Name: A miniaturisé Glycan Microarray Assay pour lévaluation Avidité et Spécificité du virus grippal A Hémagglutinines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Découvrez une méthode de microarray glycanique miniaturisé pour analyser l'avidité et la spécificité des hémagglutinines du virus influenza A. Cette technique permet d'évaluer simultanément la liaison réceptrice et l'avidité dans un seul essai.

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Ce travail a été soutenu en partie par le Fonds Scripps Microarray Core et un contrat par les Centers for Disease Control (PCE). RPDV est un bénéficiaire d&#39;une subvention Rubicon et VENI de l&#39;Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO). Le Consortium pour Glycomics fonctionnels (http://www.functionalglycomics.org/) financé par NIGMS subvention GM62116 (JCP) a fourni plusieurs glycanes utilisés dans cette étude. Ceci est la publication 29113 de The Scripps Research Institute.

Remarque: Toutes les étapes sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire. 1. Tableau de construction <ol><li> Glycan Préparation et installation de la plaque <ol><li> Préparer un stock de tampon d&#39;impression. Faites d&#39;abord 500 ml d&#39;une solution 150 mM stock de phosphate de sodium dibasique. Assurez-vous également 50 ml d&#39;une solution 150 mM stock de monobasique solution de phosphate de sodium. Dans un ballon, en utilisant une barre d&#39;agitation magnétique et d&#39;un pH-mètre, titrer lentement la solution dibasique de phosphate de sodium monobasique avec la solution jusqu&#39;à ce qu&#39;un pH de 8,5 soit atteint. Ajouter du Tween-20 à 0,005%. </li><li> Préparer les échantillons glycanes. Diluer PAA glycanes conjugués, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-AAP) et 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (figure 1A )) doivent être dilués à 100 ug / ml dans un tampon d&#39;impression à partir step1.1.1. glycanes monovalents,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH 2) 3 NH 2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2) et 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2)) à 100 pM dans du tampon d&#39;impression à l&#39; étape 1.1.1. Enfin, préparer les colorants à fonction amine, à utiliser comme marqueurs de la grille / feux d&#39;atterrissage. Dye taches de marquage sont imprimés à 1 uM. NOTE: Atto488-NHS colorant est utilisé dans nos impressions. Cependant, tout colorant à fonction amine, pouvant être lu par le scanner de diapositives est approprié à cet effet. </li><li> Transfert de 10 ul de chaque échantillon de glycane à des plaques de microtitrage à 384 puits, utilisé pour le robot d&#39;impression. Magasin glycanes inutilisés dans une solution tampon d&#39;impression à -20 ° C dans des tubes scellés. Tansfer 10 ul du marqueur de colorant sur la plaque d&#39;impression. </li></ol></li><li> Impression NOTE: Toutes les steps qui concernent le toucher ou déplacer les diapositives doivent être effectuées avec des gants. <ol><li> Placez Arrayer épingles dans la tête d&#39;impression en fonction de la configuration correcte de la mise en page. Pour cette mise en page en utilisant une broche pour imprimer tous les échantillons et les tableaux. Imprimer les glycanes en blocs de six, en sautant une caractéristique (une caractéristique est définie comme point unique d&#39;un certain composé), de chaque côté, de telle sorte que les taches du même échantillon ne sont pas imprimés exactement à côté de l&#39;autre. NOTE: L&#39;utilisateur final doit décider de la configuration. </li><li> Retirer les lames des sacs, des boîtes ouvertes, et éliminer toutes les particules de poussière ou de petits morceaux de plastique qui pourraient être sur leurs surfaces en soufflant de l&#39;azote gazeux ultra-pur sur chaque diapositive. Placez le nombre désiré de diapositives, côté enduite vers le haut, sur la scène arrayer. </li><li> Programmer le arrayer, utilisez les paramètres de 27 points par visite à la plaque source, en utilisant 3 &quot;pré-taches&quot; sur des lames revêtues de poly-L-lysine, pour éliminer l&#39;excès de liquide à la pointe des aiguilles d&#39;impression <ol><li> Allumez MPU (unité d&#39;alimentation principale) et l&#39;unité de contrôle du climat. Ouvrez le logiciel d&#39;analyse Carreleurs sur ordinateur. </li><li> Sélectionnez la mise en page à l&#39;impression. Sélectionnez Options → Outil Pin à utiliser pour l&#39;impression de la matrice 1 x 1 outil d&#39;impression - 1 seule broche. Sélectionnez l&#39;onglet Cible → Outil Tableau Définition → Motif d&#39;impression et d&#39;ajouter de la hauteur (spot à spot à distance), le nombre de lignes et de colonnes pour accueillir les échantillons à imprimer, et le motif d&#39;impression des échantillons (pour ce tableau 8 x 8 impression motif est utilisé à 340 pas de um pour 7 échantillons au total). </li><li> Sélectionnez Target → Mise en page des diapositives et programmer la distance de bloc à bloc pour permettre l&#39;impression de chaque tableau répliquée dans le 48 puits (4 x 12) modèle de diapositive. Sélectionnez Source et ajoutez le nombre de micros source (1 pour chaque échantillon lors de l&#39;utilisation 1 broches) (pour cette impression 7 micros source sera utilisée pour accueillir 6 puits d&#39;échantillon et 1 marqueur de colorant ainsi). NOTE: Le dialogue source doit devenir vert pour montrer que le nombredes visites de source correspondent aux échantillons à imprimer dans le modèle d&#39;impression. </li><li> Sélectionnez Target → Adapter Plate et Glisser la mise en page et d&#39;ajuster le nombre de diapositives (5 diapositives sont imprimées à la fois pour cette impression avec 1 pré-détachage slide). </li><li> Relâchez le plateau en cliquant sur le bouton T1 pour activer le plateau et ajouter le nombre souhaité de diapositives sur le plateau, en accordant une attention particulière aux endroits de la glissière pré-spotting (BLEU) et les diapositives «réelles». </li><li> Placez les lames de verre lisses sur tous les ports de vide restant à bloquer le vide et cliquez sur OK pour activer le vide. Vérifiez que toutes les diapositives sont maintenus en place et cliquez sur OK pour revenir le plateau à la position de la maison. </li><li> Chargez la plaque d&#39;impression dans le support de plaque et assurer le rack est correctement réglé en place. Cliquez sur GO et permettre le processus d&#39;impression de procéder. </li></ol></li><li> Imprimer les 24 places restantes dans les répétitions de 6 points par matrice (4 tableaux / visite de la source). </li><li> Charger les plaques à 384 puitsdans l&#39;imprimante et lancer l&#39;impression. Maintenir l&#39;humidité relative, pendant l&#39;impression, tout au long de l&#39;impression entre 55 et 65%. L&#39;imprimante arrête après l&#39;impression 5 diapositives. NOTE: Bien que le microréseau dans cet essai a été imprimé en 8 x 8 modèle spécifique, différents robots d&#39;impression de microréseau nécessiteront une programmation spécifique de l&#39;équipement pour réaliser la mise en page souhaitée. Il appartient à l&#39;utilisateur final afin de déterminer le modèle le plus approprié étant donné les caractéristiques de leurs équipements. </li></ol></li><li> Humidification / Immobilisation NOTE: Une fois que les diapositives ont terminé l&#39;impression, ils subissent une étape d&#39;immobilisation temporaire, appelée aussi humidifier. Humidification post-impression permet d&#39;homogénéiser l&#39;échantillon de fixation par re-mouillant les taches et en assurant un blocage complet. <ol><li> Placer les lames dans une chambre d&#39;humidité à 100% immédiatement après l&#39;impression pendant une période de 30 min. Construire la chambre en plaçant des serviettes en papier très humides plat dans le fond d&#39;un grand plat en verre, en plaçant les diapositivessur une sorte de rack, comme un porte-tube à essai, imprimer vers le haut, et d&#39;étanchéité avec une pellicule de plastique pour piéger l&#39;humidité. </li><li> Nombre glisse avec un alcool / solvant résistant à la plume de marquage et de stocker dans une boîte de dessiccation. Dessécher durant la nuit. </li></ol></li><li> Numérotation, blocage, et stockage <ol><li> Préparer le tampon de blocage - éthanolamine 50 mM dans 50 mM de tampon borate. Tout d&#39; abord, dissoudre l&#39; acide borique, en ddH 2 O, à une concentration finale de 50 mM dans un flacon contenant un barreau d&#39;agitation magnétique. Remuer vigoureusement la solution sur une plaque d&#39;agitation jusqu&#39;à ce que tout solide soit dissous. Tout en remuant constamment, ajouter la quantité appropriée d&#39;éthanolamine à partir d&#39;une solution 16,54 M d&#39;actions pour atteindre la concentration désirée 50 mM. Ajouter de l&#39;hydroxyde de sodium concentré pour ajuster à un pH final de 9,2. </li><li> Immerger les lames imprimées dans la solution de tampon de blocage pendant 1 h. </li><li> Après 1 h, rincer les lames dans ddH 2 O pour éliminer toute trace de tampon de blocage en excès.Eliminer le tampon de blocage dans un conteneur à déchets approprié. </li><li> Transférer les lames aux porteurs de coloration du verre et essorer. tableaux secs en les plaçant dans une centrifugeuse équipée de supports de plaques battantes, à une vitesse de 10 g pendant 5 min. </li><li> Une fois les lames sont sèches, elles peuvent être incubées immédiatement ou stockées. Les conditions de stockage sont de -20 ° C dans un sac en plastique scellé. </li></ol></li></ol> 2. Analyse des protéines de liaison Glycan <ol><li> Préparer une chambre humidifiée dans laquelle les tableaux à hybrider conviendra. Une chambre simple, se compose d&#39;un plat en pyrex, en couches sur le fond avec des serviettes en papier humide et un support, sur lequel les diapositives reposeront. </li><li> Utilisez lectines biotinylées SNA (Sambuca nigra agglutinine) et la CEA (Erythrina de agglutinine cristagalli) à 10 pg / ml + 2 pg / ml de streptavidine-555 colorant, dans un tampon de sondage (PBS + 0,01% de Tween-20). Pour HA (A / Vietnam / 1203-1204 H5N1 et A / KY / 07 H1N1, dans cet exemple), l&#39;utilisationune concentration initiale de 20 ug / ml de pré-complexé, 34 comme décrit précédemment. En bref, faire un HA: Souris-α-Strep: mélange chèvre-α-Mouse-Alexa647 dans un tampon de blocage (PBS + BSA à 3% + 0,01% de Tween-20), à un rapport de 4: 1 molaire: 2. REMARQUE: La matrice est sondé avec des lectines de vérifier que les glycanes sont immobilisés et détectables (figure 1B). </li><li> Transférer la solution de glycane de liaison de protéine-anticorps mélange de 20 pl sur une plaque à 384 puits et laisser incuber sur de la glace pendant 30 minutes. Dilué en série des échantillons lectine et HA 1: 1, dans leur tampon approprié, 8 fois, en mélangeant 10 ul d&#39;échantillon avec 10 pi de tampon. </li><li> Pipette 8 pi de l&#39;échantillon sur la surface micro-puits et incuber dans la chambre d&#39;humidification étanche (100% HR) pendant 90 min. </li><li> Laver les lames une par une en tenant les bords et les plongeant quatre fois dans un mélange de PBS et de Tween à 0,05%, puis quatre fois dans du PBS, et finalement quatre fois dans H 2 O déminéralisée En utilisantle même protocole de séchage décrit à l&#39;étape de blocage, les matrices de spin sec dans une centrifugeuse pendant 5 mn à 10 x g. </li></ol> 3. Numérisation et Analyses de données NOTE: Les microarrays glycanes peuvent être numérisés à différents paramètres, selon le fabricant du scanner de puces à ADN. En faisant varier la puissance et la résolution laser, l&#39;instrument peut produire une image avec autant de signaux que possible dans sa gamme dynamique (figure 1C). <ol><li> Utilisez un scanner de diapositives fluorescent et analyser les tableaux immédiatement après incubation avec les protéines de liaison glycanes. Prenez soin d&#39;assurer la glissière est correctement insérée dans l&#39;appareil de balayage. <ol><li> un logiciel de balayage ouvert. Cliquez sur Démarrer pour ouvrir le programme. Connectez-vous à scanner: Scanner → Connect ou le bouton vert dans le menu du panneau de navigation du scanner. </li><li> porte ouverte autoloader du scanner. Placer les lames dans les fentes dans autochargeur ordre spécifique. Fermer la porte de l&#39;autochargeur. Click &quot;lire loader&quot; dans le panneau Outils de navigation pour détecter automatiquement les diapositives dans le scanner. </li><li> Paramètre scan Set: paramètres Scanner → numérisation appropriés à l&#39;expérience (par exemple , 635 puissance laser élevée, le gain de détection de 50%). diapositives de numérisation: Scanner → numérisation. Sélectionnez le chemin en créant un dossier pour enregistrer les images numérisées et nom scans individuels. Pour ce faire, avant la numérisation réelle. Répéter pour chaque diapositive. Cliquez sur OK pour lancer la numérisation. </li></ol></li><li> Utilisez le logiciel du scanner pour mettre en place l&#39;instrument et de numériser les diapositives. Réglez le scanner pour numériser itérativement à la puissance laser faible (5 mW) avec l&#39;augmentation de réglages de gain de 25%, 50% et 75%. REMARQUE: Les paramètres peuvent être testés et optimisés, mais gardez à l&#39;esprit que chaque balayage peut éventuellement réduire la sortie de fluorescence des colorants en raison de photoblanchiment. <ol><li> acquisition de données ouvertes et des logiciels d&#39;analyse tels que les logiciels Mapix. Cliquez sur Démarrer pour ouvrir le programme. Ouvrir l&#39;image scan: Fichier → im ouvertâge. fichier GAL Ouvrir: Analyser → grille ouverte et sélectionnez le fichier de liste d&#39;adresses globale appropriée. </li><li> Entrer en mode blocs: le mode image → blocs pour déplacer la grille. Utilisez les marqueurs de la grille pour définir la grille à l&#39;emplacement approprié sur la diapositive. Ajuster les blocs individuels que nécessaire pour correspondre au tableau imprimé. </li><li> Entrer en mode de spots: Image → Mode de spots pour régler l&#39;emplacement et la taille des taches individuelles au sein du bloc. Une fois que tous les blocs et les taches sont ajustées et en place, mesure des intensités du signal Analyser par des calculs photométriques →. Enregistrez le fichier de sortie. </li></ol></li><li> Une fois que les diapositives ont terminé la numérisation, les images sont analysées pour les signaux de liaison avec le programme de traitement d&#39; image installée (Figure 1D - G). Pour l&#39;analyse d&#39;image, charger un fichier GAL (Array List) sur l&#39;image TIFF numérisée. REMARQUE: Le fichier GAL contient à la fois le modèle et les identités de chaque emplacement spot layout place. fichiers GAL pour les tableaux sont created par le logiciel de l&#39;imprimante en utilisant un fichier texte délimité par des tabulations qui contient l&#39;identité des échantillons et leur emplacement dans la plaque source 384 puits. </li><li> Utilisez les lumières marqueur / d&#39;atterrissage de la grille imprimée sur les microarrays pour placer correctement la grille de GAL. peuvent avoir besoin de points individuels à déplacer individuellement, mais un tableau bien imprimé généralement permettre à des blocs dans la grille à placer avec facilité. Après le placement de la grille, de recueillir des intensités spot par le logiciel et enregistré en tant que fichier texte délimité par des tabulations (.txt). <ol><li> Utilisation du programme tableur, ouvrez le fichier de sortie du scanner. Ouvrez le fichier macro approprié dans l&#39;emplacement du dossier. Cliquez sur Afficher → Macro → RunMacro. NOTE: La pré-écrite copie les données brutes de sortie, supprimer des lignes et des colonnes inutiles, trier les données par exemple, calculer les valeurs moyennes de fond de signaux moins moyennes et tracer les valeurs résultantes pour une feuille de tableur contenant les graphiques pour chaque des six samples tester sur le tableau. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à révéler

Évaluer IAV la spécificité du récepteur est une étape importante dans l&#39;analyse de potentiel pandémique de virus aviaires. la reconnaissance de l&#39;acide sialique par le virus est lié à plusieurs propriétés biologiques telles que la liaison et la libération à partir de la cellule. La connaissance des mutations qui en acides aminés sont nécessaires pour les virus aviaires pour atteindre α2-6 de liaison et traversent la barrière des espèces permet la préparation aux pandémies. Plusieurs essais sont utilisées pour dé...

Les oiseaux aquatiques sauvages sont le réservoir naturel pour IAV, mais IAV est capable de traverser la barrière des espèces pour la volaille et les mammifères, y compris les humains. IAV aviaire reconnaissent α2-3 acides sialiques liés (récepteurs de type aviaire), alors que les virus humains se lient α2-6 acides sialiques liés (récepteurs de type humain). Pour être en mesure de se répliquer efficacement et transmettre entre les humains un IAV aviaire a besoin de se lier à de type humain récepteurs 1. IAVs sont divisés sur la base de tests sérologiques qui caractérise l&#39;antigénicité de l&#39;hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA), les glycoprotéines d&#39;enveloppe. HA se lie aux acides sialiques, tandis que NA est l&#39;enzyme détruisant le récepteur à l&#39;autre extrémité du cycle de vie viral et clive l&#39; acide sialique 2. Tous les virus infectant l&#39; homme, y compris la grippe H1N1, H2N2 et H3N2, ont une origine aviaire 3. Au cours des deux décennies plusieurs aviaire aux croisements humains dernière ont eu lieu, avec le virus H5N1, H7N7 et H7N9 étant le plus connu; however, d&#39; autres sous - types ont infecté des humains de façon plus sporadique (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Heureusement, il semble qu&#39;aucun de ces virus ont été en mesure d&#39;adapter pleinement à l&#39; acide sialique de type humain récepteurs α2-6 liés 5-8. Adaptation des virus zoonotiques aviaire ou d&#39;autres pour accueillir la réplication et la transmission dans des hôtes humains pourraient avoir un effet dévastateur sur la santé humaine. Par conséquent, la connaissance préalable de la façon dont ces virus évoluent pour lier les récepteurs de type humain contribuera à la surveillance mondiale des virus émergents de la grippe. Détermination de la préférence des récepteurs a été élucidée en utilisant érythrocytes d&#39;espèces différentes et reste un essai privilégié entre les chercheurs de la grippe 9-12. La démonstration que les virus aviaires reconnaissent l&#39;acide sialique α2-3 et virus humains α2-6 liés acide sialique a été basée sur un essai utilisant hémagglutination des érythrocytes enzymatiquement conçus pour contenir chacun des linkages 13,14. Bien que la lecture est hémagglutination, un essai standard pour virologues, les structures glycanniques sous-jacentes ne sont pas définies, seule la liaison terminal. En outre, la disponibilité limitée des sialyltransférases, utilisés pour re-sialyler les cellules, ont limité l&#39;utilisation de ce test 15-18. Par la suite, d&#39; autres méthodes permettant de déterminer les préférences de liaison au récepteur ont été introduites en utilisant des structures de glycanes sialylés liés à la poly-acrylamide (PAA) ou poly-glutamate (PGA) dans des analyses basées sur des structures en forme de plaque 19,20. Plusieurs variantes sont possibles dans le revêtement soit glycanes ou des virus dans des plaques de microtitrage, dont chacune résulte en un dosage de type ELISA robuste, fiable et très sensible 21-23. En variante, les glycanes liés à la biotine peuvent remplacer PAA / PGA et peuvent être conjugués à des plaques revêtues de streptavidine 2,24. Bien que certains sérums spécifiques peuvent être nécessaires, ELISA sont glycanes standard et plusieurs liés à l&#39;AAP sont facilement commercially et non-disponibles dans le commerce (Consortium for Functional Glycomics (http://www.functionalglycomics.org)). Technologies de microréseaux Glycan ont émergé comme un outil précieux pour déterminer la spécificité du récepteur, comme plusieurs glycanes différents sont repérés, et se lier à un large éventail de différentes structures peuvent être évaluées dans un seul essai 25-29. La liaison de l&#39; IAV à ces structures fournit une meilleure compréhension des structures glycanniques que IAV reconnaît préférentiellement 30-33. microarrays Glycan nécessitent de petites quantités de volume d&#39;échantillon pour effectuer une analyse de liaison et utilise uniquement des quantités infimes de glycane par point (2 nl). Cependant, ces réseaux sont généralement utilisés seulement pour évaluer la spécificité des glycanes récepteurs. L&#39;analyse de plusieurs virus ou des protéines d&#39;hémagglutinine, à différents intervalles de concentration peut être prohibitif en raison du nombre des lames nécessaires. En outre, à ce jour, aucun test relatif avidement a été développé en utilisant ar glycanedes techniques de rayons. Pour combiner l&#39;exigence de l&#39;échantillon à faible offerte par les techniques de microréseaux glycanes et la sensibilité des glycanes de l&#39;AAP liés dans des essais basés sur ELISA, nous avons cherché à développer une gamme glycanes multi-puits qui permettrait d&#39;analyse à haut débit avec une résolution similaire ou mieux par rapport le dosage traditionnel à base d&#39;ELISA. En même temps, nous voulions minimiser la quantité de produits biologiques et les produits chimiques rapporteurs consommés. Le résultat final est un test de avidement miniaturisé, spécialement développé pour la surveillance de la spécificité IAV et est également applicable pour évaluer d&#39;autres protéines de liaison glycanes. L&#39;utilisation d&#39;une lame de verre séparé en 48 micro-puits par un masque de Teflon, 6 glycanes différents sont repérés en 6 répétitions par puits. La plate-forme de puces à ADN offrent les mêmes tendances dans la liaison au récepteur vu dans le format macro ELISA avec plusieurs avantages. Celles-ci comprennent (i) l&#39;impression du composé en 6 réplicats, en utilisant un minimum de l&#39;échantillon, par rapport au revêtement de plusieurs lignes iplaque na, en utilisant 100 pi par puits; (II) plusieurs composés différents analysés simultanément dans un seul puits, y compris les contrôles; (III) une diminution massive du volume d&#39;incubation et; (IV) une plage dynamique plus large en utilisant un affichage fluorescent. Une seule diapositive peut être calculée comme équivalente à 18x plaques à 96 puits. Avec le protocole suivant, tout laboratoire capable de fabriquer et d&#39;analyse des microréseaux repérés devraient être capables de fabriquer ce format ELISA miniaturisé.

<table><tbody><tr><td>NEXTERION&reg ; Diapositive H MPX-48&nbsp ;</td><td>Schott</td><td>1091525</td><td>Microwell lames</td></tr><tr><td>ProScanArray Plus&nbsp ;</td><td>PerkinElmer</td><td>n’a plus été produit du</td><td>scanner à microréseaux confocaux</td></tr><tr><td>Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software</td><td></td> <td>Scanner à microréseaux confocaux</td><td>Innopsys</td></tr> <tr><td>MicroGrid II&nbsp ;</td><td>Digilab-imprimante</td><td></td> <td>microaray</td></tr><tr><td>SNA</td><td>Vector Labs</td><td>B-1305&nbsp ;</td><td>Lectine végétale</td></tr><tr><td>ECA</td><td>Vector Labs</td><td>B-1145&nbsp ;</td><td>Lectine végétale</td></tr><tr><td>Anticorps anti-streptocoque</td><td>IBA</td><td>2-1509-001&nbsp ;</td><td>Boîtier pour fixation HA</td></tr><tr><td>Anti-souris Alexa-647</td><td>Life</td><td>A-21235</td><td>Anitbody pour liaison HA</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287&nbsp ;</td><td>Détergent</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Sigma</td><td>255793</td><td>composant tampon d’impression</td></tr><tr><td>monobasique Phosphate de sodium</td><td>Sigma</td><td>229903&nbsp ;</td><td>Composant tampon d’impression</td></tr><tr><td>solution de poly-l-lysine</td><td>Sigma</td><td>P8920&nbsp ;</td><td>Composant de diapositive de pré-repérage</td></tr><tr><td>hydroxyde de sodium</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td>composant de lame de pré-repérage</td></tr><tr><td>éthanol</td><td>Sigma</td><td>493546</td><td>composant de lame de pré-repérage</td></tr> solution <tr><td>saline tamponnée au phosphate</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td>Tampon d’incubation/lavage</td></tr><tr><td>Broches SMP4B Goupille</td><td>d’impression</td><td>Telechem</td><td>SMP4B</td></tr><tr><td>Azote comprimé (Grade5)</td><td>Praxair</td><td>UN1066</td><td>outil général de dépoussiérage/séchage</td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Sigma</td><td>B6768-500G</td><td>Réactif de blocage de lames</td></tr><tr><td>éthanolamine</td><td>Sigma</td><td>E9508-500ML</td><td>Réactif de blocage de lames</td></tr><tr><td>Atto 488</td><td>AttoTec</td><td>AD 488-91</td><td>Marqueur de grille sur matrice</td></tr><tr><td>Consortium PAA-LNLN</td><td>pour la glycomique fonctionnelle</td><td>PA368</td><td>Glycanes tachetés</td></tr><tr><td>Consortium PAA-3SLNLN</td><td>pour Glycomanes fonctionnelles</td><td>PA362</td><td>Glycanes tachetés</td></tr><tr><td>PAA-6SLNLN</td><td>Consortium pour la glycomique fonctionnelle</td><td>PA343</td><td>Consortium</td></tr><tr><td>LNLN</td><td>pour la glycomique fonctionnelle</td><td>Te98</td><td>Glycanes tachetés</td></tr><tr><td>3SLNLN</td><td>Consortium pour la glycomique fonctionnelle</td><td>Te175</td><td>Glycanes tachetés</td></tr><tr><td>6SLNLN</td><td>Consortium pour la glycomique fonctionnelle</td><td>Te176</td><td>Glycanes tachetés</td></tr><tr><td>Plaque de microtitration à 384 puits</td><td>Matrix TechCorp</td><td>4361</td><td>Plaque d’impression</td></tr><tr><td>Marqueur de laboratoire</td><td>VWR</td><td>VWR 52877-150</td><td>Numérotation des lames</td></tr><tr><td>Wheaton Plat de coloration des lames</td><td>Sigma</td><td>Z103969-1EA</td><td>Blocage et séchage</td></tr></tbody></table>

a miniaturisé glycan microarray assay pour l&#39;évaluation avidité et spécificité du virus grippal a hémagglutinines

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Le virus grippal A (IAV) hémagglutinines reconnaissent les acides sialique sur la surface de la cellule en tant que récepteurs fonctionnels pour pénétrer dans les cellules. Les oiseaux aquatiques sauvages sont le réservoir naturel pour IAV, mais IAV peut traverser la barrière des espèces pour la volaille, les porcs, les chevaux et les humains. Les virus aviaires reconnaissent l&#39;acide sialique attaché à un avant-dernier galactose par une liaison α2-3 (récepteurs de type aviaire), alors que les virus humains reconnaissent de préférence l&#39;acide sialique avec une liaison α2-6 (récepteurs de type humain). Pour contrôler si les virus aviaires s&#39;adaptent aux récepteurs de type humain, plusieurs méthodes peuvent être utilisées. microarrays Glycan avec diverses bibliothèques de sialosides synthétiques sont de plus en plus utilisés pour évaluer la spécificité du récepteur. Cependant, cette technique n&#39;a pas été utilisée pour mesurer avidités. Mesure de l&#39;avidité est généralement obtenue en évaluant la liaison de l&#39;hémagglutinine ou un virus dilué en série à glycanes adsorbés polypropylène plaques à 96 puits classiques. Dans cet essai, avec α glycanes2-3 ou α2-6 acides sialiques sont couplés à la biotine et adsorbés sur des plaques de streptavidine ou sont couplées à polyacrylamide (PAA), qui adsorbe directement à la matière plastique. Nous avons considérablement miniaturisé cet essai en imprimant directement sialosides PAA liés et leurs homologues non PAA lié sur des lames de verre micro-puits. Ce set-up, avec 48 tableaux sur une seule diapositive, permet des dosages simultanés de 6 glycane protéines de liaison à 8 dilutions, interrogeant 6 glycanes différents, y compris deux témoins non sialylés. Ceci est équivalent à 18x plaques à 96 puits dans le dosage de plaque classique. Le format de tableau glycane diminue la consommation de composés et des produits biologiques et améliore l&#39;efficacité ainsi grandement.

Impression, numérisation et analyses de données Pour imprimer correctement, il est essentiel d&#39;avoir un alignement correct de la grille repérée dans le masque de téflon, qui délimite chaque tableau sur la diapositive. Pendant l&#39;impression, en raison de la nature du revêtement de téflon, les taches ne sont pas visibles à l&#39;oeil nu sur les glissières MPX. L&#39;attention est portée ensuite à l&#39;apparition des pré-...

À l’aide d’une stratégie de microréseau de glycanes imprimée, un test conventionnel sur plaque à 96 puits a été miniaturisé pour l’analyse de l’avidité de l’hémagglutinine du virus de la grippe A et de la spécificité des récepteurs contenant de l’acide sialique.

A miniaturisé Glycan Microarray Assay pour l&#39;évaluation Avidité et Spécificité du virus grippal A Hémagglutinines

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

L'objectif général de cette matrice de glycan miniaturisée est d'analyser la spécificité et l'avidité des hémagglutinines du virus de la grippe A. Ce test peut aider à répondre à des questions clés concernant la liaison réceptrice et l'avidité du virus de la grippe A. Le principal avantage de cette technique est qu'au sein d'un seul test, nous pouvons évaluer à la fois la spécificité et l'avidité relative de la liaison, ce qui n'est généralement pas possible avec les dosages classiques basés sur des matrices de glycan ou des plaques.Ce protocole commence par les préparatifs des échantillons de glycanes. La solution de base pour les glycanes est un tampon de dépôt stock qui, une fois préparé, doit être lentement titré jusqu'à un pH de 8,5, puis complété par un ajout de tensioactif. À l'aide du tampon de dépôt préparé, diluez les glycanes conjugués au PAA à 100 microgrammes par millilitre.Ensuite, diluez les glycanes monovalents à 100 micromolaire également dans le tampon d'impression. Enfin, préparez des stocks de travail des colorants fonctionnalisés par une amine à une micromolaire. Chargez maintenant dix microlitres de chaque échantillon de glycanes dans un puits d'une plaque microtitration de 384 puits.Cette quantité de solution suffit pour imprimer cinq lames. Transférez également dix microlitres du marqueur colorant dans un puits de la plaque d'impression. Préparez l'impression des matrices en positionnant d'abord les broches de la matrice et la tête d'impression selon la disposition prévue.Dans ce cas, une seule broche peut imprimer tous les échantillons. Les matrices de glycanes sont imprimées en blocs de six, entourés d'un espace vide de tous les côtés. Mettez des gants pour manipuler les lames.Déballez-les et soufflez tout débris présent sur leurs surfaces à l'aide d'un gaz d'azote d'ultra-haute pureté. Ensuite, placez les lames, côté revêtement vers le haut, sur la platine de l'automate. Puis programmez l'automate.Dans ce cas, le programme prévoit 27 points par passage sur la plaque source. Trois points préliminaires placés sur la zone non destinée au réseau d'analyse d'une lame revêtue de poly-L-lysine servent à éliminer l'excès de liquide à l'extrémité de l'aiguille. Les 24 autres points par passage d'aiguille sont utilisés pour déposer six points dans quatre réseaux d'analyse en réplicat.Les détails sont fournis dans le protocole écrit. Chargez maintenant les plaques multi-puits dans l'imprimante et commencez l'impression des matrices. Pendant l'impression, veillez à ce que l'humidité reste comprise entre 55 et 65 %. Portez une attention particulière à l'apparence des pré-taches sur les lames revêtues de poly-L-lysine.Après l'impression, inspectez visuellement chaque lame. Vérifiez l'alignement correct des points à l'intérieur des bordures en téflon, ce qui est essentiel, ainsi que le nombre correct de points imprimés. Pour favoriser l'homogénéisation de l'adhérence des points, placez immédiatement les lames imprimées dans une chambre à humidité à 100 %, côté imprimé vers le haut, dès qu'elles sont prêtes.Utilisez des serviettes en papier humides pour tapisser un récipient et un support de fortune. Enveloppez la chambre dans du plastique pour retenir l'humidité. Après une demi-heure, retirez les lames.Ensuite, numéroter les lames à l’aide d’un marqueur résistant aux solvants et les conserver dans une boîte de dessiccation pendant toute la nuit. Le jour suivant, préparer un stock frais de tampon de blocage en agitant vigoureusement. Ajuster le pH à 9,2 à l’aide d’hydroxyde de sodium concentré.Ensuite, incuber les lames dans le tampon pendant une heure. Pour éliminer le blocage, rincer les lames à l'eau doublement distillée. Puis, transférer les lames dans des porte-lames en verre et charger les porte-lames dans un support rotatif afin de sécher les lames par centrifugation à 10 G pendant cinq minutes.Une fois secs, si nécessaire, conserver les lames à moins 20 degrés Celsius dans des sacs en plastique scellés. En préparation, préparer une autre chambre d'humidification comme précédemment. Pour détecter les glycanes immobilisés, préparer les lectines biotinylées SNA et ECA à 10 microgrammes par millilitre dans du tampon de sondage, et ajouter deux microgrammes par millilitre de streptavidine 555 à chaque dilution.Pour la coloration avec les hémagglutinines, préparez une solution à 20 microgrammes par millilitre d'anticorps pré-complexe dans du tampon de blocage selon un rapport molaire de quatre pour deux pour un, comme décrit dans le protocole du texte. Transférez 20 microlitres des solutions préparées dans des puits d'une plaque de 384 puits. Ensuite, diluez sérialement les lectines et les hémagglutinines un-à-un dans leurs tampons respectifs.Préparez huit dilutions, en remplissant chaque puits avec 10 microlitres d'échantillon et 10 microlitres de tampon. Incubez ensuite la plaque sur de la glace pendant 30 minutes. Ajoutez ensuite huit microlitres de chaque dilution à l'un des 48 micropuits d'une lame imprimée.Ensuite, incuber la lame préparée dans la chambre d'humidification pendant 90 minutes. Après 90 minutes, laver la lame en la tenant par le bord : la plonger dans du PBS-T quatre fois, puis dans du PBS quatre fois, et enfin dans de l'eau déionisée quatre fois. À présent, sécher la lame par centrifugation comme précédemment.Après séchage par centrifugation, numérisez immédiatement la lame. Veillez à charger soigneusement la lame dans le scanner en respectant l'orientation correcte. Numérisez les lames de manière itérative en utilisant une faible puissance laser de cinq milliwatts, en augmentant progressivement le gain de 25 à 75 %. Lors de l'optimisation des paramètres de numérisation, gardez à l'esprit que les fluorophores s'éteindront avec des numérisations répétées.Analyser l'image enregistrée pour les signaux de liaison à l'aide du logiciel associé. Une liste de puces peut être chargée, contenant le motif de dépôt. Superposez-la au scan pour faciliter la navigation lors du positionnement des marqueurs de grille.Ensuite, utilisez le logiciel pour analyser les intensités des taches et enregistrez les résultats dans un fichier texte délimité par des tabulations afin de les exporter vers un tableur ou un autre logiciel statistique. Analysez les données en calculant l'intensité moyenne du signal moins le fond. Faites la moyenne de quatre des six taches répliquées pour chaque échantillon, en excluant le signal le plus élevé et le signal le plus faible.Ensuite, produisez un graphique linéaire représentant le signal moyen moyen moins le fond en fonction des huit concentrations protéiques. Lissez la courbe obtenue à l'aide d'une régression non linéaire. Le réseau PAA a été utilisé pour évaluer la spécificité de liaison des hémagglutinines du virus de la grippe A aux récepteurs.Le dispositif comprenait des témoins non sialylés dans les mêmes micropuits. Des lectines végétales aux spécificités connues pour les composés imprimés ont été utilisées comme témoins positifs. La lectine ECA s'est liée au galactose terminal bêta 1-4 lié à l'acétylglucosamine et ne s'est pas liée au même composé si le galactose terminal était bloqué par un acide sialique.Pour tester l'acide sialique lié en alpha 2-6, la lectine SNA a été utilisée. Comme prévu, la SNA s'est liée uniquement aux acides sialiques liés en alpha 2-6, mais avec des différences notables d'affinité entre les répétitions de lacNAc marquées par un colorant lié au PAA et celles non liées au PAA. Ensuite, une hémagglutinine H5 provenant d'un virus Vietnam/1203/04, qui ne reconnaît que les acides sialiques liés en alpha 2-3, a été testée.Le profil de liaison de l'hémagglutinine H5 a montré la spécificité attendue, avec une avidité plus élevée pour les structures liées au PAA. Enfin, l'hémagglutinine H1 provenant d'une souche saisonnière humaine H1N1 a été testée. Comme prévu, cette hémagglutinine ne s'est liée qu'aux structures contenant des acides sialiques liés par une liaison alpha 2-6.Une fois maîtrisée, cette technique permet de révéler les spécificités de liaison et les avidités relatives des virus de la grippe dans un seul et même test. Cette méthode améliorera considérablement l'efficacité des tests de liaison de la grippe tout en réduisant la consommation de réactifs biologiques précieux.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Une méthode simple fente blot a été développé pour la quantification de l'hémagglutinine de la grippe virale et la neuraminidase utilisant des anticorps ciblant universelle leurs séquences les plus conservées identifiées par l'analyse bioinformatique. Cette approche innovatrice pourrait fournir une alternative utile pour la détermination quantitative de tous hémagglutinine et la neuraminidase virale.

Analyses quantitatives de tous influenza de type A hémagglutinines virales et les neuraminidases utilisant des anticorps Universal en simples essais slot blot

Cette méthode décrit l'utilisation de système d'imagerie infrarouge à base de colorants pour la détection du virus H1N1 dans broncho-alvéolaire (LBA) des souris infectées avec une sensibilité élevée. Cette méthodologie peut être effectuée dans un 96 - ou 384 puits de plaque, il faut &lt;volume de 10 ul de matériel d'essai et a le potentiel pour le dépistage simultané de plusieurs agents pathogènes.

Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

Dans cette vidéo, nous démontrons le processus de détection des isotypes d’anticorps dans plusieurs échantillons de sérum humain à l’aide d’une lame de microréseau imprimée avec des sous-types antigéniques de souches de virus de la grippe.

Test de microréseau d’antigène viral pour détecter les isotypes d’anticorps dans le sérum contre l’antigène viral

La vidéo présente un test d’inhibition de l’hémagglutination pour détecter les anticorps sériques dirigés contre des antigènes spécifiques. La confirmation de l’inhibition de l’hémagglutination dans le puits d’essai et de l’hémagglutination dans le puits témoin est obtenue par des motifs visuels distincts. Ce test joue un rôle crucial dans l’évaluation de la réponse immunitaire, l’efficacité des vaccins et l’étude des infections virales en virologie et en immunologie.

Le test d’inhibition de l’hémagglutination pour détecter les anticorps sériques dirigés contre un antigène cible

La vidéo montre un test de quantification des virus grippaux A et B. Ce test utilise l’amplification des endonucléases par entaille avec des amorces spécifiques à la grippe et la détection de cibles à l’aide de sondes de balise moléculaire.

Un test moléculaire pour quantifier les virus de la grippe A et B

Cette vidéo présente un test mesurant les titres d’anticorps inhibiteurs de la neuraminidase grippale (NA) dans un échantillon de sérum. Un échantillon de sérum contenant des anticorps contre NA est ajouté à une plaque de micropuits recouverte de fétuine. Lors de l’ajout du virus, les anticorps empêchent le NA viral de fendre le fœtuin et d’exposer sa fraction galactose. Une lectine conjuguée à la peroxydase est ensuite ajoutée, qui se lie au galactose exposé. Le titre d’anticorps inhibiteurs...

Un test pour mesurer les titres d’anticorps d’inhibition de la neuraminidase de la grippe

Nous décrivons le dosage des lectines enzymatiques (ELLA) pour mesurer les titres d’anticorps inhibiteurs de la neuraminidase de la grippe (NA) dans les sérums. Le test utilise l’agglutinine d’arachide pour quantifier les résidus de galactose qui deviennent accessibles lorsque NA élimine l’acide sialique des plaques à 96 puits enrobées de fétuine.

Mesure de la grippe neuraminidase Inhibition Titres d&#39;anticorps par-enzymatique lectine Assay

Cette étude décrit un   à base d'imagerie-dosage micro-neutralisation pour analyser les relations antigéniques entre les virus. Le protocole utilise un scanner à plat et comporte quatre étapes, dont le titrage, titrage quantification, la neutralisation et la neutralisation quantification. Le test fonctionne bien avec un courant circulant de la grippe A (H1N1) pdm09, A (H3N2), et les virus B.

L&#39;optimisation d&#39;un micro-neutralisation quantitative de dosage

Les protocoles présentés décrivent comment effectuer un test d’inhibition hémagglutination afin de quantifier les titres d’anticorps spécifiques à la grippe d’échantillons de sérum des destinataires de vaccin contre la grippe. Le premier dosage détermine la concentration optimale d’antigène viral par hémagglutination. Le deuxième essai quantifie les titres d’anticorps spécifiques à la grippe par l’inhibition de l’hémagglutination.

Un test d’Inhibition (HI) hémagglutination optimisé pour quantifier les titres d’anticorps spécifiques à la grippe

Les auteurs décrivent une méthode pour mesurer l’activation des fonctions effectrices Fc-médiée par les anticorps qui ciblent l’hémagglutinine du virus influenza. Ce test peut également être adapté afin d’évaluer la capacité des anticorps monoclonaux ou polyclonaux sérums ciblant d’autres glycoprotéines de surface virales à provoquer l’immunité induite par le Fc.

Une méthode pour évaluer les fonctions effectrices induite par le Fc induites par les anticorps spécifiques d’hémagglutinine de grippe

Nous présentons un protocole pour l'utilisation d'un microarray protéique construit en imprimant des antigènes grippaux sur des lames enduites de nitrocellulose pour sonder simultanément le sérum pour plusieurs isotypes d'anticorps contre plus de 250 antigènes de différentes souches virales, permettant de mesurer l'étendue des anticorps sériques entre les sous-types de virus.

Utilisation d'un microréseau d'antigène de la grippe pour mesurer l'étendue des anticorps sériques à travers les sous-types de virus

Découvrez une méthode de microarray glycanique miniaturisé pour analyser l'avidité et la spécificité des hémagglutinines du virus influenza A. Cette technique permet d'évaluer simultanément la liaison réceptrice et l'avidité dans un seul essai.

A miniaturisé Glycan Microarray Assay pour l'évaluation Avidité et Spécificité du virus grippal A Hémagglutinines

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