Une méthode simplifiée pour les ultra-basse densité, à long terme primaire hippocampique Neuron Culture

L’objectif global de cette procédure est d’établir des cultures saines à long terme de neurones primaires de l’hippocampe de souris à très faible densité, afin de faciliter le marquage immunocytochimique et l’étude des mécanismes autonomes des cellules neuronales. Cette étude peut aider à comprendre certaines questions clés dans le domaine de la recherche en neurosciences, telles que les études sur la spécificité des protéines dans la neuromorphologie de la fonction du développement. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet aux neurones de se développer à une densité ultra-faible sur une lamelle sans le soutien d’une couche nourricière gliale.

La démonstration de la procédure sera faite par Mariel Piechowicz, une étudiante de mon laboratoire. Préparez deux plaques à 24 puits à haute densité et deux plaques à faible densité. À l’aide d’une aiguille de calibre 28, gravez le fond des plaques à 24 puits, de sorte que les plastiques déplacés servent de support aux lamelles sur lesquelles se développent des neurones de faible densité.

Transférez les lamelles en verre stérile dans les deux plaques à 24 puits conçues pour les cultures à faible densité. Enduire les quatre plaques de 300 microlitres de poly-D-lysine diluée dans un tampon de borate et les remettre dans l’incubateur pour un enrobage d’incubation pendant la nuit. Avant le prélèvement de tissus, préparez deux boîtes de Pétri de 10 centimètres remplies de HBSS stérile et glacé.

Au microscope, tenez l’embryon par le cou à l’aide de la pince et faites la première incision sur la ligne médiane, sous le niveau du cervelet. Par la suite, faites une incision sur le côté gauche de la base du crâne. Ensuite, faites une autre incision sur le côté droit de la base du crâne.

Laissez une petite partie de l’os du crâne et du tissu cutané à l’extrémité rostrale non coupée afin que tout le cerveau puisse être retourné pour l’extraction facilement. Transférez maintenant le cerveau dans la solution HBSS. Inspectez le cerveau pour vous assurer qu’il est intact sans régions coupées grossières.

Ensuite, répétez les procédures pour recueillir le reste du cerveau de l’embryon dans une nouvelle boîte de Pétri contenant 20 millilitres de tampon HBSS froid. Positionnez chaque cerveau avec la face ventrale vers le haut. Tout en maintenant le cerveau avec une pince à l’extrémité caudale, faites une coupe en diagonale entre le point rostral moyen et la région temporale caudale avec une pince à épiler pointue.

Répétez cette opération pour l’autre hémisphère. Ensuite, séparez les deux hémisphères avec l’hippocampe intact du reste des tissus souches du cerveau. Répétez les procédures pour tous les cerveaux et regroupez tous les hémisphères disséqués.

Ensuite, retirez les méninges à l’aide de deux paires de pinces à épiler. Identifiez l’hippocampe en développement comme une structure incurvée qui est repliée à l’intérieur du lobe temporal et séparez-le des tissus corticaux adjacents. Collectez et regroupez tous les tissus de l’hippocampe.

Dans cette procédure, transférez tous les hippocampes disséqués dans la solution de digestion enzymatique dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, placez le tube dans un bain-marie et incubez à 37 degrés Celsius pendant 25 minutes. Après 25 minutes, retirez délicatement la solution enzymatique.

Ensuite, ajoutez cinq millilitres de produit de lavage chaud pour porter le volume total à 10 millilitres. Lavez doucement le mouchoir en inversant lentement le tube cinq fois. Retirez le produit de lavage et ajoutez à nouveau 10 millilitres de produit de lavage, pour un lavage supplémentaire.

Après cela, retirez le produit de lavage et ajoutez à nouveau trois millilitres de produit de lavage frais et chaud. Secouez rigoureusement le tube à la main 15 fois pour déloger les neurones digérés du tissu. Le milieu doit devenir trouble une fois que les cellules sont séparées du tissu dans le milieu de lavage.

Ensuite, collectez la suspension cellulaire dans un nouveau tube conique de 15 millilitres, tout en laissant le tissu restant dans le tube. Après cela, ajoutez encore deux millilitres de produit de lavage au mouchoir et séparez doucement le tissu restant en triturant 15 fois avec une pipette en plastique. Laissez la suspension cellulaire reposer pendant cinq minutes avant de la regrouper dans un nouveau tube conique de 15 millilitres qui contient les cellules de secousse collectées.

Ensuite, comptez la densité des neurones à l’aide d’un hémocytomètre. Calculez le volume de suspension cellulaire nécessaire pour produire une densité de 250 000 neurones par millilitre, et ajoutez-le à l’un des deux tubes coniques contenant 30 millilitres de milieu de culture complet, pour obtenir un milieu de placage de neurones à haute densité. Transférez 1,2 millilitre de cette solution de neurones à haute densité dans 30 autres millilitres de milieu de culture complet, pour obtenir une concentration de 10 000 neurones par millilitre, et utilisez cette solution pour ensemencer les lamelles de couverture à faible densité.

Dans cette procédure, placez des plaques à 24 puits avec des fonds gravés pour les neurones à haute densité dans le capot de culture. Retirez 300 microlitres du milieu préconditionné par le vide, puis plaquez 0,6 millilitre de suspension cellulaire à haute densité à 250 000 neurones par millilitre. Placez les deux autres plaques de 24 puits avec des lamelles dans le capot de culture.

Retirez 300 microlitres du milieu préconditionné par vide, avant de plaquer 0,6 millilitre de suspension cellulaire à faible densité à 10 000 neurones par millilitre sur les lamelles de couverture. Ensuite, remettez les quatre plaques de 24 puits dans l’incubateur et incubez pendant deux heures. Après cela, retournez les lamelles de couverture à faible densité avec les neurones adhérents à la culture à haute densité et assurez-vous que les neurones sont face à face.

Par la suite, remettez les deux plaques avec co-culture dans l’incubateur. Nourrissez les co-cultures en ajoutant 300 microlitres de milieu d’alimentation frais à la DIV cinq. Après cette première alimentation, ajoutez 300 microlitres de milieu d’alimentation frais sans cytosine arabinoside dans chaque puits chaque semaine.

Si la culture est conservée pendant plus d’un mois, remplacez la moitié du milieu par du milieu frais chaque semaine au-delà d’un mois. Morphologiquement, les neurones à haute densité et à faible densité devraient sembler sains jusqu’à trois mois. Ici, le marquage immunocytochimique est utilisé pour révéler les synapses glutamatergiques fonctionnelles dans lesquelles la sous-unité NR1 du récepteur NMDA et la sous-unité du récepteur ApoE GluR1 sont marquées par une double coloration.

Et les synapses fonctionnelles peuvent être facilement identifiées et quantifiées à l’aide de l’image J.Les neurones de basse densité sont également marqués avec un anticorps contre le marqueur protéique dendritique MAP2 en combinaison avec le marqueur protéique axonal p-Tau. Ce double marquage permet de distinguer clairement les dendrites et les axones. Les cultures à faible densité peuvent également être transfectées avec succès avec des plasmides d’ADN en utilisant des méthodes de phosphate de calcium, bien que le taux de transfection soit généralement très faible aux stades ultérieurs.

Cette figure illustre que la transfection de l’EGFP peut révéler la morphologie neuronale et rendre visibles les structures fines de l’épine dendritique. Enfin, en tant que preuve de concept, des neurones à très faible densité peuvent être cultivés dans des conditions qui favorisent la formation d’autapse. Ces neurones autaptiques à ultra-faible densité, cultivés sur des micro-îlots enrobés de poly-D-lysine, peuvent être maintenus par les neurones nourriciers à haute densité jusqu’à au-delà de deux mois avec ce protocole de co-culture.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois heures le jour de la culture cellulaire si elle est bien réalisée. Lors de cette procédure, il est essentiel d’enduire les lamelles de verre et les fonds de plaque à 24 puits de Poly-D-lysine. Une simple gravure du fond des plaques est suffisante pour fournir un soutien mécanique et nutritionnel aux neurones de l’hippocampe à faible densité qui se développent sur les lamelles.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver des neurones embryonnaires de l’hippocampe embryonnaire de souris primaires à très faible densité, en l’absence d’une couche nourricière gliale. J’espère que vous pourrez utiliser cette méthode à des fins expérimentales.