A miniaturisé Glycan Microarray Assay pour l'évaluation Avidité et Spécificité du virus grippal A Hémagglutinines

L'objectif général de cette matrice de glycan miniaturisée est d'analyser la spécificité et l'avidité des hémagglutinines du virus de la grippe A. Ce test peut aider à répondre à des questions clés concernant la liaison réceptrice et l'avidité du virus de la grippe A. Le principal avantage de cette technique est qu'au sein d'un seul test, nous pouvons évaluer à la fois la spécificité et l'avidité relative de la liaison, ce qui n'est généralement pas possible avec les dosages classiques basés sur des matrices de glycan ou des plaques.

Ce protocole commence par les préparatifs des échantillons de glycanes. La solution de base pour les glycanes est un tampon de dépôt stock qui, une fois préparé, doit être lentement titré jusqu'à un pH de 8,5, puis complété par un ajout de tensioactif. À l'aide du tampon de dépôt préparé, diluez les glycanes conjugués au PAA à 100 microgrammes par millilitre.

Ensuite, diluez les glycanes monovalents à 100 micromolaire également dans le tampon d'impression. Enfin, préparez des stocks de travail des colorants fonctionnalisés par une amine à une micromolaire. Chargez maintenant dix microlitres de chaque échantillon de glycanes dans un puits d'une plaque microtitration de 384 puits.

Cette quantité de solution suffit pour imprimer cinq lames. Transférez également dix microlitres du marqueur colorant dans un puits de la plaque d'impression. Préparez l'impression des matrices en positionnant d'abord les broches de la matrice et la tête d'impression selon la disposition prévue.

Dans ce cas, une seule broche peut imprimer tous les échantillons. Les matrices de glycanes sont imprimées en blocs de six, entourés d'un espace vide de tous les côtés. Mettez des gants pour manipuler les lames.

Déballez-les et soufflez tout débris présent sur leurs surfaces à l'aide d'un gaz d'azote d'ultra-haute pureté. Ensuite, placez les lames, côté revêtement vers le haut, sur la platine de l'automate. Puis programmez l'automate.

Dans ce cas, le programme prévoit 27 points par passage sur la plaque source. Trois points préliminaires placés sur la zone non destinée au réseau d'analyse d'une lame revêtue de poly-L-lysine servent à éliminer l'excès de liquide à l'extrémité de l'aiguille. Les 24 autres points par passage d'aiguille sont utilisés pour déposer six points dans quatre réseaux d'analyse en réplicat.

Les détails sont fournis dans le protocole écrit. Chargez maintenant les plaques multi-puits dans l'imprimante et commencez l'impression des matrices. Pendant l'impression, veillez à ce que l'humidité reste comprise entre 55 et 65 %. Portez une attention particulière à l'apparence des pré-taches sur les lames revêtues de poly-L-lysine.

Après l'impression, inspectez visuellement chaque lame. Vérifiez l'alignement correct des points à l'intérieur des bordures en téflon, ce qui est essentiel, ainsi que le nombre correct de points imprimés. Pour favoriser l'homogénéisation de l'adhérence des points, placez immédiatement les lames imprimées dans une chambre à humidité à 100 %, côté imprimé vers le haut, dès qu'elles sont prêtes.

Utilisez des serviettes en papier humides pour tapisser un récipient et un support de fortune. Enveloppez la chambre dans du plastique pour retenir l'humidité. Après une demi-heure, retirez les lames.

Ensuite, numéroter les lames à l’aide d’un marqueur résistant aux solvants et les conserver dans une boîte de dessiccation pendant toute la nuit. Le jour suivant, préparer un stock frais de tampon de blocage en agitant vigoureusement. Ajuster le pH à 9,2 à l’aide d’hydroxyde de sodium concentré.

Ensuite, incuber les lames dans le tampon pendant une heure. Pour éliminer le blocage, rincer les lames à l'eau doublement distillée. Puis, transférer les lames dans des porte-lames en verre et charger les porte-lames dans un support rotatif afin de sécher les lames par centrifugation à 10 G pendant cinq minutes.

Une fois secs, si nécessaire, conserver les lames à moins 20 degrés Celsius dans des sacs en plastique scellés. En préparation, préparer une autre chambre d'humidification comme précédemment. Pour détecter les glycanes immobilisés, préparer les lectines biotinylées SNA et ECA à 10 microgrammes par millilitre dans du tampon de sondage, et ajouter deux microgrammes par millilitre de streptavidine 555 à chaque dilution.

Pour la coloration avec les hémagglutinines, préparez une solution à 20 microgrammes par millilitre d'anticorps pré-complexe dans du tampon de blocage selon un rapport molaire de quatre pour deux pour un, comme décrit dans le protocole du texte. Transférez 20 microlitres des solutions préparées dans des puits d'une plaque de 384 puits. Ensuite, diluez sérialement les lectines et les hémagglutinines un-à-un dans leurs tampons respectifs.

Préparez huit dilutions, en remplissant chaque puits avec 10 microlitres d'échantillon et 10 microlitres de tampon. Incubez ensuite la plaque sur de la glace pendant 30 minutes. Ajoutez ensuite huit microlitres de chaque dilution à l'un des 48 micropuits d'une lame imprimée.

Ensuite, incuber la lame préparée dans la chambre d'humidification pendant 90 minutes. Après 90 minutes, laver la lame en la tenant par le bord : la plonger dans du PBS-T quatre fois, puis dans du PBS quatre fois, et enfin dans de l'eau déionisée quatre fois. À présent, sécher la lame par centrifugation comme précédemment.

Après séchage par centrifugation, numérisez immédiatement la lame. Veillez à charger soigneusement la lame dans le scanner en respectant l'orientation correcte. Numérisez les lames de manière itérative en utilisant une faible puissance laser de cinq milliwatts, en augmentant progressivement le gain de 25 à 75 %. Lors de l'optimisation des paramètres de numérisation, gardez à l'esprit que les fluorophores s'éteindront avec des numérisations répétées.

Analyser l'image enregistrée pour les signaux de liaison à l'aide du logiciel associé. Une liste de puces peut être chargée, contenant le motif de dépôt. Superposez-la au scan pour faciliter la navigation lors du positionnement des marqueurs de grille.

Ensuite, utilisez le logiciel pour analyser les intensités des taches et enregistrez les résultats dans un fichier texte délimité par des tabulations afin de les exporter vers un tableur ou un autre logiciel statistique. Analysez les données en calculant l'intensité moyenne du signal moins le fond. Faites la moyenne de quatre des six taches répliquées pour chaque échantillon, en excluant le signal le plus élevé et le signal le plus faible.

Ensuite, produisez un graphique linéaire représentant le signal moyen moyen moins le fond en fonction des huit concentrations protéiques. Lissez la courbe obtenue à l'aide d'une régression non linéaire. Le réseau PAA a été utilisé pour évaluer la spécificité de liaison des hémagglutinines du virus de la grippe A aux récepteurs.

Le dispositif comprenait des témoins non sialylés dans les mêmes micropuits. Des lectines végétales aux spécificités connues pour les composés imprimés ont été utilisées comme témoins positifs. La lectine ECA s'est liée au galactose terminal bêta 1-4 lié à l'acétylglucosamine et ne s'est pas liée au même composé si le galactose terminal était bloqué par un acide sialique.

Pour tester l'acide sialique lié en alpha 2-6, la lectine SNA a été utilisée. Comme prévu, la SNA s'est liée uniquement aux acides sialiques liés en alpha 2-6, mais avec des différences notables d'affinité entre les répétitions de lacNAc marquées par un colorant lié au PAA et celles non liées au PAA. Ensuite, une hémagglutinine H5 provenant d'un virus Vietnam/1203/04, qui ne reconnaît que les acides sialiques liés en alpha 2-3, a été testée.

Le profil de liaison de l'hémagglutinine H5 a montré la spécificité attendue, avec une avidité plus élevée pour les structures liées au PAA. Enfin, l'hémagglutinine H1 provenant d'une souche saisonnière humaine H1N1 a été testée. Comme prévu, cette hémagglutinine ne s'est liée qu'aux structures contenant des acides sialiques liés par une liaison alpha 2-6.

Une fois maîtrisée, cette technique permet de révéler les spécificités de liaison et les avidités relatives des virus de la grippe dans un seul et même test. Cette méthode améliorera considérablement l'efficacité des tests de liaison de la grippe tout en réduisant la consommation de réactifs biologiques précieux.