Analyse fonctionnelle complémentation (FCA): Un exercice de laboratoire conçu et mis en complétant l'enseignement des voies biochimiques

L’objectif général de l’essai de complémentation fonctionnelle est d’élucider l’activité d’une enzyme en introduisant une copie fonctionnelle du gène correspondant dans une cellule mutante pour voir si elle restaure un phénotype de type sauvage dans le fond mutant. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans une variété de domaines, tels que la biochimie, la microbiologie, la génétique, la biologie végétale, l’évolution, etc. Le principal avantage de cette technique est qu’elle évalue la fonction, l’activité et/ou le rôle d’une enzyme, dans des conditions in vivo, qui sont normalement de nature physiologique, par opposition aux conditions in vitro, qui sont normalement de nature artificielle.

Les implications de cette technique s’étendent à l’identification et/ou à l’élucidation de la fonction des enzymes non caractérisées, et de celles qui ont encore des fonctions présumées ou prédites. La démonstration de ce processus de complémentation fonctionnelle est assurée par Taylor Harkness, étudiant en biotechnologie et biosciences moléculaires, dans mon laboratoire. Après le clonage des gènes DapL, TarB, MurE et RSH selon le protocole de texte, inoculez 50 millilitres de milieu liquide avec une seule colonie de cellules bactériennes mutantes à transformer avec un gène d’intérêt et à cultiver pendant la nuit.

Le deuxième jour, utilisez la culture de nuit de 50 millilitres pour inoculer 1 litre du milieu approprié et cultivez à 30 degrés Celsius pour la phase de verrouillage, ou à une OD600 de 0,4 à 0,6. Récoltez les cellules par centrifugation à 5 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, décantez le surnageant et utilisez 500 millilitres d’eau distillée stérile et glacée pour remettre la pastille en suspension.

Centrifugez à nouveau les cellules et, après avoir décanté le surnageant, utilisez 250 millilitres de glycérol stérile et glacé à 10 % pour remettre la pastille en suspension. Après avoir fait tourner les cellules une dernière fois, utilisez deux millilitres de glycérol à 10 % pour remettre les cellules en suspension. Transférez 50 aliquotes de microlitres dans des tubes de microcentrifugation et congelez immédiatement en plaçant les tubes dans un bain d’éthanol à la glace sèche.

Stockez les cellules à moins 80 degrés Celsius pour l’électroporation. Pour effectuer l’électroporation, ajoutez 1 microlitre de plasmide recombinant à une aliquote de 50 microlitres de cellules compétentes et placez sur de la glace pendant cinq minutes. Transférez les cellules dans une cuvette d’électroporation et réglez l’appareil d’électroporation sur les paramètres suivants : capacité de 25 degrés Fahrenheit, 2,5 kilovolts et résistance de 200 ohms.

Ensuite, avec la cuvette dans l’appareil, délivrez une impulsion. Ajoutez 1 millilitre de milieu de récupération dans la cuvette et transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres. Laissez les cellules se rétablir en incubant la culture dans un incubateur à agitation avec une rotation douce pendant 60 minutes à la température appropriée requise par le mutant.

Pour sélectionner les transformants, pipetez 100 microlitres de la culture sur un milieu avec des plaques de gélose et utilisez un épandeur stérile pour étaler la solution. Ensuite, incubez toute la nuit à la température appropriée. Pour plus de détails, reportez-vous au protocole textuel.

Pour effectuer une analyse de complémentation, transformez AOH1 avec le vecteur vide pBAD33 ou avec des vecteurs d’expression dapL en utilisant l’électroporation, comme nous venons de le démontrer. Déposer le mélange de transformation sur un milieu gélosé LB, complété par 50 microgrammes par millilitre de Dap, 34 microgrammes par millilitre de chloramphénicol et 50 microgrammes par millilitre de kanamycine. Incuber les plaques à 30 degrés Celsius pendant 24 heures avant d’observer les résultats.

Avec le vecteur vide pBAD33 ou avec le vecteur exprimant murE, transformez le mutant TKL-11 en utilisant l’électroporation comme démontré précédemment dans cette vidéo. Placez les transformants sur de l’agar-gélose LB, complété par 50 microgrammes par millilitre de thiamine et 34 microgrammes par millilitre de chloramphénicol, et incubez les plaques à 30 degrés Celsius pendant 24 heures avant de vérifier la présence de transformants. Tester la complémentation par stries ou ensemencement des colonies à partir des transformations témoins et expérimentales sur deux plaques de milieu LB, plus 0,2 % d’arabinose et 50 microgrammes par millilitre de thiamine.

Incuber une plaque à 30 degrés Celsius et l’autre à 42 degrés Celsius pendant 24 heures avant d’évaluer le phénotype de croissance. Transformez la souche mutante Hx699 et la souche sauvage Rr217 de l’espèce novosphingobium avec le vecteur vide pRK290, ou un vecteur contenant le gène natif rshNsp en deux événements de transformation distincts chacun, comme démontré précédemment dans cette vidéo. Déposer les transformants sur du dextrose de pomme de terre ou de la gélose complétée par 10 microgrammes par millilitre de tétracycline et incuber pendant au moins 72 heures, ou jusqu’à ce que les transformants apparaissent.

Ensuite, striez les transformants en X sur des plaques de gélose fraîches avec de la tétracycline. Après une incubation à 30 degrés Celsius pendant au moins quatre jours, examinez visuellement le phénotype de croissance des deux plaques. Le double mutant AOH1 d’E. coli présente une mutation du gène DapE et une délétion du gène DapD, et ne se développera pas à moins que Dap ne soit fourni.

Comme on le voit ici, le mutant AOH1 exprimant les DapLs est capable de se développer sur un milieu exempt de LLDap en convertissant THDP en LLDap dans la voie de la lyse Dap. L’enzyme MurE facilite l’ajout de m-DAP dans le peptidoglycane des bactéries à Gram négatif. Le mutant E.coli MurE, TKL-11, ne peut pas se développer à 42 degrés Celsius.

Dans cette expérience, seules les cellules TKL-11 transformées avec MurE croissent à 42 degrés Celsius. Une mutation dans le gène TyrB empêche la synthèse de la tyrosine et de la phénylalanine. Cependant, comme le montre ici, lorsque la souche DL39 mutante TyrB exprime le gène A.thaliana At5g36160, elle se développe sur un milieu M9, dépourvu de tyrosine et de phénylalanine, démontrant que l’enzyme peut synthétiser la tyrosine.

Le mutant Hx699 de l’espèce novosphingobium héberge une protéine RSH non fonctionnelle et produit un phénotype hypomucoïdal. Cependant, la transformation avec le gène RSH natif produit des polysaccharides extracellulaires plus solubles dans la traînée X multicellulaire qui est hypermucoïdale. En revanche, lorsque le mutant Hx699 est transformé avec un vecteur vide, il produit un phénotype hypomucoïdal.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 24 à 48 heures environ. S’il est effectué correctement, en fonction de la croissance de l’organisme modèle utilisé, à l’exclusion du clonage, de la compétence des étapes de préparation et de transformation. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler les exigences de condition de croissance des mutants utilisés dans l’analyse de complémentation fonctionnelle.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que les caractérisations axiomatiques in vitro traditionnelles, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la spécificité du substrat, la température et le pH optimal, les vitesses somatiques, etc. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie et de nombreux domaines de subdivision, tels que la microbiologie, pour élucider la fonction, ou le rôle, in vivo des enzymes d’une variété d’organismes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de fabriquer des cellules bactériennes électrocompétentes, de la transformation des bactéries à l’aide de l’électroporation et de l’évaluation de la fonction des gènes/enzymes à l’aide de la complémentation fonctionnelle.

N’oubliez pas que travailler avec des organismes pathogènes peut être extrêmement dangereux et que les précautions nécessaires doivent être prises.