet. Ensuite, pratiquer une incision sur le côté gauche de la base du crâne. Puis, réaliser une autre incision sur le côté droit de la base du crâne.

Laisser une petite partie du tissu osseux du crâne et du tissu cutané à l'extrémité rostrale non coupée afin que l'ensemble du cerveau puisse être retourné facilement pour l'extraction. Transférer maintenant le cerveau dans la solution HBSS. Examiner le cerveau pour s'assurer qu'il est intact et ne présente aucune région grossièrement sectionnée.

Ensuite, répétez les procédures pour recueillir le reste des cerveaux embryonnaires dans une nouvelle boîte de Pétri contenant 20 millilitres de tampon HBSS froid. Placez chaque cerveau avec la face ventrale vers le haut. Tout en maintenant le cerveau avec une pince à l’extrémité caudale, effectuez une incision en diagonale entre le point rostral médian et la région temporale caudale à l’aide d’une pince fine et pointue.

Répétez cette opération pour l'autre hémisphère. Ensuite, séparez les deux hémisphères avec l'hippocampe intact du reste des tissus du tronc cérébral. Répétez les procédures pour tous les cerveaux et regroupez ensemble tous les hémisphères disséqués.

Ensuite, retirez les méninges à l’aide de deux paires de pinces. Identifiez l’hippocampe en formation comme une structure courbée repliée à l’intérieur du lobe temporal et séparez-le des tissus corticaux adjacents. Récupérez et regroupez tous les tissus d’hippocampe ensemble.

Dans cette procédure, transférez tous les hippocampes disséqués dans la solution de digestion enzymatique contenue dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, placez le tube dans un bain-marie et incubez à 37 degrés Celsius pendant 25 minutes. Après 25 minutes, retirez soigneusement la solution enzymatique.

Ensuite, ajoutez cinq millilitres de milieu de lavage tiède pour obtenir un volume total de 10 millilitres. Lavez délicatement le tissu en retournant lentement le tube cinq fois. Éliminez le milieu de lavage et ajoutez à nouveau 10 millilitres de milieu de lavage, pour un lavage supplémentaire.

Ensuite, retirez le milieu de lavage et ajoutez à nouveau trois millilitres de milieu de lavage chaud et frais. Agitez vigoureusement le tube à la main 15 fois pour détacher les neurones digérés du tissu. Le milieu doit devenir trouble une fois que les cellules se sont séparées du tissu et sont entrées dans le milieu de lavage.

Ensuite, recueillir la suspension cellulaire dans un nouveau tube conique de 15 millilitres, en laissant le tissu restant dans le tube. Puis, ajouter deux autres millilitres de milieu de lavage au tissu et dissocier délicatement le tissu restant par trituration avec une pipette en plastique 15 fois. Laisser reposer la suspension cellulaire pendant cinq minutes avant de la rassembler dans un nouveau tube conique de 15 millilitres contenant les cellules obtenues par agitation.

Ensuite, compter la densité de neurones à l’aide d’un hémocytomètre. Calculer le volume de suspension cellulaire nécessaire pour obtenir une densité de 250 000 neurones par millilitre, puis l’ajouter à l’un des deux tubes coniques contenant 30 millilitres de milieu de culture complet, afin d’obtenir un milieu de culture neuronal à haute densité. Transférer 1,2 millilitre de cette solution neuronale à haute densité dans 30 millilitres supplémentaires de milieu de culture complet, afin d’obtenir une concentration de 10 000 neurones par millilitre, et utiliser cette solution pour ensemencer les lamelles à faible densité.

Dans cette procédure, placez des plaques de 24 puits avec fond gravé pour les neurones à haute densité dans la hotte de culture. Retirez 300 microlitres du milieu préconditionné par aspiration, puis ensemencez 0,6 millilitre de suspension cellulaire à haute densité à raison de 250 000 neurones par millilitre. Placez les deux autres plaques de 24 puits contenant des lamelles dans la hotte de culture.

Retirer 300 microlitres du milieu préconditionné par aspiration, avant de déposer 0,6 millilitre de suspension cellulaire à faible densité à raison de 10 000 neurones par millilitre sur les lamelles. Ensuite, replacer les quatre plaques 24 puits dans l’incubateur et incuber pendant deux heures. Par la suite, retourner les lamelles à faible densité portant les neurones vers la culture à haute densité, en veillant à ce que les neurones soient face à face.

Par la suite, remettez les deux plaques en co-culture dans l’incubateur. Alimentez les co-cultures en ajoutant 300 microlitres de milieu de culture frais au cinquième jour in vitro (DIV). Après ce premier apport, ajoutez chaque semaine 300 microlitres de milieu de culture frais sans arabinoside de cytosine dans chaque puits.

Si la culture doit être maintenue pendant plus d'un mois, remplacez la moitié du milieu par du milieu de culture frais chaque semaine après le délai d'un mois. Sur le plan morphologique, les neurones à forte densité comme ceux à faible densité doivent présenter un aspect sain jusqu'à trois mois. Ici, un marquage par immunocytochimie est utilisé pour révéler les synapses glutamatergiques fonctionnelles, dans lesquelles la sous-unité du récepteur NMDA, NR1, et la sous-unité du récepteur ApoE, GluR1, sont marquées par double coloration.

Et les synapses fonctionnelles peuvent être facilement identifiées et quantifiées à l'aide d'ImageJ. Les neurones à faible densité sont également marqués par un anticorps dirigé contre la protéine dendritique MARQUEUR MAP2 en combinaison avec le marqueur protéique axonal p-Tau. Ce double marquage permet une distinction claire entre dendrites et axones. Les cultures à faible densité peuvent également être transfectées avec succès à l'aide de plasmides d'ADN par la méthode au phosphate de calcium, bien que le taux de transfection soit généralement très faible aux stades tardifs.

Cette figure illustre que la transfection par EGFP peut révéler la morphologie neuronale et rendre visibles les fines structures des épines dendritiques. Enfin, à titre de preuve de concept, des neurones à très faible densité peuvent être cultivés dans des conditions favorisant la formation d'autapses. Ces neurones autaptiques à très faible densité, cultivés sur des micro-îlots revêtus de poly-D-lysine, peuvent être maintenus au-delà de deux mois grâce à ce protocole de co-culture à l'aide de neurones nourriciers à haute densité.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois heures le jour de la culture cellulaire, à condition qu'elle soit effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel de recouvrir les lamelles en verre et le fond des plaques à 24 puits de poly-D-lysine. Une simple gravure du fond des plaques suffit à assurer un soutien mécanique et nutritionnel permettant aux neurones hippocampiques à faible densité de croître sur les lamelles.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment cultiver des neurones hippocampiques primaires embryonnaires de souris à très faible densité, en l'absence d'une couche de cellules gliales servant de support nourricier. Nous espérons que vous pourrez utiliser cette méthode à des fins expérimentales personnelles.