A miniaturisé Glycan Microarray Assay pour l'évaluation Avidité et Spécificité du virus grippal A Hémagglutinines

L’objectif global de cette matrice de glycanes miniaturisée est d’analyser la spécificité et l’avidité des hémagglutinines du virus de la grippe A. Ce test peut aider à répondre à des questions clés concernant la liaison et l’avidité des récepteurs du virus de la grippe A. Le principal avantage de cette technique est qu’au sein d’un seul essai, nous pouvons aborder la spécificité ainsi que l’avidité de liaison relative, ce qui n’est normalement pas obtenu dans les tests typiques sur puce de glycanes et sur plaque.

Ce protocole commence par la préparation des échantillons de glycanes. La solution de base pour les glycanes est un tampon d’impression qui, une fois fabriqué, doit être lentement titré à un pH de 8,5, puis ajouté un tensioactif. À l’aide du tampon d’impression préparé, diluez les glycanes conjugués au PAA à 100 microgrammes par millilitre.

Ensuite, diluez les glycanes monovalents à 100 micromolaires également dans le tampon d’impression. Enfin, faites des stocks de travail des colorants fonctionnalisés aux amines à une micromolaire. Chargez maintenant dix microlitres de chaque échantillon de glycane dans un puits d’une plaque de microtitration de 384 puits.

C’est une solution suffisante pour imprimer cinq diapositives. Transférez également dix microlitres du marqueur de colorant dans un puits de la plaque d’impression. Préparez l’impression des matrices en positionnant d’abord les broches de la matrice et la tête d’impression en fonction de la disposition.

Dans ce cas, une broche peut imprimer tous les échantillons. Les réseaux de glycanes sont imprimés par blocs de six entourés d’un espace vide sur tous les côtés. Mettez des gants pour manipuler les toboggans.

Déballez-les et soufflez tous les débris de leurs surfaces avec de l’azote gazeux d’ultra haute pureté. Ensuite, positionnez les diapositives côté couché vers le haut sur la platine de l’arrayer. Ensuite, programmez le arrayer.

Dans ce cas, programmez 27 spots par visite à la plaque source. Trois pré-spots placés sur la zone non matricielle d’une lame recouverte de poly-L-lysine sont utilisés pour éliminer l’excès de liquide à l’extrémité de la broche. Les 24 autres points par visite d’épingle sont utilisés pour placer six points dans quatre réseaux répliqués.

Les détails sont fournis dans le protocole texte. Maintenant, chargez les plaques multipuits dans l’imprimante et commencez à imprimer les matrices. Pendant l’impression, assurez-vous que l’humidité reste entre 55 et 65 %Faites attention à l’apparence des pré-taches sur les lames recouvertes de poly-L-lysine.

Après l’impression, inspectez visuellement chaque diapositive. Vérifiez l’alignement correct des taches à l’intérieur des bordures en téflon, ce qui est essentiel, et vérifiez le bon nombre de caractéristiques tachetées. Pour aider à homogénéiser la fixation des points, placez les diapositives imprimées dans une chambre d’humidité à 100 % avec leur côté imprimé vers le haut immédiatement après leur fabrication.

Utilisez du papier absorbant humide pour tapisser un récipient et une grille de fortune. Enveloppez la chambre dans du plastique pour emprisonner l’humidité. Au bout d’une demi-heure, retirez les lames.

Ensuite, numérotez les lames à l’aide d’un marqueur résistant aux solvants et conservez-les dans une boîte de dessiccation pendant la nuit. Le lendemain, préparez un nouveau stock de tampon de blocage en remuant vigoureusement. Ajustez le pH de 9,2 à l’aide d’hydroxyde de sodium concentré.

Ensuite, incubez les lames dans le tampon pendant une heure. Pour retirer le bloc, rincez les lames dans de l’eau doublement distillée. Ensuite, transférez les lames dans des supports de coloration en verre et chargez les supports dans un support de plaque oscillant pour faire essorer les lames à 10 G pendant cinq minutes.

Une fois sèches, si nécessaire, conservez les lames à moins 20 degrés Celsius dans des sacs en plastique scellés. En préparation, faites une autre chambre d’humidification comme précédemment. Pour détecter les glycanes immobilisés, préparez des lectines biotinylées SNA et ECA à 10 microgrammes par millilitre dans un tampon de sonde, et ajoutez deux microgrammes par millilitre de streptavidine 555 à chaque dilution.

Pour colorer avec les hémagglutinines, préparez une solution de 20 microgrammes par millilitre d’anticorps pré-complexes dans un tampon de blocage à un rapport molaire de quatre à deux pour un, comme décrit dans le protocole de texte. Transférez 20 microlitres des solutions préparées dans les puits d’une plaque de 384 puits. Ensuite, diluez en série les lectines et les hémagglutinines une à une dans leurs tampons appropriés.

Faites huit dilutions, en remplissant chaque puits avec 10 microlitres d’échantillon et 10 microlitres de tampon. Maintenant, incubez l’assiette sur de la glace pendant 30 minutes. Ajoutez maintenant huit microlitres de chaque dilution dans l’un des 48 micropuits sur une lame imprimée.

Ensuite, incubez la lame préparée dans la chambre d’humidification pendant 90 minutes. Après 90 minutes, lavez la lame en la tenant par le bord ; trempez-le quatre fois dans PBS-T, puis trempez-le quatre fois dans PBS et enfin, trempez-le quatre fois dans de l’eau désionisée. Maintenant, essorez la diapositive comme précédemment.

Après l’essorage, scannez immédiatement la lame. Assurez-vous de charger soigneusement la diapositive dans le scanner dans le bon sens. À l’aide d’une faible puissance laser de cinq milliwatts, numérisez de manière itérative les lames, en augmentant progressivement le gain de 25 à 75 %Tout en optimisant les paramètres de numérisation, gardez à l’esprit que les fluorophores blanchiront avec des balayages répétés.

Analysez l’image enregistrée pour relier les signaux à l’aide du logiciel associé. Une liste de tableaux peut être chargée qui a le motif de repérage. Superposez-le sur le balayage pour faciliter l’emplacement des marqueurs de la grille.

Ensuite, utilisez le logiciel pour analyser les intensités ponctuelles et enregistrer les résultats sous forme de fichier texte délimité par des tabulations à exporter dans une feuille de calcul ou un autre progiciel statistique. Analysez les données en calculant l’intensité moyenne du signal moins le bruit de fond. Prenez en moyenne quatre des six points répétés pour chaque échantillon, en omettant le signal le plus élevé et le signal le plus bas.

Ensuite, produisez un graphique linéaire du signal moyen moyen moins le bruit de fond par rapport aux huit concentrations de protéines. Lissez la ligne résultante à l’aide de la régression non linéaire. La puce PAA a été utilisée pour évaluer la spécificité de liaison au récepteur des hémagglutinines du virus de la grippe A.

Le réseau comprenait des témoins non sialylés dans les mêmes micropuits. Des lectines végétales dont les spécificités sont connues pour les composés imprimés ont été utilisées comme témoins positifs. La lectine ECA liée au galactose bêta terminal 1-4 s’est liée à l’anacétylglucosamine et ne s’est pas liée au même composé si le galactose terminal était coiffé d’acide sialique.

Pour tester l’acide sialique lié à l’alpha 2-6, la lectine SNA a été utilisée. Comme prévu, le SNA ne s’est lié qu’aux acides sialiques liés aux acides alpha 2-6, mais avec des différences notables d’affinité pour les répétitions de lacNAc de colorant liées à l’AAP et non liées à l’AAP. Ensuite, une hémagglutinine H5 dérivée d’un virus Vietnam/1203/04 qui ne reconnaît que les acides sialiques liés à l’alpha 2-3 a été testée.

Le profil de liaison de l’hémagglutinine H5 a montré la spécificité attendue avec une avidité plus élevée pour les structures liées à l’AAP. Enfin, l’hémagglutinine H1 d’une souche saisonnière humaine H1N1 a été testée. Comme prévu, cette hémagglutinine ne s’est liée qu’aux structures contenant de l’acide sialique alpha 2-6.

Une fois maîtrisée, cette technique permet de révéler les spécificités de liaison et les avidités relatives des virus grippaux au sein d’un seul essai. Cette technique améliorera considérablement l’efficacité des tests de liaison à la grippe et réduira la consommation de produits biologiques précieux.